肿瘤坏死因子α致暴发性肝功能衰竭小鼠肠上皮细胞凋亡的作用

目的研究肿瘤坏死因子α(TNFα)对暴发性肝功能衰竭(FHF)小鼠肠黏膜上皮细胞凋亡的作用。方法用D-氨基半乳糖(GalN) 脂多糖(LPS)或TNFα造FHF小鼠模型;酶联免疫吸附法测定血清TNFα含量;光学显微镜和电子显微镜观察肠组织;末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测肠组织细胞凋亡情况;免疫组织化学法检测肿瘤坏死因子受体I(TNFRⅠ)蛋白在肠组织的表达与分布。结果实验各组动物各时间点光学显微镜下肠黏膜上皮细胞结构均保持完整,电镜下可见肝功能衰竭组有典型的凋亡细胞;对照组、LPS组、GalN组血清TNFα水平几乎正常,凋亡率低且基本没有TNFRⅠ蛋白表达;GalN LPS组血清TNFα水平12h明显升高(P<0.01),且TNFRⅠ蛋白在6h(大肠:2.82e 4±4.60e 3;小肠:1.14e 4±2.13e 3)即有表达,此时肠上皮细胞凋亡不明显,9h和12hTNFRⅠ蛋白表达明显增加,同时肠上皮细胞凋亡也明显。用GalN TNFα造FHF模型,结果也与GalN LPS组类似。应用抗TNFα抗体,可降低TNFRⅠ蛋白表达和减少肠上皮细胞凋亡的发生。结论TNFα能诱导肝功能衰竭小鼠肠上皮细胞凋亡,抗TNFα抗体能阻断这一作用;在FHF的模型动物中,TNFRⅠ蛋白表达增多,TNFRⅠ蛋白表达与肠上皮细胞凋亡在一定程度上呈正相关。     

肿瘤坏死因子受体l在暴发性肝衰竭肠黏膜屏障功能损害中的作用

肠黏膜屏障对于抵抗肠道病原微生物的侵入具有重要作用。暴发性肝衰竭（FHF）时肠黏膜屏障的通透性增加^[1-4]，细菌及其毒性产物穿透肠壁进人体内，引起自发性腹膜炎甚至败血症。FHF时肠黏膜屏障通透性的增加与肠上皮细胞紧密连接的破坏有关。我们的前期研究发现，在FHF时，肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin表达下降，     

肿瘤坏死因子受体1在暴发性肝衰竭肠黏膜屏障功能损害中的作用

肠黏膜屏障对于抵抗肠道病原微生物的侵入具有重要作用。暴发性肝衰竭(FHF)时肠黏膜屏障的通透性增加,细菌及其毒性产物穿透肠壁进入体内,引起自发性腹膜炎甚至败血症。FHF时肠黏膜屏障通透性的增加与肠上皮细胞紧密连接的破坏有关。我们的前期研究发现,在FHF时,肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin表达下降,并且这一改变与TNFα有关,本研究进一步研究了TNFα这一作用的受体机制。     

TNF-α对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用

目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肠上皮细胞紧密连接蛋白claudin-1定位和表达的影响,探讨TNF-α增加肠上皮细胞屏障通透性的作用机制.方法Caco-2细胞(20-30代)应用含有2 mmol/L谷氨酰胺、20%胎牛血清的DMEM培养液培养7d,细胞生长达到融合后加入不同浓度的TNF-α(0,10,100 μg/L)继续培养24h,提取细胞蛋白制备NP-40可溶性及不溶性蛋白框架,Western blot检测磷酸化和非磷酸化的claudin-1蛋白含量,并应用间接免疫荧光法检测claudin-1的定位.实时定量PCR技术检测claudin-1 mRNA的表达.结果免疫荧光染色可见对照组claudin-l沿细胞膜分布,呈蜂巢状线性荧光,10μg/L TNF-α引起claudin-1荧光信号减弱,并呈锯齿状异常分布;Western blot分析显示claudin-1蛋白有两种表达形式,一种为20 kDa(非磷酸化claudin-1),主要存在于NP-40可溶性蛋白样品中;另一种为25 kDa(磷酸化claudin-1),只存在于NP-40不溶性蛋白样品中.TNF-α不影响20kDa claudin-1蛋白的表达,但可使25 kDaclaudin-1蛋白表达下降且具有浓度依赖性(10,100 μg/L0.31±0.02,0.24±0.05 vs 0.43±0.09P＞0.05,P＜0.05);实时定量PCR结果显示不同浓度的TNF-α(10,100μg/L)作用24 h或100 μg/LTNF-μ作用不同时间(4,8和24 h)与正常对照组相比均不能引起claudin-1 mRNA的改变.结论TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白claudin-1 mRNA的表达没有影响,但可以引起有功能的磷酸化claudin-1蛋白表达减少.     

TNF-α对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用

目的:研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对肠上皮细胞紧密连接蛋白claudin-1定位和表达的影响,探讨TNF-α增加肠上皮细胞屏障通透性的作用机制.方法:Caco-2细胞(20-30代)应用含有2 mmol/ L谷氨酰胺、20%胎牛血清的DMEM培养液培养7d,细胞生长达到融合后加入不同浓度的TNF-α(0,10,100μg/L)继续培养24h,提取细胞蛋白制备NP-40可溶性及不溶性蛋白框架,Western blot检测磷酸化和非磷酸化的claudin-1蛋白含量,并应用间接免疫荧光法检测claudin-1的定位,实时定量PCR技术检测claudin-1 mRNA的表达.结果:免疫荧光染色可见对照组claudin-1沿细胞膜分布,呈蜂巢状线性荧光,10μg/L TNF-α引起claudin-1荧光信号减弱,并呈锯齿状异常分布;Western blot分析显示claudin-1蛋白有两种表达形式,一种为20 kDa(非磷酸化claudin-1),主要存在于NP-40可溶性蛋白样品中;另一种为25 kDa(磷酸化claudin-1),只存在于NP-40不溶性蛋白样品中.TNF-α不影响20 kDa claudin-1蛋白的表达,但可使25 kDa claudin-1蛋白表达下降且具有浓度依赖性(10,100μg/L:0.31±0.02.0.24±0.05 vs 0.43±0.09 P>0.05,P<0.05);实时定量PCR结果显示不同浓度的TNF-α(10,100μg/L)作用24h或100μg/L TNF-α作用不同时间(4,8和24h)与正常对照组相比均不能引起claudin-1 mRNA的改变.结论:TNF-α对Caco-2细胞紧密连接蛋白claudin-1 mRNA的表达没有影响,但可以引起有功能的磷酸化claudin-1蛋白表达减少.     

肿瘤坏死因子受体相关因子2基因缺失小鼠引起暴发性肝功能衰竭及其机制

目的 探讨TNF受体相关因子基因缺失导致肝功能衰竭的可能性及其可能原因。方法 实验鼠分为TNF受体相关因子2（TRAF2）基因缺陷鼠TRAF2^lox／lox／Cre^＋组、对照鼠TRAF2^lox／lox／Cre^-组、敲除TNF基因的TRAF2基因缺陷鼠TRAF2^lox／lox／Cre^＋／TNF^-／-组和对照鼠TRAF2^lox／lox／Cre^-／TNF^-／-组，用PolyI：PolyC诱导敲除TRAF2基因，动态观察血清ALT的变化，观察肝组织病理学改变。胶原酶分离肝细胞，流式细胞术（FACS）检测Fas和CD40的表达，肝细胞加TNF培养后计算存活肝细胞的比率。结果 TRAF2^lox／lox／Cre^＋组鼠于注药后第2天ALT开始升高，第4天达高峰，为（234．80±12．34）U／L，TRAF2^lox／lox／Cre^＋／TNF^-／-组鼠ALT亦有升高，为（90．30±15．63）U／L，但病理组织学显示前者有明显的肝细胞坏死和炎性细胞浸润。培养的TRAF2^lox／lox／Cre^＋／TNF^-／-组鼠肝细胞在加入TNF后存活细胞明显低于对照鼠TRAF2^lox／lox／Cre^-／TNF^-／-组，且前者Fas表达高于后者，而CD40表达低于后者。结论 TRAF2基因的缺失可导致肝细胞坏死，从而引起暴发性肝功能衰竭。     

肿瘤坏死因子在暴发性肝衰竭中的意义

肿瘤坏死因子在暴发性肝衰竭中的意义袁良平，顾长海，王宇明肿瘤坏死因子（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ，ＴＮＦ）是一种主要由单核巨噬细胞产生的细胞因子，可由多种刺激物质如内毒素、免疫复合物、病毒等诱导产生。诱生的ＴＮＦ有双重作用，适量时具有抗病...     

暴发性肝衰竭时肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin表达下降

目的:研究暴发性肝衰竭小鼠大肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin表达的变化.方法:BALB/c小鼠150只随机分为生理盐水对照组(n=30)、内毒素(LPS)对照组(n=30)、D-氨基半乳糖(D-GalN)对照组(n=30)和暴发性肝衰竭(LPS GalN)组(n=60).采用D-GalN和LPS联合ip制备暴发性肝衰竭小鼠动物模型.应用免疫组织化学技术、Westernblot及实时定量PCR检测暴发性肝衰竭进程中,小鼠大肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin的定位、表达及mRNA的变化.结果:occludin蛋白主要沿小鼠大肠黏膜上皮细胞膜的顶端呈线状分布,在暴发性肝衰竭组小鼠,6h时occludin的阳性染色开始减少,9h时更为明显.Westernblot结果与免疫组织化学结果相一致,6h时开始下降(0.48±0.07),9h达到最低值(0.36±0.05),与生理盐水对照组(0.71±0.09)相比差异显著(P<0.05).实时定量PCR结果显示,暴发性肝衰竭小鼠2h时occludinmRNA即开始下降(0.85±0.12),6h时达到最低值(0.72±0.04),与生理盐水对照组(1.00±0.05)相比有明显差异(P<0.05),9h时有所恢复(0.93±0.10).结论:在暴发性肝衰竭过程中,大肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin表达下降,其mRNA也呈下调趋势.     

前列腺素E1,促肝细胞生长刺激因子对暴发性肝衰竭小鼠模型的保护作用

通过建立以Ｄ－氨基半乳糖（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，Ｄ－ｇａｌｎ６００ｍｇ／ｋｇ）致敏，以内毒素（ｌｉ－ｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ５μｇ／ｋｇ）诱发的小鼠暴发性肝衰竭模型。研究了该模型血清肿瘤坏死因子（ｓｅｒｕｍｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ，ｓＴＮＦ）活性的动态变化，发现ｓＴＮＦ与肝坏死程度密切相关。在此基础上研究了前列腺素Ｅ１（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ１，ＰＧＥ１）和促肝细胞生长刺激因子（ｈｅｐａｔｉｃｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ＨＳＳ）对该动物模型的影响，结果证实ＰＧＥ１、ＨＳＳ对Ｄ－Ｇａｌｎ／ＬＰＳ诱发的小鼠暴发性肝衰竭具有保护作用，使其２４小时死亡率（６４．７８％）明显降低（３６．３５％，Ｐ＜０．０５；３１．２７％，Ｐ＜０．００１），并且明显抑制急性期ＴＮＦ的产生：ＰＧＥ１、ＨＳＳ于注射后１．５～２小时、２４小时ｓＴＮＦ活性皆明显低于对照组，表明ＰＧＥ１、ＨＳＳ对暴发性肝衰竭小鼠模型中ｓＴＮＦ活性的抑制作用是保护肝细胞的重要机制。     

肿瘤坏死因子α及caspase-3表达与暴发性肝衰竭细胞凋亡

目的　研究肿瘤坏死因子α(TNFα)与caspase 3表达在实验性暴发性肝衰竭 (FHF)中对肝细胞凋亡的作用。方法　用脂多糖和D 氨基半乳糖制备FHF小鼠模型 ;ELISA和逆转录PCR法检测血清TNFα水平及肝组织TNFαmRNA表达 ;原位杂交法检测肝组织内caspase 3表达 ;DNA琼脂糖凝胶电泳和末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TUNEL)检测肝细胞凋亡。结果　用药后 2h开始 ,TNFαmRNA表达增加 ( 0 91± 0 75 ,正常值 0 32± 0 10 ) ,血清TNFα水平升高 [( 32 0 5 0± 86 5 7)ng/L ,正常值 ( 16 6 6± 7 0 1)ng/L],caspase 3少量表达 ;8h后 ,血清ALT和总胆红素 (TBil)水平显著增加 [分别为 ( 5 6 0 6 6± 6 0 2 0 )U/L和 ( 16 3 6 6± 34 5 1) μmol/L ,正常值为 ( 2 3 5 6± 8 0 3)U/L和 ( 14 90± 4 80 ) μmol/L],caspase 3表达至最高峰 ,并出现典型的肝细胞凋亡改变 ;12h后 ,血清ALT和TBil水平达最高峰 ,caspase 3表达较 8h减少 ,肝细胞坏死和凋亡同时存在。抗TNFα单抗阻断试验后 ,肝细胞凋亡和坏死明显减轻 ,TUNEL和caspase 3表达显著减少。 结论　TNFα有促进肝细胞凋亡与坏死作用 ,肝细胞凋亡与caspase 3的激活有关 ,在时间上肝细胞凋亡先于坏死。     

Tumor necrosis factor alpha increases intestinal permeability in mice with fulminant hepatic failure

AIM:To determine the effect of tumor necrosis factor alpha(TNF-α) on intestinal permeability(IP) in mice with fulminant hepatic failure(FHF),and the expression of tight junction proteins.METHODS:We selected D-lactate as an index of IP,induced FHF using D-galactosamine/lipopolysaccharide and D-galactosamine/TNF-α,assessed the results using an enzymatic-spectrophotometric method,transmission electron microscopy,immunohistochemistry,Western blotting and real-time quantitative polymerase chain reaction.The effect of the administration of antiTNF-α immunoglobulin G(IgG) antibody,before the administration of D-galactosamine/lipopolysaccharide,on TNF-α was also assessed.RESULTS:IP was significantly increased in the mouse model of FHF 6 h after injection(13.57 ± 1.70 mg/L,13.02 ± 1.97 mg/L vs 3.76 ± 0.67 mg/L,P = 0.001).Electron microscopic analysis revealed tight junction(TJ) disruptions,epithelial cell swelling,and atrophy of intestinal villi.Expression of occludin and claudin-1 mRNA was significantly decreased in both FHF models(occludin:0.57 ± 0.159 fold vs baseline,P = 0.000;claudin-1:0.3067 ± 0.1291 fold vs baseline,P = 0.003),as were the distribution density of proteins in the intestinal mucosa and the levels of occludin and claudin-1 protein(occludin:0.61 ± 0.0473 fold vs baseline,P = 0.000;claudin-1:0.6633 ± 0.0328 fold vs baseline,P = 0.000).Prophylactic treatment with antiTNF-α IgG antibody prevented changes in IP(4.50 ± 0.97 mg/L vs 3.76 ± 0.67 mg/L,P = 0.791),intestinal tissue ultrastructure,and the mRNA levels of occludin and claudin-1 expression(occludin:0.8865 ± 0.0274 fold vs baseline,P = 0.505;claudin-1:0.85 ± 0.1437 fold vs baseline,P = 0.1),and in the protein levels(occludin:0.9467 ± 0.0285 fold vs baseline,P 0.05;claudin-1:0.9533 ± 0.0186 fold vs baseline,P = 0.148).CONCLUSION:Increased in IP stemmed from the downregulation of the TJ proteins occludin and claudin-1,and destruction of the TJ in the colon,which were induced by TNF-α in FHF mice.     

Pim-3对暴发性肝功能衰竭大鼠的肝组织修复效应及机制分析

目的 探讨Pim-3基因对暴发性肝功能衰竭(FHF)大鼠的肝组织修复效应.方法 将32只大鼠分为4组,健康对照组和3组处理组,每组8只.3组处理组分别以林格液、空载质粒(pEGFP-N2)和重组质粒(pEGFP-N2/Pim-3)溶液预处理大鼠,1 d后予脂多糖(LPS)/D-半乳糖胺(D-GalN)腹腔注射诱导FHF.8 h后或濒死期处死大鼠,采集血清和肝组织标本,检测血清转氨酶水平,RT-PCR和ELISA分别检测TNF-α和IL-1β基因表达及其血中浓度,原位末端凋亡(TUNEL)分析评估肝细胞凋亡水平,检测肝组织损伤程度.组间比较采用方差分析.结果 重组质粒注射能诱导目的 基因Pim-3和报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在肝内高表达;与其他处理组相比,重组质粒组大鼠的生存率显著提高,血清转氨酶水平明显降低,且肝组织内出血坏死和炎性细胞浸润程度也明显减轻;重组质粒组肝凋亡指数为(10.2±6.9)%,显著低于林格液组的(83.1±12.6)%和空载质粒组的(79.9±13.4)%(P＜0.01);外源Pim-3基因的应用显著降低了肝组织内TNF-α和IL-1β mRNA的表达,以及血清TNF-α和IL-1β蛋白的分泌水平.结论 Pim-3基因有助于保护大鼠免于LPS/D-GalN诱导暴发性FHF的发生,其机制可能是抑制肝内炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的表达和分泌.     

慢性心力衰竭患者血清瘦素与肿瘤坏死因子α浓度变化

目的 :通过分析慢性心力衰竭 (HF)恶病质患者血清瘦素 (leptin)及肿瘤坏死因子α(TNF α)的浓度变化 ,探讨其在心源性恶病质发病过程中的可能作用及临床意义。方法 :测定 4 8例慢性HF患者和 2 0例健康对照者的体重指数 (BMI)、腰臀比 (WHR)、皮下脂肪厚度 (TSF)、左室射血分数 (LVEF)、leptin及TNF α等指标。leptin及TNF α用放射免疫法测定 ,并分析leptin与其他参数的相关性。结果 :①全部受试者的血清leptin浓度与BMI、TSF、TNF α呈显著正相关 (P <0 .0 5 ) ,与WHR及LVEF无显著相关性。而恶病质组的血清leptin浓度还与TNF α呈显著相关关系 (P <0 .0 5 )。②恶病质组与非恶病质组相比 ,BMI、leptin及TSF差异有显著性意义 ,均P <0 .0 1。结论 :leptin作为调节能量平衡的重要激素 ,可能与TNF α共同作用导致心源性恶病质的发生     

NO体外对肠上皮细胞表达紧密连接蛋白Occludin的影响

目的:探讨一氧化氮(NO)对肠上皮细胞表达紧密连接蛋白Occludin的影响,以研究NO对肠黏膜屏障的作用机制.方法:将NO的供体Sin1与肠上皮细胞株Caco-2共培养24 h,采用MTT方法观察NO对肠上皮细胞的作用,并分别提取细胞蛋白和总RNA,采用免疫蛋白印迹(Westem blot)蛋白半定量方法和实时定量聚合酶链式反应(RO-PCR)方法检测不同NO浓度对Caco-2细胞表达紧密连接蛋白Occludin蛋白和mRNA表达的影响.结果:随着Sin1浓度升高(125,250,500和1000μmol/L)NO对细胞的杀伤作用产生并逐渐增大,Occludin蛋白表达量和mRNA的相对表达量与无Sin1刺激时蛋白及mRNA的表达量相比明显降低(蛋白:375±0.5,374±0.8,363±0.3.363±0.7 vs 398±0.7;mRNA:0.689±0.01,0.578±0.09,0.554±0.03,0.619±0.04 vs 1,均P<0.01).结论:NO可直接损伤肠上皮细胞,同时以剂量依赖形式在蛋白和分子水平影响紧密连接蛋白Occludin的表达.     

低蛋氨酸饮食对实验性结肠炎大鼠紧密连接蛋白表达和功能的影响

目的 研究低蛋氨酸(methionine restriction,MetR)饮食对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的大鼠结肠炎的结肠黏膜病理组织学、肠黏膜通透性以及结肠上皮紧密连接蛋白表达的影响,并探讨其可能机制.方法 SD大鼠随机分为常规饮食正常组(AA组)、低蛋氨酸饮食正常组(MetR组)、常规饮食模型组(DSS+ AA组)、低蛋氨酸饮食模型组(DSS+ MetR组),每组15只.DSS建模后第21天腹主动脉采血,分析血常规、肝肾功能和电解质水平,取结肠组织行HE染色分析肠黏膜病理学变化,检测肠组织髓过氧化物酶(MPO)活性,免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)分析肠上皮细胞的增殖状况,采用尤斯灌流室(Ussing chamber)检测肠黏膜通透性;采用蛋白质印迹法分析肠上皮紧密连接蛋白的表达.结果 结肠炎造模大鼠出现腹泻、便血、体重下降,炎症集中在远端结肠,表现为隐窝脓肿,炎性细胞的浸润.与DSS+ AA组比较,MetR饮食干预可显著降低模型大鼠结肠的组织病理学评分[(10.55 ±3.62)分比(15.00±4.89)分,P=0.003].DSS+ MetR组和DSS+ AA组大鼠血白细胞计数、肠组织MPO活性以及PCNA免疫组化结果的差异均无统计学意义.Ussing chamber检测显示,DSS+ AA组的跨膜电阻抗显著低于AA组[(28.40±6.78)Ω·cm2比(46.53 ±4.03)Ω·cm2,P＜0.05],MetR组显著高于AA组[(60.64 ±8.40)Ω·cm2比(46.53 ±4.03)Ω·cm2,P＜0.05],DSS+ MetR组的短路电流值显著高于DSS+ AA组[(35.01 ±2.19) μA/cm2比(29.61±1.19)μA/cm2,P＜0.05].蛋白质印迹结果显示,AA组和MetR组未见claudin2蛋白表达,MetR组的结肠上皮claudin3蛋白表达量明显高于AA组;与DSS+ AA组比较,DSS+ MetR组claudin2的表达量更高,claudin3表达量更高.结论 MetR饮食对DSS诱导的结肠炎模型大鼠有明显的治疗作用,其机制可能不是通过调节炎性细胞浸润以及促进肠细胞生长的途径来缓解炎症损伤,而可能是通过改变紧密连接蛋白结构和功能而改善其肠黏膜屏障的功能,促进受损肠黏膜的修复.