重组腺辅助病毒载体的制备、纯化及其介导的基因转移

目的 :探讨一种制备、纯化重组腺辅助病毒 (r AAV)载体的有效方法。方法 :以质粒 PDG和含有人 apo AIc DNA的AAV载体共转染 2 93T细胞 ,继以 Iodixanol密度梯度离心结合肝素亲和层析法分离、纯化 ,斑点杂交鉴定 r AAV病毒颗粒数 ;并以含人 apo AIc DNA的 r AAV感染 C2 C12细胞。结果 :r AAV颗粒数为 7× 10 1 0 / ml;r AAV成功介导了人 apo AIc DNA在 C2 C12细胞中的表达并持续了 30天 ,在分化为肌管细胞后仍有此表达能力。结论 :本实验采取的制备、纯化 r AAV的方法简便、高效 ,r AAV成功介导 apo AI基因在肌源性细胞 C2 C12中的表达。     

非病毒载体基因转移技术的现状和展望

目前基因治疗已经成为科学家治疗多种难治性疾病的一种新手段，基因导人技术是基因治疗的核心也是最基本的技术。目前研究较多的基因导人技术共分为两大类：一，病毒载体基因导人法；二，非病毒载体基因导人法。前者转染效率高，但存在安全性和免疫原性等问题。因此，近年来人们对非病毒类载体系统给予了更多的关注。     

小鼠BTLA基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建小鼠B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因重组慢病毒载体,探讨BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞增殖及活化的影响。方法:以小鼠脾脏组织总RNA为模板,逆转录为c DNA,通过PCR技术扩增BTLA基因,构建p WPTS-m BTLA慢病毒载体,磷酸钙法感染人胚肾上皮细胞株293T细胞。RT-PCR及Western blot法检测BTLA m RNA和BTLA蛋白表达,50%组织培养感梁剂量(TCID50)法检测重组慢病毒滴度。通过感染p WPTS-m BTLA及p WPTS-GFP慢病毒载体的293T细胞与小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养,初步研究BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞活化与增殖的影响。结果:成功构建小鼠p WPTS-m BTLA慢病毒载体,并制备高滴度病毒颗粒(1.3×108pfu/ml)。通过对比实验组与对照组小鼠脾T淋巴细胞的增殖结果 ,发现4 d及8 d T细胞的增殖效应均明显受抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),且这种抑制作用在0~8 d内具有时间依赖性。结论:过表达BTLA基因的293T细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养后对其增殖及活化有抑制作用,提示成功构建具有生物学效应的小鼠BTLA基因重组慢病毒载体。     

Ⅰ型人类免疫缺陷病毒tat基因重组慢病毒表达载体的构建

目的构建人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)tat基因重组慢病毒表达载体。方法将pCDH-GFP和pCDHRFP载体分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切制备线性化载体;通过设计引物及PCR扩增,获得5′端与3′端分别与15nt线性化载体3′端与5′端互补的tat基因片段;tat基因片段和线性化载体经纯化后,进行重组反应;将重组产物转化感受态细胞DH5α,通过菌落PCR、质粒双酶切、序列测定等方法鉴定重组克隆。结果菌落PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,在约354bp位置出现预期的条带;EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒经琼脂糖凝胶电泳,在约7544bp和354bp位置上出现预期条带;通过测序,重组质粒中插入的tat基因序列与GenBank基因库中的HIV-1tat基因序列同源。结论采用本研究方法能成功构建HIV-1tat基因重组慢病毒表达载体。     

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建

目的：构建含绿色荧光蛋白（GFP）基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体。方法：将人疱疹病毒8型（HHV－8）K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点，构建重组质粒pCR-K12；PCR扩增GFP基因，将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中，获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果：重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果，此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论：重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功，为研究K12的生物学活性及春作用机制打下基础。     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.     

重组逆转录病毒载体介导基因转移的现状及思考

目的在将目的基因导入靶细胞实现基因治疗的过程中，载体起着关键作用。令人遗憾的是至今仍未能。建立一种兼顾安全与高效的载体系统，即使研究应用最广的逆转录病毒载体也不例外，利用重组逆转录病毒介导基因转移弥补及克服传统载体的缺陷，实现安全而高效的基因治疗势在必行。     

以非复制型HIV为载体进行目的基因转移的实验研究

目的 探讨非复制型HIV作为基因转移载体的有效性。为卵巢癌基因治疗转移方法提供新思路。方法 磷酸钙沉淀法将非复制型HIV基因转移载体（pHR′CS）系统中的3种成分质粒共转染人病毒包装细胞293T,荧光显微镜、电镜、荧光分光光度计检测病毒产生情况。病毒上清过滤,浓缩后感染卵巢癌细胞SKOV3和正常人成纤维细胞GF,荧光显微镜下观察感染效果。PCR、RT-PCR鉴定目的基因HSV-tk在靶细胞中的整合转录结果。光镜观察及MTT法测定GCV的体外杀伤效应,计算细胞生长抑制率（GIR）和半数抑制浓度（IC50）。结果 荧光显微镜下观察到293T细胞中有大量GFP表达,透射电镜下观察到大量浓缩后病毒颗粒,荧光分光光度计检测到510nm处有一高吸收峰,此非复制型HIV感染卵巢癌细胞SKOV3和正常人成纤维细胞GF后,PCR、RT-PCR均显示600bp的HSV-tk阳性条带。光镜观察到细胞在GCV作用后出现明显形态变化;MTT法显示GCV对转导HSV-tk的SKOV3和GF细胞有显著杀伤作用。结论 非复制型HIV可将目的基因高效转移至卵巢癌细胞中,为一种有效的基因转移载体。     

抑癌基因p16^INK4真核表达转移载体的构建

目的　构建可应用于昆虫杆状病毒表达系统的含抑癌基因p16 INK4cDNA的重组转移载体。方法　采用定向克隆方法将抑癌基因p16 INK4cDNA全长插入转移载体质粒pSXIVVI X3,并经斑点杂交 ,PCR及酶切鉴定重组质粒。结果　经三种鉴定方法证实p16 INK4cDNA片段成功地插入转移载体pSXIVVI X3。结论　重组质粒pSXIVVI X3 p16构建成功 ,为真核表达抑癌基因p16 INK4奠定了基础。     

纳米粒子作为基因载体在不同动物模型上的基因转染效果

目的验证包载反义单核细胞趋化蛋白-1(A-MCP-1)质粒的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒子在不同动物模型上的基因转染效果。方法采用乳化溶剂挥发法制备A-MCP-1纳米粒子并进行体外物化表征。用血管平滑肌细胞进行体外基因转染,PCR法检测其转染效果。兔移植静脉内膜增生模型和大鼠腹主动脉瘤模型体内局部给予A-MCP-1纳米粒子,应用病理形态学分析、斑点杂交、原位杂交、Western blot等方法观察其在体内的基因转染效果和对内源性MCP-1基因表达的抑制作用。结果基因纳米粒子平均粒径为201·4nm,基因含量为4·14%,基因的包封效率为86%,体外可维持稳定释放两周以上。兔移植静脉内膜增生基因纳米粒子组的动脉组织中检测到明显的A-MCP-1表达,并抑制了正义MCP-1表达,内膜/中膜比为0·56±0·06,与对照组比较差异具有显著性(P<0·05),与阳离子脂质体1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)诱导的A-MCP-1质粒组比较,差异无显著性。大鼠腹主动脉瘤模型体内转染2周后,基因纳米粒子组腹主动脉直径为(1·79±0·12)mm,明显小于空白纳米粒子悬浮液组(2·58±0·21)mm和生理盐水组(2·63±0·29)mm(P<0·01)。MCP-1基因的mRNA和蛋白表达水平分别为12·5±1·5,17·6±2·1,明显低于空白纳米粒子悬浮液组35·7±4·5,42·3±5·7(P<0·01),生理盐水组32·4±3·9,39·8±4·8(P<0·01)。结论A-MCP-1基因纳米粒子用于兔移植静脉内膜增生模型以及大鼠腹主动脉瘤模型成功实现基因转染的研究结果,显示了其应用于临床的巨大潜力。     

家兔胆固醇酯转移蛋白基因克隆及其真核表达载体的构建

目的: 克隆家兔胆固醇酯转移蛋白(CETP) 基因,构建其真核表达载体,研究CETP基因的结构与功能,为进一步研究CETP在动脉粥样硬化(As)中的作用机制提供参考。方法: 采用TRIzol提取家兔肝组织总RNA,采用RT-PCR 方法将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,用LA Taq酶进行PCR扩增,克隆出CETP基因,将CETP cDNA片段克隆至pMD19-T载体上,对重组的CETP- pMD19-T测序后,登录GenBank进行序列比对,利用nnPredict软件分析预测CETP的二级结构。将CETP
cDNA片段克隆至pcDNA3.1真核表达载体上,对重组质粒进行PCR及酶切鉴定。结果：测序及序列比对显示与M27486基因序列98%相符;家兔CETP基因cDNA全长1 659 bp,编码序列(CDs区)长1 494 bp,编码498个氨基酸。CETP的二级结构以α螺旋结构为主,相对分子质量为142119.4, pI为4.91。结论: 成功克隆了家兔CETP基因,并成功构建了其真核表达载体,明确了CETP的二级结构。     

病毒介导的基因转染在组织工程中的应用

目的 构建重组病毒载体，将较多细胞因子通过病毒载体转入种子细胞，提高细胞增殖及分泌基质能力，维持表型，延缓老化。方法 应用基因工程技术，构建缺陷型逆转录病毒重组载体和缺陷性腺病毒重组载体。分别通过PT67包装细胞筛选克隆及293细胞扩增，获得假病毒上清液，经浓缩纯化后转染靶细胞结果成功构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Fas配体(Fas-Ligand)、绿色荧光蛋白(GFP)等逆转录病毒载体以及TGFβ1、人骨形成蛋白因子-7(hBMP7)、端粒酶、Smad3、Smad7等腺病毒载体，其中GFP-逆转录病毒重组载体在软骨细胞表达至2月。结论 通过有效的含目的基因重组载体转染种子细胞，延缓体外培养细胞的老化及促进细胞的增殖与基质分泌，获得组织工程所需要的大量种子细胞，为组织工程构建奠定了基础。     

与排异反应相关基因克隆及其反义转基因载体构建

目的克隆与排异反应密切相关的iNOS基因cDNA片段,并构建反义转基因载体.方法培养人血管内皮细胞HVEC细胞株,采用反转录-pCR方法获取iNOS cDNA基因片段,并克隆入T载体并进行序列分析.用HindⅢ与BamHI双酶切带有iNOS cDNA片段的T载体质粒与pCDNA5载体,回收酶切产物,连接,转化,提取质粒并酶切鉴定.结果RT-PCR获取了669 bp的iNOS基因片段;序列分析表明克隆的iNOS片段序列正确;双酶切分析显示克隆入pCDNA3载体的iNOS基因片段与预期的大小一致.结论克隆了iNOS基因片段,并构建了iNOS的反义转基因载体.     

大鼠神经球蛋白基因的克隆及其真核表达载体构建

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(neuroglobulin,NGB)基因并构建其真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确后,亚克隆入pCDNA3.1( )载体中,并通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.结果 克隆了Wistar大鼠的神经球蛋白基因,有4个碱基发生了突变;成功构建了真核表达载体.结论 Wistar大鼠脑组织中有NGB表达,成功克隆了该基因并构建了其真核表达载体.     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.     

人类TAP1基因克隆及表达载体pcDNA3.1/V5-His TOPO TA-TAP1的构建

目的 克隆TAP1(抗原处理相关转运1)基因cDNA序列,构建其真核表达载体peDNA3．1／V5-His TOPO TA-TAP1。方法 从人类B-LCL细胞中提取总RNA,以RT-PCR技术扩增TAP1基因片段,将该段基因克隆到表达载体peDNA3．1／V5-His TOPO TA上测序。结果 通过RT-PCR扩增获得1个2593bp的DNA片段,测序分析表明为TAPl基因。结论 通过RT-PCR等技术成功克隆出人类TAP1基因并成功构建了表达载体peDNA3．1／VS-His TOPO TA-TAP1。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。