METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用，为进一步明确METHI抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Ga14系统3，经PCR扩增子METH1的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后。再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段，该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物。可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

人分泌的凋亡相关蛋白1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及表达鉴定

目的构建人分泌的凋亡相关蛋白1(secreted apoptosis-related protein 1,SARP1)基因酵母双杂交诱饵载体,为鉴定SARP1基因相互作用蛋白、探讨SARP1基因在瘢痕组织中的生物学功能奠定基础。方法根据GenBank中SARP1的mRNA序列,设计分别带有NdeⅠ和SalⅠ酶切位点的上、下游引物,人工合成SARP1基因片段,扩增SARP1基因片段,构建含pGBKT7-SARP1基因的重组质粒,用NdeⅠ和SalⅠ进行双酶切、PCR,凝胶电泳及测序。用醋酸锂法将序列正确的重组质粒pGBKT7-SARP1(卡那霉素抗性筛选)转化入AH109酵母菌株,在缺陷型培养基上观察pGBKT7-SARP1在AH109中的表达情况。结果 SARP1基因扩增后的片段大小符合预期,并成功克隆入pGBKT7载体中;酶切后凝胶电泳及DNA测序显示pGBKT7-SARP1基因重组载体构建正确,对酵母菌株AH109无毒性,且不具自主激活报告基因的效应。结论成功构建了pGBKT7-SARP1基因酵母双杂交诱饵载体。     

雄激素受体相关蛋白267-α酵母双杂交诱饵重组质粒的构建及转化

目的 构建和转化雄激素受体相关蛋白267—α(ARA267—α)的酵母诱饵重组质粒，为通过酵母双杂交研究ARA267—α的功能奠定基础。方法 用PCR扩增ARA267—α全长cDNA中编码PWWP和PHD-SET蛋白结构域的两个基因片段；将基因片段与pGBKT7载体定向重组；用酶切和测序鉴定重组质粒；将核苷酸序列正确的重组质粒转化入AH109酵母菌株。结果 成功构建pGBKT7-PWWP和pGBKT7—PHDSET重组质粒。分别转化有2种重组质粒和pGBKT7空载体的3种AH109酵母都能在SD／-Trp／X—α—gal培养基中长成白色菌落，但都不能在SD／-HiS／-Trp／2．5mmol／L 3-AT／X—α—gal和SD／-Ade／-Trp／X—α—gal培养基中生长，在SD／-Trp液中培养16h后，A600均值分别为0．8、0．9、0．9。这表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活HIS3、ADE2和MEL1酵母报告基因表达的活性，也没有酵母毒性作用。结论 构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的cDNA文库筛选。     

肿瘤坏死因子α转化酶胞内区诱饵质粒的构建及鉴定

目的:构建用于酵母双杂交系统的诱饵质粒载体pGBKT7-TACEc(肿瘤坏死因子α转化酶胞内区),并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法:从BALB/c雄性小鼠睾丸组织提取总RNA,用RT-PCR方法获得TA-CEc,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-TACEc在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果:实验成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-TACEc,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。结论:pGBKT7-TACEc可应用在酵母双杂交系统中,寻找小鼠睾丸cDNA文库中与TACEc相互作用的蛋白质,为筛选小鼠睾丸中与TACEc相互作用的蛋白奠定了重要基础。     

人血管生成抑制分子的分子克隆与真核表达

目的　克隆人血管生成抑制分子 (METH1)全长cDNA ,建立稳定表达人METH1分子的哺乳动物细胞系。方法　RT PCR获取人METH1cDNA ,序列测定后克隆人真核表达载体pCDNA3 0中 ,用脂质体转染入HepG2细胞 ,G4 18筛选出稳定表达细胞系 ,用RT PCR与Westernblot分别检测RNA和蛋白表达水平。结果　RT PCR扩增得到预期大小的目的条带 ,序列分析表明成熟肽编码区与发表序列 [GI∶5 72 5 5 0 5 ]完全一致 ;克隆人pCDNA3 0中得到METH1真核表达载体 ,G4 18筛选 3周后得到稳定表达细胞系 ,RT PCR与Westernblot显示METH1在HepG2细胞中有高水平表达。结论　人METH1全长cDNA成功克隆 ,并在哺乳动物细胞系HepG2中获得稳定表达 ,为进一步研究METH1分子对增生性瘢痕血管形成的作用奠定了理论基础。     

丙型肝炎病毒 NS4A蛋白在胰腺细胞 cDNA文库中的结合蛋白基因的筛选

目的:从人胰腺细胞cDNA文库中筛选出与丙型肝炎病毒(HCV)NS4A蛋白存在相关作用并且参与糖、脂类代谢过程的结合蛋白,为研究HCV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制提供实验依据.方法:构建pGBKT7-NS4A作为诱饵质粒,转化酵母菌株AH109,用SD/-Trp筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109与Y187...     

METH1基因截短体的构建及其对HUVEC细胞增殖的影响

目的筛选血管生成抑制因子METH1功能编码区基因片段,为进一步研究METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法设计METH1三种基因截短体,分别构建相应的重组pcDNA3.1真核表达载体,然后将其稳定转染入HUVEC细胞,用RT-PCR、Western-Blot方法检测其在细胞中的表达,最后,通过MTT及FCM法验证其对HUVEC细胞增殖的影响。结果获得了能稳定表达的三种截短体,其中METH1-T2同METH1一样具有明显抑制HUVEC细胞增殖的作用,而METH1-T1、METH1-T3抑制细胞增殖的效果不明显。结论所获METH1-T2为功能活性区片段,可以替代METH1全长进行抑制增生性瘢痕的分子机制研究。     

METH1基因截短体的构建及其对HUVEC细胞增殖的影响

目的筛选血管生成抑制因子METH1功能编码区基因片段,为进一步研究METH1抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法设计METH1三种基因截短体,分别构建相应的重组pcDNA3.1真核表达载体,然后将其稳定转染入HUVEC细胞,用RT-PCR、Western-Blot方法检测其在细胞中的表达,最后,通过MTT及FCM法验证其对HUVEC细胞增殖的影响。结果获得了能稳定表达的三种截短体,其中METH1-T2同METH1一样具有明显抑制HUVEC细胞增殖的作用,而METH1-T1、METH1-T3抑制细胞增殖的效果不明显。结论所获METH1-T2为功能活性区片段,可以替代METH1全长进行抑制增生性瘢痕的分子机制研究。     

应用酵母双杂交系统筛选小鼠PIAS2相互作用蛋白

目的:应用酵母双杂交技术,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选与PIAS2(protein inhibitor of activatedSTAT2,PIAS2)相互作用的未知蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIAS2在精子发生中的作用机制,为临床男性不育症的治疗和诊断提供理论基础。方法:以pGBKT7-PIAS2为诱饵质粒,从小鼠精原细胞cDNA文库中筛选出与pGBKT7-PIAS2相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用的验证。结果:经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了与PIAS2相互作用的8个候选蛋白:Cyfip2、Psmb3、Nme1、nischarin、Nsun5、Ints10、Gnb2l1及Ndufaf3。结论:应用酵母双杂交系统,共筛选得到了8个不同的基因,其编码蛋白与PIAS2相互作用,可能与男性生殖调控相关。对上述蛋白与PIAS2的相互作用研究有助于揭示PIAS2的作用机制。     

A yeast-based model system for cloning secreted and membrane proteins

The targeting of proteins to cell organelles and membranes, or of proteins destined to secretion, is coordinated by signal sequences located at the 5'-end of their respective genes. A signal sequence trap system was envisaged in which a truncated version of the yeast acid phosphatase pho5 gene lacking the start codon and signal sequence could serve as a reporter gene. A fraction enriched in 5'-end fragments obtained by PCR from a potato guard-cell cDNA library was cloned in frame to the acid phosphatase gene and the acid phosphatase activity was assayed directly in yeast colonies grown on selective medium. Putative signal sequences targeting the acid phosphatase to the membrane or to the outside of the cell were used to screen the cDNA bank in order to recover the original full-size sequence which gave rise to the signal sequence. Two unknown sequences displaying marked tissue-specific expression were retrieved, one of them (YE139) with a higher expression level in green buds and stem cells, and the other one (YE290) with a higher expression level in androceum, gyneceum, and roots. The limitations of the system are further analyzed using other sequences as control.     

人睾丸酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

目的:构建应用于酵母双杂交系统的人睾丸组织cDNA文库。方法:从正常人睾丸组织总RNA中纯化出mRNA,以SMARTШTM和CDSШ为引物,合成两端具有同源臂的双链cDNA,后者与线性质粒pGADT7-Rec共转化入感受态酵母细胞Y187,两者在酵母细胞中同源重组成环形的cDNA文库质粒,收集在营养缺陷培养板上筛选出的所有克隆,即为人睾丸酵母双杂交cDNA文库。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人睾丸cDNA文库,共获得2×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～4.0 kb之间。结论:利用ClontechSMART技术,成功构建了应用于酵母双杂交的人睾丸组织cDNA文库,为探讨人精子发生的分子机制奠定了基础。     

Experimental study of an anticancer drug delivery system using polylactic acid

The present study was carried out to evaluate a drug delivery system with regard to the sustained drug-release properties and antitumor effects of a unique preparation composed of 5-fluorouracil (5-FU) and biodegradable polymer, poly L-lactic acid. The composite (F-PLA) was formed into plastic needles designed for the topical application in tumor tissue. Donryu rats implanted subcutaneously with ascites hepatomas AH 109A and AH 130 were used for the experiments. Release of the drug from the F-PLA needles containing 50% w/w 5-FU was maintained for one month or more in rat subcutaneous tissue and for about two weeks in the liver or AH 109A subcutaneous tumor. When the needles were implanted in the liver or AH 109A tumor, 5-FU concentrations in the treated tissues were sustained at high levels, whereas levels in the peripheral blood were very low. Histologically, coagulation necrosis of AH 130 tumor tissues was observed widely around the F-PLA needle implant areas. Meanwhile, in experiments on the antitumor effects of F-PLA preparation in AH 130- or AH 109A-bearing rats, it was demonstrated that tumor growth in the groups treated with F-PLA needles was significantly suppressed as compared with that in the controls. The results obtained in this study show that the F-PLA needle can be useful as a drug delivery system in cancer chemotherapy.     

人血管内皮抑素毕赤酵母真核系统的建立

目的构建人血管内皮抑素（ES）毕赤酵母真核表达系统。方法利用RT-PCR技术从人体肝脏组织扩增出ES基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC9中,酶切鉴定并进行DNA测序鉴定。结果成功克隆ES基因并筛选出pPIC9载体中的ES阳性克隆,测序证实其序列与已报道的ES基因序列一致。结论用分子生物学方法构建ES毕赤酵母真核表达载体的成功,使高效表达ES蛋白成为可能,并为采用抗血管生成方法治疗恶性肿瘤的研究奠定了基础。     

前列腺癌与前列腺增生相关基因的选择和克隆

目的 选择和克隆人前列腺癌(PCa)和前列腺增生(BPH)的相关基因。方法 根据当前前列腺癌与前列腺增生临床常规使用的肿瘤标记物和国内外基因表达谱的研究成果，选定了7个PCa上调表达。2个PCa下调表达基因和1个内参基因，采用聚合酶链反应(PCR)从正常人外周血DNA中扩增出上述10个基因的探针片段，并克隆至pGEM-T质粒中。重组质粒经PCR鉴定、EcoR Ⅰ单酶切或PSt Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切鉴定，产物电泳检测。结果 检测结果表明已经成功地将10个基因的探针序列克隆入pGEM-T质粒载体中。结论 前列腺癌和前列腺增生相关基因质粒构建与探针制备为临床前列腺癌的血清学诊断及与前列腺增生症的鉴别提供了实验基础。