自制阳离子纳米泡介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 观察自制阳离子纳米泡作为基因转染载体体外转染肝癌细胞系HepG2细胞的可行性.方法 将脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和全氟丙烷声振后制得微囊带有PEI的阳离子脂质体纳米泡(PNB),评价其基本特性,用其转染HepG2细胞,并辐照超声,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测细胞转染率,CCK-8法评估其细胞活性.结果 制备的PNB表面带有正电荷,能阻碍质粒DNA在电场作用下发生迁移,且能有效地转染HepG2细胞,转染效率达30％～45％,辐照超声后转染效率明显提高(P＜0.05).结论 新型阳离子纳米泡在体外可作为基因转染载体,有效地携带质粒DNA并促进转染,辐照超声可使转染效率显著提高.     

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验

背景：基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体。目的：评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件。设计、时间及地点：以Hela细胞为观察对象,分组设计。实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委-教育部重点实验室完成。材料：质粒pGFP-N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存。方法：首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性。主要观察指标：采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因（绿色荧光蛋白基因pGFP-N2）,分析阳离子脂质体Lipofectamine2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性。结果：Lipofectamine2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力;以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine2000转染率较高;当Lipofectamine2000与DNA质量比为3∶1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine2000的毒性相对较小。结论：对Hela细胞而言,Lipofectamine2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性。     

PEI与脂质体介导基因转染的比较研究

目的：比较新型转染试剂阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）与脂质体2000介导的血管内皮细胞生长因子 VEGF165基因转染人胚肾细胞293T 的转染效率,为基因转染提供新的方法。方法分别采用脂质体和不同 N／P 比值的 PEI 将合成的含有绿色荧光蛋白（GFP）和 VEGF165的质粒转入293T 细胞。转染24 h 后,采用 CCK-8试剂盒检测细胞活性;转染48 h 后在荧光显微镜下观察比较两种转染方法的转染效率,并通过 ELISA 方法检测细胞上清液中 VEGF165浓度,比较两种方法的转染效果。结果当 N／P＝9时,PEI 转染的细胞活性与脂质体转染相近,对细胞的毒性较小;此时,PEI 转染效率与脂质体也相似,均可达到约70％;同样,转染后细胞上清中 VEGF165浓度较未转染组提高（P ＜0．05）,但两种方法转染组间比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论PEI 作为一种新型的转染试剂,与脂质体相比,在一定比例范围内,具有转染效率高,对细胞毒性小且价格低廉的优势,有望成为基因转染的有效载体。     

阳离子脂质体转染Hela细胞的实验冰

背景;基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体.目的:评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件.设计、时间及地点:以Hela细胞为观察对象,分组设计.实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委一教育部重点实验室完成.材料:质粒pGFP.N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存.方法;.首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,最后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性.主要观察指标:采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因(绿色荧光蛋白基因pGFP-N2),分析阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性.结果:Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力:以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine 200C转染率较高;当Lipofectamine 2000与DNA质量比为3:1时,转染效率最高,约72%,是DOTAP转染细胞最高活性的2.5倍;在最佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine 2000的毒性相对较小.结论:对Hela细胞而言,Lipofectamine 2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性.     

三种阳离子脂质体介导血管内皮细胞基因转染效率的比较

目的:评价不同阳离子脂质体介导基因转染血管内皮细胞的转染效率。方法:实验于2006-12/2007-02在中山大学生化实验室及广州市创伤外科研究所完成。采用增强型绿色荧光蛋白基因为报告基因,分别采用Lipofectin、Lipofectamine、Dosper3种不同的阳离子脂质体为载体,转染人脐静脉血管内皮细胞。在24孔板中,每孔加入人脐静脉血管内皮细胞悬液(1×106个细胞),各孔分别加入3种不同阳离子脂质体增强型绿色荧光蛋白质粒复合物,分别于培养24,48h后用荧光显微镜及流式细胞仪测定增强型绿色荧光蛋白在细胞内的表达及转染效率。结果:3种不同阳离子介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染的人脐静脉血管内皮细胞内均有绿色荧光蛋白表达,24h后明显,48h后达高峰。Dosper介导组绿色荧光细胞百分比明显高于Lipofectin介导组及Lipofectamine介导组,差异有非常显著意义(P<0.01)。结论:Dosper介导的血管内皮细胞基因转染效率较高,较适合作为血管内皮细胞的基因转染载体。     

肝细胞靶向性半乳糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺纳米基因载体的合成及其理化特性

对聚乙二醇-聚乙烯亚胺进行半乳糖化修饰，可使其成为具有肝细胞靶向性的纳米基因载体半乳糖化聚乙二醇-聚乙烯亚胺[Galactosylated poly（ethylene glycol）-grafl-polyethylenimine，Gal-PEG-PEI]。目的：合成Gal—PEG-PEI，考察其基本理化特征，为下一步的转染研究提供参考。设计、时间及地点：对比观察基因工程实验，于2007-10／2008-06在中山大学生物医学工程中心完成。材料：两步法合成Gal-PEG-PEI。方法：应用纳米粒径-zeta电位仪、透射电镜、凝胶阻滞实验和髓结合实验测定Gal—PEG-PEI与psiRNA复合物的理化性质，CCK-8法检测其细胞毒性，纳米复合物转染HepG2细胞并观察其转染效率。主要观察指标：Gal-PEG-PEI／psiRNA的粒径、zeta电位及形态；包覆效率：细胞毒性实验结果；肝脏靶向性转染结果。结果：Gal—PEG—PEI／psiRNA复合物的粒径随N／P的增大而减小，最小粒径为81．1nm，而zeta电位随Gal-PEG-PEI中氨基与psiRNA磷酸基比例的增大呈上升趋势；Gal—PEG-PEI对siRNA质粒有较好的包覆效率。Gal—PEG-PEI载体的细胞毒性小于聚乙烯亚胺而其转染效率高于聚乙烯亚胺。结论：成功合成Gal-PEG-PEI纳米基因载体，表现出良好的肝细胞靶向性，且细胞毒性较小。     

pHSP70P-EGFP真核表达载体的构建及其在人Chang′s肝细胞中的表达

摘要：目的：构建HSP70启动子与绿色荧光蛋白重组真核表达载体,并在人Chang′s肝细胞表达,建立一种新的体外药物肝毒性早期预测细胞模型。 方法：提取人Chang′s肝细胞基因组DNA,钓取HSP70启动子基因,构建重组载体,经脂质体转染人Chang′s肝细胞,用G418筛选稳定转染细胞,用荧光显微镜观察绿色荧光表达情况,用实时荧光定量PCR检测EGFP基因表达量的变化。 结果：成功钓取HSP70启动子基因并导入真核表达载体pEGFPN1;G418以300 ng/mL的终浓度筛选出稳定转染的单克隆细胞;荧光显微镜观察到肝毒性药物酮康唑刺激人Chang′s肝细胞后,可诱导HSP70启动子调控增强型绿色荧光蛋白发出绿色荧光,药物刺激组EGFP mRNA相对表达量与正常对照组比较有统计学意义（t=-14.21,P＜0.05）。 结论：成功构建HSP70启动子与绿色荧光蛋白共表达真核表达载体,获得稳定转染单克隆细胞,并证实HSP70在肝毒性药物刺激下的应激表达,为建立新的体外药物肝毒性早期预测细胞模型进行高通量筛选新药奠定了基础。     

磁性氧化铁纳米颗粒与脂质体介导EGFP基因转染内皮祖细胞的比较研究

目的评价精氨酸包裹的超顺磁性氧化铁纳米颗粒（nano-Fe2O3-arginine）及脂质体作为基因载体在针对外周血来源的内皮祖细胞转染中的可行性,并对两者的转染效率进行比较。方法将nano-Fe2O3-arginine及LipofectamineTM2000作为基因载体连接绿色荧光蛋白pcDNA3.1（＋）/EGFP质粒在体外转染兔外周血来源的内皮祖细胞,荧光显微镜观察转染结果并计算转染效率;转染后48h采用MTT比色法测定这两种载体对内皮祖细胞增殖和功能的影响以了解其细胞毒性。结果LipofectamineTM2000作为基因载体将报告基因转染至兔外周血内皮祖细胞内并成功表达,用荧光显微镜可观察到发绿色荧光的细胞,转染效率达38.3%;而nano-Fe2O3-arginine转染组在荧光显微镜仅能观察到少量绿色荧光细胞,转染效率不到5%;两种载体对内皮祖细胞的增殖活性未见明显影响。结论脂质体作为载体转染内皮祖细胞的效率明显高于精氨酸包裹的超顺磁性氧化铁纳米颗粒,脂质体可较为有效安全地转染基因至内皮祖细胞,从而为内皮祖细胞联合基因治疗疾病奠定了基础。     

新型阳离子脂质体制备及其体外转基因特征

背景:阳离子脂质体及胶束、纳米粒等转基因载体是目前非病毒转基因载体领域研究热点:而目前市售转基因试剂盒价格昂贵,并且基本上都是进口商品,如果能够开发一种价廉,转基因效率高,具有自主知识产权的转基因试剂盒将展现广阔市场前景.目的:合成一种新型阳离子脂质复合物,并制备相应阳离子脂质体,对其体外转基因效率进行考察.方法:以1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺、胆固醇、丁二酸酐为原料合成阳离子脂质复合物,采用薄层色谱、红外光谱等方法对产物进行结构表征.然后用薄膜分散法,将适当比例的二油酰磷脂酰乙醇胺和阳离子脂质复合物混合制各成阳离子脂质体,并用其包封含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFPC1,对人宫颈癌Hela细胞株进行体外转染.结果与结论:通过两步法合成了一种全新的阳离子脂质复合物--胆固醇-丁二酸酯-1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺,薄层色谱及红外光谱结果表明合成了预期产物.薄膜分散法制得阳离子脂质体,其中以这种阳离子脂质复合物和二油酰磷脂酰乙醇胺摩尔比为1:1左右所制备的脂质体颗粒较为均匀、细小,形态基本呈圆形.体外对质粒包裹实验结果表明,阳离子脂质体与质粒比为5:3,可完全包封质粒.用该阳离子脂质体对Hela细胞进行转染,24 h后,瞬时转染效率达35.6%.从初步实验结果看,所合成的阳离子脂质复合物结构总体与市售阳性成分结构类似,合成方法简单、廉价,体外对质粒DNA有很好包裹性能,细胞毒性低,然而体外对Hela细胞的转染效率还明显偏低.     

不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨

目的:探讨小鼠B淋巴瘤细胞A20最佳的转染方式,为后期研究LMP1基因在A20细胞中的表达及作用奠定基础.方法:分别使用脂质体转染法、NucleofectorTM核酸转染法和慢病毒载体介导转染法将带有报告基因绿色荧光蛋白的重组质粒pCDF-LMP1转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析这三种转染方式对A20细胞的转染效率.结果:脂质体转染效率最低,仅见个别细胞有绿色荧光,NucleofectorTM核酸转染效率约为10%,浓缩后的慢病毒载体介导转染法效率最高,可达80%以上.结论:对于悬浮细胞A20而言,浓缩后的慢病毒载体介导的转染法是最佳的转染方式,该方法在将外源基因转染至悬浮细胞方面值得推广,也为极难转染的细胞做稳定转染提供参考价值.     

RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因3个不同靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后,免疫细胞化学法（ICC）检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖情况。结果与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性（F=18.64,q=4.293～4.925,P〈0.05）,而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性（q=0.631～0.126,P〉0.05）。转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调（F=68.39,q=13.71、14.37,P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（F=20.06～47.65,q=11.186、12.601,P〈0.01）。结论构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-sur-vivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖。     

人鼻咽癌CNE-2细胞转染方法的比较研究

目的比较三种非病毒载体转染方法转染人鼻咽CNE-2细胞。方法分别采用脂质体转染法、电穿孔转染法、磷酸钙纳米颗粒转染法将pEGFP-N1质粒DNA转染人鼻咽癌CNE-2细胞,转染24h后荧光显微镜观察EGFP的表达,计算转染率;MTT实验比较各转染方法对CNE-2细胞的细胞毒性。结果脂质体转染组的转染率为（51．9±2．8）％;电穿孔转染组的转染率为（42．8±2．6）％;磷酸钙纳米颗粒转染组的转染率为（48．1±2．3）％。经统计学分析,三种方法转染CNE-2细胞的转染率相互之间有显著的差异（P〈0．001）;MTT结果显示,磷酸钙纳米颗粒转染法的细胞毒性最小。结论磷酸钙纳米颗粒转染法转染效率相对较高,而细胞毒性小,可作为转染CNE-2细胞的首选转染方法。     

微泡造影剂及超声促进绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2内表达的实验研究

目的研究微泡造影剂与超声辐照是否能提高绿色荧光蛋白质粒在人肝癌细胞HepG2中的转染率。方法将培养的HepG2细胞分为四组：第一组为对照组；第二组以脂质体转染；第三组加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照；第四组加入脂质体和微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照．将合有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人肝癌细胞HepG2，24小时后以荧光显微镜观察人肝癌细胞HepG2中的绿色荧光蛋白表达情况，并用流式细胞仪测算转染率。结果脂质体转染组与微泡造影剂＋超声辐照组有显著性差异（P〈0．05）。脂质体＋微泡造影剂＋超声辐照组与微泡造影剂＋超声辐照组有显著性差异（P〈0．01）结论微泡造影剂和超声辐照协同脂质体能提高目标基因在肝癌细胞内的转染率。     

慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞

背景：基因治疗已成为疾病治疗的新趋势,为某些难治性疾病带来了曙光,合适的细胞、基因及载体的选择是治疗的关键。目的：探讨慢病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染大鼠骨髓内皮祖细胞应用于基因治疗的有效性和可行性。方法：从SD大鼠骨髓分离、培养、鉴定内皮祖细胞,采用构建的慢病毒载体（LV）将空载体（LV-eGFP）或骨形态发生蛋白2基因（LV-eGFP-BMP2）转染至内皮祖细胞,通过eGFP荧光检测转染效率。ELISA法检测上清液中骨形态发生蛋白2蛋白的分泌,Western blot法检测细胞骨形态发生蛋白2蛋白的表达,比较转染后细胞的迁移、增殖和抗凋亡能力。结果与结论：慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体的转染效率可达90%。与正常内皮祖细胞、转染空载体内皮祖细胞比较,转染骨形态发生蛋白2基因的内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白增加（P〈0.01）,迁移和增殖能力无明显改变（P〉0.05）,肿瘤坏死因子α损伤后的细胞凋亡率明显降低（P〈0.05）。结果表明慢病毒介导骨形态发生蛋白2载体可成功转染内皮祖细胞,转染后可增加内皮祖细胞分泌和表达骨形态发生蛋白2蛋白,增强对炎性损伤的抗凋亡能力,对迁移能力和增殖活性无明显影响。     

低频超声联合微泡增强脂质体介导Racl—shRNA质粒转染前列腺癌细胞及对其生物学行为的影响

目的研究低频超声联合微泡增强脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染前列腺癌PC3、DUl45细胞,并探索其对前列腺癌细胞凋亡、侵袭能力的影响。方法基础情况下Westernblot检测RWPE-1细胞、PC3细胞和DUl45细胞的Rac1蛋白表达。根据不同处理方式将细胞分为四组：PC3细胞对照组（A组）、超声加微泡联合脂质体转染PC3细胞组（B组）、DUl45细胞对照组（c组）及超声加微泡联合脂质体转染DUl45细胞组（D组）。通过蛋白质体外结合实验技术检测各组Racl蛋白的活性及表达;流式细胞仪检测各组细胞早期凋亡情况;细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力。结果基础情况下前列腺癌PC3、DUl45细胞Racl蛋白表达均较正常前列腺细胞RWPE-1增加,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;低频超声携微泡介导Rac-1shRNA质粒转染细胞后,B组Racl蛋白表达量较A组表达减少,D组表达量较C组减少,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;早期细胞凋亡检测显示,B组高于A组,D组高于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）;同期细胞侵袭力实验显示,B组穿膜细胞数少于A组,D组的穿膜细胞数少于C组,差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论低频超声联合微泡可促进脂质体介导的Racl-shRNA质粒转染人雄激素非依赖型前列腺癌细胞;通过抑制PC3、DUl45细胞中Racl蛋白表达可以促进癌细胞的早期细胞凋亡,同时可抑制癌细胞的侵袭能力。     

脂质体介导法转染mIMCD-3细胞的可行性及最佳转染条件

背景：近年来阳离子脂质体成为基因转移较为常用的载体,但应用脂质体对mIMCD-3细胞株进行转染的相关报道较少。目的：探讨脂质体法转染mIMCD-3细胞株的可行性,并通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得mIMCD-3的最佳转染条件。方法：以绿色荧光蛋白作为报告基因,采用脂质体Lipofectamine^TM2000包裹pIRES2-EGFP质粒转染mIMCD-3细胞,分别按照细胞接种密度、DNA用量、DNA与脂质体的比例、不同的质粒抽提方法、血清有无设定分组,观察以上因素对mIMCD-3细胞转染效率的影响。结果与结论：采用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染mIMCD-3细胞,在2×10^8L^-1细胞接种浓度、1μgDNA用量、1：3的DNA与脂质体比例时,转染效率最高。采用美国OMEGA公司生产的E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Mini Kit抽提的质粒能获得更高的转染效率。转染前漂洗细胞后换入无血清培养基比有血清组转染效率高（P〈0.01）,而转染后6h加入血清不影响转染效率。结果显示,脂质体法转染mIMCD-3细胞株是可行的,通过优化脂质体转染效率的影响因素,获得了mIMCD-3的最佳转染条件,可作为有关研究或应用的参考。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。     

细胞因子信号转导抑制因子1RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：以往关于细胞因子信号转导抑制因子1的研究多用脂质体或其他载体转染的技术,但存在效率低和安全性差等问题。目的：构建细胞因子信号转导抑制因子1RNA干扰慢病毒载体并进行鉴定。方法：实验设计3组针对细胞因子信号转导抑制因子1的短发夹RNA序列,应用基因重组技术插入pPll3.7载体,测序正确的重组病毒质粒与包装质粒通过共转染293T细胞,培养48h后,收集细胞培养上清液,感染A549细胞,westernblot检测目的蛋白细胞因子信号转导抑制因子1在靶细胞中的表达。结果与结论：实验通过对重组载体进行测序分析证实短发夹RNA插入慢病毒载体,慢病毒载体上清成功转染A549细胞后western blot检测结果显示该载体抑制了细胞因子信号转导抑制因子1蛋白在A549细胞有表达。说明实验成功构建了细胞因子信号转导抑制因子1RNA干扰慢病毒载体。     

聚酰胺-胺型树枝状高聚合物介导Survivin反义寡核苷酸抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长的作用

背景：采用反义寡核苷酸等治疗方法可以抑制凋亡抑制因子Survivin的表达,从而诱导肿瘤细胞凋亡。目前使用Survivin治疗恶性肿瘤仍存在基因载体转染效率低下、不能长期稳定表达、易被酶降解等难题。目的：观察聚酰胺-胺型树枝状高聚合物（polyamidoamine,PAMAM）脂质体介导Survivin-反义寡核苷酸对人肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用。方法：以人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠皮下注射建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型,将PAMAM脂质体和PAMAM分别与Survivin-反义寡核苷酸混合得到载反义基因转染复合物。测定复合物的zeta电位及包封率。将两种载基因复合物注射道裸鼠移植瘤体内,观察两组移植瘤大小,检测移植瘤组织中survivin基因的表达。结果与结论：PAMAM脂质体-survivin-反义寡核苷酸复合物的zeta电位高于PAMAM-survivin-反义寡核苷酸复合物（P〈0.05）,基因包封率两组比较差异无显著性意义（P〉0.05）。PAMAM脂质体-survivin-反义寡核苷酸复合物治疗组裸鼠移植瘤质量及survivin蛋白表达低于PAMAM-survivin-反义寡核苷酸复合物组（P〈0.05）。提示PAMAM脂质体能将Survivin-反义寡核苷酸高效递送到人肝癌移植瘤细胞,降低survivin蛋白的表达,诱导移植瘤细胞凋亡。     

构建含肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体

背景：腺病毒的表达时间有限,会限制目的基因的表达时间和表达量,不利于实验的持续进行,故文章选择慢病毒作为载体,与目的基因大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因片段进行基因重组。 目的：探讨构建含有大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因慢病毒载体的方法。 方法：根据GenBank中大鼠肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体序列（NM 145681.1）,设计出该基因的特异性引物Trail-AgeⅠ-F和Trail-AgeⅠ-R,用PCR法从大鼠cDNA文库中扩增出目的基因,AgeⅠ酶切将该基因克隆入真核表达载体GV218中,产生目的重组质粒,用脂质体 Lipofeetamine 2000包裹构建的重组质粒和辅助包装载体,3个质粒共同转染293T细胞,产生含有表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的慢病毒颗粒,收集病毒进行滴度鉴定,收集细胞提取蛋白进行基因表达情况的检测。 结果与结论：筛选出的克隆阳性菌测序获得肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因,全长861 bp,与GenBank中发表的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体核苷酸序列完全一致。包装后的病毒LV-mTrail在转染2 d后收集病毒液,经PCR和Western blot方法鉴定,从基因和蛋白的层面均证实携带有目的基因肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因。孔稀释法及实时荧光定量PCR病毒滴度测定法测定结果为2×109 TU/mL。提示大肠杆菌同源重组法能有效和方便地构建出含有肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因的慢病毒载体。