猪视网膜色素上皮细胞的体外培养与鉴定

目的建立猪视网膜色素上皮（RPE）细胞体外分离、纯化培养体系并进行鉴定,为研究RPE细胞的功能及治疗相关眼底疾病提供细胞来源。方法采用胰蛋白酶消化法获取猪RPE细胞进行原代及传代培养,倒置显微镜观察细胞生长过程及形态变化并计算生长数据,角蛋白和RPE65蛋白抗体免疫细胞化学染色鉴定细胞。结果用胰蛋白酶消化法分离培养的猪RPE细胞生长良好,表现为多边形和梭形两种形态,原代细胞胞浆内含有丰富的色素颗粒,传代细胞内色素颗粒较原代细胞少。免疫组织化学法证实RPE细胞均为鼠抗人角蛋白染色阳性。结论培养的细胞可作为体外猪RPE细胞的来源,体外分离、纯化和培养猪RPE细胞的成功,为RPE细胞功能和相关视网膜疾病的深入研究提供了细胞来源。     

溶血磷脂酸对人类视网膜色素上皮细胞生物学功能的影响研究

目的:研究溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对体外培养人类视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelia-lium,hRPE)细胞增殖活力、分化特性及免疫活性等生物学功能的影响。方法:采用MTT法检测体外培养hRPE细胞增殖活力;角蛋白及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫细胞化学染色方法分析体外培养hRPE细胞分化特性;流式细胞术检测hRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的表达。结果:加药后第2d开始LPA组吸光度明显高于对照组(P<0.001);角蛋白18表达对照组较LPA组强(uc=-12.683,P<0.001),α-SMA表达对照组较LPA组弱(uc=10.402,P<0.001);hRPE细胞表面HLA-ABC、HLA-DR、ICAM-1的阳性细胞率和平均荧光强度组间差异无统计学意义(各指标均P>0.05)。结论:LPA明显促进hRPE的增殖活力,促进hRPE转分化,在PVR形成过程中起潜在的促进作用,但对hRPE免疫活性无影响。     

氯化钴对体外培养的视网膜色素上皮细胞VEGF表达的影响

目的探讨人视网膜色素上皮（RPE）细胞体外纯化培养方法和观察氯化钴（CoCl2）对RPE细胞VEGF表达的影响。方法采用酶辅助的显微分离法分离培养人RPE细胞并用细胞角蛋白和S-100免疫组织化学鉴定，用100μmol／L CoCl2 10％胎牛血清的DMEM培养RPE 30h，用免疫印迹方法测量其VEGF蛋白表达水平。结果酶辅助的显微分离法可体外纯化培养RPE细胞，用细胞角蛋白和S-100免疫组织化学染色均呈阳性。100μmol／L CoCl2作用30h后RPE细胞VEGF表达水平可提高2倍。结论通过Hu氏酶辅助的显微分离法，获得了RPE细胞的纯化培养；CoCl2可明显诱导RPE细胞VEGF表达上调。     

缺氧诱导体外培养人视网膜色素上皮细胞凋亡

目的:了解缺氧条件下体外培养人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡情况。方法:将培养的人RPE细胞置于含10mL/LO2、50mL/LCO2和940mL/LN2的培养箱内建立缺氧模型。于缺氧后1,3,6,12,24h,利用扫描电镜、透射电镜、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucle-otidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)技术和流式细胞仪测定RPE细胞凋亡水平。结果:常氧状态下RPE细胞生长良好,几乎没有凋亡(TUNEL法测凋亡指数为1.2)。缺氧条件下,RPE细胞发生了不同程度的凋亡,缺氧后3h凋亡水平达峰值(凋亡指数为34.43)。结论:缺氧可导致体外培养的人RPE细胞凋亡,提示RPE凋亡可能参与了某些缺血缺氧性眼病的发生。     

水蛭提取液诱导视网膜色素上皮细胞转分化的初步研究

药物诱导细胞分化是细胞分子生物学领域研究的热点课题，从中药中寻找和提取细胞的诱导分化剂是此类研究的新途径。本研究观察水蛭对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞转分化的影响。     

缺氧诱导体外培养人视网膜色素上皮细胞凋亡鲻

目的:了解缺氧条件下体外培养人视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium,RPE)细胞的凋亡情况.方法:将培养的人RPE细胞置于含10mL/L O2、50mL/L CO2和940mL/L N2的培养箱内建立缺氧模型.于缺氧后1,3,6,12,24h,利用扫描电镜、透射电镜、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)技术和流式细胞仪测定RPE细胞凋亡水平.结果:常氧状态下RPE细胞生长良好,几乎没有凋亡(TUNEL法测凋亡指数为1.2).缺氧条件下,RPE细胞发生了不同程度的凋亡,缺氧后3h凋亡水平达峰值(凋亡指数为34.43).结论:缺氧可导致体外培养的人RPE细胞凋亡,提示RPE凋亡可能参与了某些缺血缺氧性眼病的发生.     

吲哚美辛诱导体外培养的视网膜色素上皮细胞凋亡

目的　探讨用吲哚美辛 ( indomethacin,IN)诱导体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 ( retinal pigm entepithelium ,RPE)细胞的凋亡。方法　加入终浓度分别为 10 0、 2 0 0、40 0、 6 0 0μmol· L- 1 的 IN,作用 2 4h;6 0 0μm ol· L- 1 IN作用 6、 12、 2 4h后用透射电镜定性观察凋亡细胞 ,并用吖啶橙荧光染色进行定量和定性分析。结果　经 2 0 0、40 0、6 0 0 μm ol·L- 1 IN作用 2 4h后 RPE细胞凋亡指数分别为 ( 2 7.0 0 0 0± 1.3375 ) % ,( 5 1.0 0 0 0±1.370 3) % ,( 6 8.0 0 0 0± 1.6 86 5 ) %与对照组 ( 2 .0 0 0 0± 0 .42 16 ) %相比 ,差异有显著性( t=4.6 2 4,9.0 6 2 ,12 .2 0 6 ,P=0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 ) ,随着 IN浓度的增加 ,RPE细胞凋亡数逐渐增多 ;6 0 0μm ol· L- 1 IN作用 12、2 4h后 RPE细胞凋亡指数分别为 ( 44 .0 0 0 0±0 .843 3) % ,( 6 4.0 0 0 0± 1.2 6 49) %与对照组 ( 2 .0 0 0 0± 0 .42 16 ) %相比 ,差异有显著性( t=8.6 17,13.2 74,P=0 .0 0 0 ,0 .0 0 0 )。结论　 IN能诱导体外培养的人胚胎 RPE细胞的凋亡 ,并且 RPE细胞的凋亡呈现出随浓度增加和时间延长凋亡细胞数明显增多。     

体外原代培养人视网膜色素上皮细胞

目的：探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞(RPE)技术。为研究溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)对培养的人类视网膜色素上皮细胞DNA合成与增殖的作用。方法：取自愿贡献的意外事故成年眼球，用2．5g／L胰酶消化获取人RPE细胞、150mL／L胎牛血清的DMEM培养液培养，细胞接近融合状态时进行传代培养。取自愿贡献的眼球并游离其视网膜色素上皮细胞，用DMEM加100mL／L血清及MEM氨基酸和庆大霉素，进行细胞传代培养。用溶血磷脂酸、转移因子β2(TGF—β2)及LPA TGF—β2进行视网膜色素上皮细胞增殖试验，用细胞染色法进行细胞计数，提取视网膜色素上皮细胞DNA，用Spectrophotometer进行DNA定量测定。结果：RPE原代细胞镜下为圆形，大小不一，内含较多的色素颗粒，胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后3d增殖速度明显加快，至4～5d即可基本融合，细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛，细胞质内细胞器丰富，线粒体量多，体积较小，内外膜分界清晰，嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内，多数细胞质内数量较少呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。含有和／或缺乏10mL／L小牛血清的两种LPA(10μmol／L)均明显刺激视网膜色素上皮细胞增殖，但这种细胞的增殖被TGF-β2所抑制，LPA(10μmol／L)引起视网膜的色素上皮细胞DNA合成增加是正常对照组的两倍。     

兔视网膜色素上皮细胞的体外标记

目的 建立兔视网膜色素上皮（ＲＰＥ）细胞的体外标记方法。方法 兔ＲＰＥ细胞经传代培养并鉴定后,掺入溴脱氧嘧啶（ＢｒｄＵ）对细胞进行体外标记,通过免疫组织化学方法来显示标记的细胞。结果 ＢｒｄＵ标记后,所有的细胞核呈阳性染色。结论 提供一种简便易行的ＲＰＥ细胞标记方法,提示ＢｒｄＵ掺入法适用于所有培养细胞的体外标记。     

红景天对培养人视网膜色素上皮细胞增生和DNA合成的抑制作用

目的 研究红景天对体外培养视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用及可能机制。方法 通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同质量浓度(500、400、300、200、100、50、10μg／mL)红景天和红景天200μg／mL在不同作用时间(6～120h)对RPE细胞增生及代谢的影响。结果 红景天组细胞增生受抑制并出现细胞脱落，红景天400μg／mL具有最强的抑制效应，其明显抑制效应在6h即出现，72h达高峰。红景天组L4值日明显低于对照组，RPE细胞生存率下降。结论 红景天可能通过干扰RPE细胞代谢对RPE细胞增殖具有剂量依赖和时间依赖方式的抑制作用。     

人胚眼色素上皮细胞的培养

准备可供植入的人色素上皮细胞。方法将１２－２４周人胚眼的视网膜色素上皮细胞自脉络膜毛细血管床上撕离,置入培养皿中作贴壁培养。结果培养的ＲＰＥ细胞可在培养皿中存活２－３个月。顺极性和反极性培养不影响细胞的形态和存活时间。培养的ＲＰＥ细胞具有吞噬视细胞外节的功能。结论培养的胚眼ＲＰＥ上皮片可作为同种异体ＲＰＥ移植的良好供体。     

缺氧对体外培养的人视网膜色素上皮细胞热休克蛋白47表达的影响

目的:探讨缺氧对体外培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞热休克蛋白47(heatshockprotein47,HSP47)表达的影响。方法:培养的人RPE细胞分为两组:缺氧组使用化学缺氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞缺氧环境来培养人RPE细胞,对照组置入正常环境中培养。采用半定量RT-PCR检测人RPE细胞中HSP47mRNA的表达,Westernblot蛋白印迹分析检测人RPE细胞中蛋白水平。结果:缺氧组AHSP47/Aβ-actin比值为1.46±0.15与对照组比值0.94±0.13比较,差异有显著意义(P<0.05)。同时缺氧组HSP47蛋白含量平均A值为728.03±38.15显著高于正常对照组平均A值571.47±26.95,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HSP47在缺氧状态下异常高表达。     

溶血磷脂酸对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 :探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞 (RPE)方法。方法 :取自愿者贡献的意外事故成年眼球 ,用 0 .2 5 %胰酶消化获取人RPE细胞、置 15 %胎牛血清的DMEM培养液中培养 ,细胞接近融合状态时进行传代培养。用溶血磷脂酸 (lysophosphatidicacid ,LPA)观察RPE增殖的影响。结果 :RPE原代细胞镜下为圆形 ,大小不一 ,内含较多的色素颗粒 ,胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后第 3天增殖速度明显加快 ,至 4～ 5d即可基本融合 ,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第 3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛 ,细胞质内细胞器丰富 ,线粒体量多 ,体积较小 ,内外膜分界清晰 ,嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内 ,多数细胞质内含量较少 ,呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。结论 :LPA可促进人类RPE细胞体外培养的增殖 ,第 3代培养的视网膜色素上皮细胞可保留原代细胞的生物学特性     

培养人视网膜色素上皮细胞在PVR患者视网膜下液作用下c-fos和c-jun的表达

目的 观察培养的人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium，hRPE)在不同程度增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)患者视网膜下液(subretinal fluid，SRF)作用下细胞增生与c—fos和c—jun的表达。方法 不同程度PVR患者SRF作用于培养的hRPE细胞后利用细胞计数和MTT比色实验观察SRF对培养hRPE细胞的作用，同时采用SP法在不同时间点作兔抗人c—fos多抗和兔抗人c—jun多抗的免疫组织化学染色。结果 PVR患者SRF作用组与对照组相比可明显促进培养hRPE细胞的增殖，同时实验组hRPE细胞c—fos和c—jun均表达增高，视网膜下液作用lh后，Fos蛋白抗体染色阳性，细胞核呈明显棕黄色染色；3h表达达高峰，持续约12h；视网膜下液作用lh后，Jun蛋白抗体染色阳性，细胞核呈明显棕黄色染色；6h表达达高峰，持续约48h，对照组hRPE细胞(未经SRF作用仅加入等量PBS)Fos蛋白抗体和Jun蛋白抗体染色均为阴性。结论 PVR患者SRF中含有能诱导c—fos和c—jun等“立早基因”转录的细胞外生长或分化因子；c—fos和c—jun的表达是SRF促进RPE细胞的增殖过程中一个非常重要的早期分子事件。     

bFGF对体外培养牛RPE细胞特异性吞噬功能的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(basicfibrob-lastgrowthfactor,bFGF)对体外培养牛视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞特异性吞噬功能的影响及实验方法的选择。方法:采用辣根过氧化物酶Ⅱ型(horseradishperoxi-diase,HRP)示踪法测定不同bFGF浓度及作用时间对体外培养单层牛RPE细胞吞噬HRT量的影响。结果:不同bFGF浓度及作用时间各组光吸收值差异均不显著。结论:bFGF对体外培养牛RPE细胞特异性吞噬功能无明显影响。     

培养人视网膜色素上皮细胞中β-半乳糖苷酶活性研究

目的　观察培养人视网膜色素上皮 (RPE)细胞中复制衰老相关的 β 半乳糖苷酶活性。 方法　在培养的RPE细胞中 ,以传代次数 ( 5、10、2 0 )和取材供体的年龄 ( 2 6、44、5 7岁 )分组 ,进行标准化的 β 半乳糖苷酶活性和细胞增殖能力检测。结果　培养RPE细胞中 β 半乳糖苷酶活性阳性细胞数量随传代次数的增加而增加 ,在 2 0代的细胞中 ,阳性细胞的数量为 87%± 1 2 % ,明显高于第 5代和第 10代细胞 (P <0 0 5 )。而细胞的增殖能力明显下降 (P <0 0 5 )。结论　培养RPE细胞复制衰老的发生与细胞传代次数和取材年龄相关 ,其相关研究可能对了解年龄相关性视网膜疾病的发病机制有帮助     

吲哚菁绿对人视网膜色素上皮细胞的影响

目的　研究吲哚菁绿 (ICG)对培养的人视网膜色素上皮 (RPE)细胞的影响 ,为黄斑裂孔手术中ICG着染并剥除视网膜内界膜寻求合适的质量浓度和作用时间。方法　以质量浓度分别为 2 0、1 0、0 5、0 2 5mg/mLICG分别作用于培养的人RPE细胞 ,用四唑盐比色法 (MTT)、电镜及免疫组织化学方法从形态、功能方面观察RPE细胞的损伤。结果　 ( 1)MTT检测ICG对RPE细胞活性的抑制与时间无关 (F =1 96,P =0 173 3 ) ,与质量浓度有明显相关性 (F =80 96,P =0 0 0 0 1)。ICG质量浓度小于或等于 0 5mg/mL时 ,RPE细胞活性与阴性对照组无明显差异 (P >0 0 5 )。( 2 )电镜观察以上质量浓度ICG对RPE细胞形态均有损伤 ,以变性为主 ,表现为细胞器肿胀且与质量浓度呈正相关。( 3 )以上 4种质量浓度ICG作用RPE细胞后 ,各组细胞增殖核抗原 (PCNA)表达与阴性对照组无明显差异 (P >0 0 5 )。结论　质量浓度≤ 0 5mg/mL时ICG可安全地着染视网膜内界膜。     

氧化损伤对体外培养人视网膜色素上皮细胞PEDF的影响

目的研究氧化损伤对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞表达色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)的影响。方法体外培养人RPE细胞,加入浓度为600μmol.L-1H2O2分别作用不同时间(2h、8h、24h),采用免疫细胞化学法检测PEDF蛋白的表达,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测PEDF mRNA。结果免疫细胞化学染色对照组即有PEDF的阳性表达,而氧化损伤2h、8h、24h PEDF蛋白阳性表达量逐渐减少,染色由棕黄色变为黄色。各时间段两组结果比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测PEDF mRNA量与PEDF蛋白表达变化一致。结论氧化损伤能促使人RPE细胞PEDF表达下调,并在一定范围内与作用时间有关。