大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因5''端调控序列初步分析

目的分析大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因5'端调控区域和相应转录因子的特性.方法克隆1 760 bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC基因的5'端序列单向切成不同长度的缺失体,将所构建的GCLC-Luc及其11个缺失体转染大鼠肺泡上皮细胞,通过测量转染后细胞的荧光素酶活性确定该基因的调控区域,并通过转录因子分析软件分析出可能与这些调控区域结合的转录因子,最后通过电泳迁移率改变实验(EMSA)以明确该调控区的顺式元件和转录因子.结果实验成功地克隆出大鼠GCLC上游调控基因及其报道载体GCLC-Luc及GCLC-Luc的11个缺失体.将GCLC-Luc及其缺失体转染肺泡上皮细胞并分析荧光素酶活性GCLC-Luc(-1 758/+2-Luc),缺失体1(-1 231/+2-Luc),缺失体2(-1 108/+2-Luc),缺失体3(-1 087/+2-Luc),缺失体4(-876/+2-Luc),缺失体5(-745/+2-Luc),缺失体6(-705/+2-Luc),缺失体8(-613/+2-Luc),缺失体9(-595/+2-Luc),缺失体10(-403/+2-Luc)和缺失体11(-111/+2-Luc)的荧光素酶值分别为(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)、(282 772±7 046)、(96 891±2 275)、(148 917±5 966)、(258 991±5 015)和(895±49)U.EMSA证实核因子1(NF-1)、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)能与-705～-613 bp区段的序列结合,活化蛋白1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)能与-403～-111 bp区段的序列结合,上游刺激因子(USF)能与-745～-705 bp区段的序列结合.结论 GCLC基因的-403～-111 bp和-705～-613 bp区段属正调控区域,NF-1、C/EBP、AP-1、NF-κB等转录因子能与这些正调控区域结合并可能参与GCLC基因的表达调控;-745～-705 bp属负调控区域,USF能与该负调控区域的E-box元件结合,提示E-box与USF相互作用可能抑制GCLC基因的表达.