人端粒酶反转录酶小发夹RNA质粒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶是端粒酶的活性亚基,已成为肿瘤研究的热点。RNA干扰技术作为一种基因沉默方法,具有高效、特异等优点,现已广泛应用于肿瘤、病毒等研究领域。目的:构建针对人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,并观察其对乳腺癌T47D细胞人端粒酶反转录酶基因的表达和端粒酶活性的影响。方法:以Genbank中人端粒酶反转录酶基因的mRNA序列为基础,设计人端粒酶反转录酶基因的小干扰RNA序列,将其连接到具有G418抗性的质粒pBAsi-hU6-Neo(BamHⅠ/HindⅢ)中,应用基因测序加以验证,扩增提取质粒,以脂质体转染表达小发夹RNA的质粒到乳腺癌T47D细胞,抗生素G418筛选出转染成功的各组细胞。结果与结论:实验所构建的人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,经测序验证无误。将pBAsi-hU6-Neo重组质粒转染入T47D细胞,经G418筛选获得了转染成功的细胞。经RT-PCR和Western blot检测,转染后的人端粒酶反转录酶基因在mRNA和蛋白水平的表达均明显降低(P<0.01),经TRAP-ELISA法检测实验组细胞端粒酶活性出现显著下降(P<0.01)。结果证实,实验成功构建人端粒酶反转录酶的小发夹RNA质粒表达载体,实验所设计的小干扰RNA能有效抑制肿瘤细胞人端粒酶反转录酶基因的表达,进而降低细胞的端粒酶活性。     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定

背景:膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。目的:针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。方法:针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化.目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成.材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6N5一DEST,ccdB Survival,Stb13及293FT细胞由暨南大学生物工稃研究所提供.方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点Hind Ⅲ,Bg Ⅲ),通过酶切及连接反应形成pDONR221一hTERT-EGFP.采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5一DEST-hTERT-EGFP.将PLenti6N5一DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞.主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功.包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况.结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP成功构建.转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光.结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法.     

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景：动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。 目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。 方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以 PCR 及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。 结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×1011 v·g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×104 v·g/cel。在以1×104,5×104,1×105 v·g/cel 转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高（P 〈0.05）,4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。     

脊髓源星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白表达抑制最佳短发夹样RNA分子筛选及真核表达载体构建

背景:哺乳动物脊髓损伤后胶质瘢痕形成是神经再生的物理和化学屏障,减轻或延缓胶质瘢痕形成给损伤脊髓再生创造了有利条件。目的:设计筛选并构建大鼠胶质原纤维酸性蛋白短发夹样RNA真核表达载体。设计:观察性动物实验。单位:南方医科大学附属深圳医院脊柱外科。材料:选用Wistar大鼠25只,雌雄不拘,清洁级,体质量20～25g。DMEM/F12、lipofectamine2000、Trizol RNA分离试剂盒;胎牛血清(Hyclone);BamHⅠ、HindⅢ、PstI、SalI、T4连接酶;质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒;第一链cDNA合成试剂盒;兔抗鼠GFAP一抗。方法:实验于2005-10/2006-06在南方医科大学附属深圳医院完成。针对GFAP基因全编码序列设计并合成3对9bp茎环结构19bp干扰序列特异性shRNA模板,体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体;通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型,脂质体介导RNA干扰分子转染,由实时荧光定量RT-PCR及western blot技术,观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果,筛选最佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体。主要观察指标:①序列特异性干扰shRNA模板合成;②构建特异性重组质粒真核表达载体;③体外大鼠脊髓源星形胶质细胞培养;④实时荧光定量RT-PCR;⑤RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果。结果:序列测定证实GFAP-shRNA重组质粒真核表达载体构建成功,通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术筛选出最佳GFAP-shRNA效应表达载体,在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81%、63%、56%。结论:构建并筛选成功的GFAP-shRNA效应真核表达载体,在大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP-基因表达,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗研究策略的应用奠定前期基础。     

层黏素受体靶向RNA干扰质粒载体的构建

目的 构建层黏素受体RNA干扰质粒,为探讨抑制层黏素受体过表达在胆管癌免疫逃逸中的作用奠定基础.方法 PCR法获得U6启动子序列以及产生siRNA的相应DNA模板序列,将其克隆入pGenesil-3获得RNA干扰载体pGenesil-shLNR.脂质体法将pGenesil-shLNR导入胆管癌细胞QBC939,免疫组化法检测对胆管癌细胞QBC939LNR表达的抑制情况.结果 所构建的载体pGenesil-shLNR能够干扰QBC939细胞中LNR的表达,并且具有新霉素抗性,能够用G-418筛选稳定转化的细胞株.结论 成功构建了抑制胆管癌细胞QBC939表达LNR的RNA干扰质粒载体.     

短发夹RNA靶向抑制环氧化酶-2基因表达对肺癌细胞A549增殖的影响

目的评价短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）靶向肺癌细胞A549环氧化酶-2（COX-2）基因表达的抑制作用，并观察对肺癌细胞A。生长和细胞周期的影响。方法将抑制COX-2基因的shRNADNA模板插入到真核表达载体pGenesil-1的U6启动子下游，构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2。将试验分为3组：未转染肺癌细胞A549组、阴性对照HK组和pshRNA-COX-2转染组。用脂质体Lipofectamine^TM 2000转染肺癌细胞A549逆转录（RT）-PCR和免疫印迹法（Wb）分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况，流式细胞术检测细胞周期，细胞计数检测细胞生长变化。结果与阴性对照组相比，pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2mRNA及蛋白表达的抑制率分别为72．2％和48．6％；G0-G1期细胞由63．7％上升为71．0％，S期细胞由26．5％下降为20．0％；细胞生长明显减慢。结论pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制肺癌细胞COX-2表达，引起G0-G1期细胞增多，S期细胞减少，从而抑制肺癌细胞生长。     

靶向人血管内皮生长因子-C基因的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建靶向人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因的shRNA真核表达载体并检测其对靶基因的沉默效应.方法:根据靶基因VEGF-C序列,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSIREN-RetroQ载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒转染乳腺癌MCF-7细胞株,荧光定量PCR及Westen-blot检测其对靶基因VEGF-C表达的影响.结果:酶切及测序鉴定重组质粒pSIREN-VEGF-C的序列正确;转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人VEGF-C基因的shRNA真核表达载体,并在乳腺癌MCF-7细胞中高效、特异地发挥靶基因沉默作用.     

脊髓损伤后组织基因表达谱的变化

目的通过基因芯片全面了解组织损伤后基因表达变化情况,研究脊髓损伤后组织基因表达谱的变化。方法健康成年SD大鼠9只,体质量300～400g,雌雄不拘,随机数字法分为无损伤组及损伤2、48h组,每组3只。以打击法制成大鼠脊髓闭合性损伤的动物模型,利用表达谱基因芯片技术,检测正常及伤后2,48h脊髓组织基因表达谱,寻找伤后发生显著差异性表达的基因。结果有45条基因在脊髓损伤后2h发生了显著差异性表达,其中22条表达升高,23条表达下降;183条基因在伤后48h发生显著变化,包括61条表达升高,122条表达下降。结论脊髓损伤后不同时期,多条基因发生了表达变化,提示继发性脊髓损伤是一个多因素参与的过程。     

抑制人BI-1基因表达shRNA重组慢病毒表达载体的构建

背景: 慢病毒介导的RNAi技术以其专一性、抑制效率高、作用持久等优点已广泛应用于基因功能研究中.该技术病毒包装、转染、以及shRNA序列设计都会对抑制效率产生影响.因此实验以人的Bax抑制子1 (BI-1)为目的基因进行RNA干扰实验来探讨其影响因素.目的:为了利用慢病毒Lentivirus介导的RNAi技术寻找抑制人BI-1基因表达的siRNA.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-09/2008-12在北京大学医学部基础医学院医学遗传学系完成.材料:293T细胞、SH-SY5Y细胞为实验室保存;用Ambion公司(www.ambion.com)提供的网络在线工具设计了4个shRNA.方法:构建带有绿色荧光蛋白(EGFP)标签的、针对人BI-1基因不同区域设计的shRNA重组表达载体,然后与包装蛋白表达载体共转染293T细胞以包装成4种shRNA病毒粒子.通过流式细胞仪检测GFP的表达情况来摸索最佳包装条件.Real-time PCR以β-肌动蛋白mRNA被用作内参,将4种重组病毒和对照组病毒上清液侵染SH-SY5Y,检测内源性BI-1基因的敲低效率,筛选到最佳RNAi有效序列.主要观察指标:被不同包装病毒侵染的细胞内GFP的表达率.结果:pLentiLox3.7、rev、vsvg、rre等4质粒包装系统的最佳包装比例为2∶1:1∶1,包装48 h收获的病毒粒子的感染效率最高,并且在包装后的24 h之后换液会提高包装效率.靶定到人BI-1基因-2-17核苷酸(起始编码区域)的shRNA RNA干扰效率最高.能够抑制40%正常基因表达.结论:实验摸索出Lentivirus介导的RNAi技术病毒包装的重要影响因素.为建立稳定的人BI-1基因表达敲低的神经细胞模型和研究BI-1异常表达参与的神经元凋亡疾病的病理研究打下基础.     

整合稳定靶向高迁移率族蛋白B1基因shRNA载体的人脐静脉内皮细胞株建立

目的 构建针对高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)基因的特异性RNA干扰载体,建立稳定转染该干扰载体的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC).方法 根据HMGB1基因的编码序列及短发夹RNA(shRNA)设计原则,设计并合成针对HMGB1基因的特异性shRNA,将其定向克隆到pRNA-u6.1/Neo载体中,同时设立阴性对照,重组载体经脂质体转染HUVEC;转染细胞经类氨基糖抗生素样物质G418筛选,采用实时荧光逆转录-聚合酶链反应检测HMGB1mRNA表达,蛋白质免疫印迹法检测HMGB1蛋白表达.结果 酶切鉴定和测序证实,重组质粒shRNA序列与设计的片段完全一致.HMGB1基因特异性RNA干扰载体能够显著抑制HMGB1在HUVEC细胞中的表达(mRNA:0.4635±0.0342比1.0340±0.0352,蛋白:0.4510 ± 0.0200比1.0210±0.0110,均P＜0.05).结论 成功构建了靶向HMGB1基因的shRNA真核表达载体pRNA-HMGB1,并获得了稳定表达靶向HMGB1基因的shRNA的HUVEC细胞株,为进一步研究HMGB1在HUVEC细胞株中的生物学功能和作用机制奠定了基础.     

Strategies for short hairpin RNA delivery in cancer gene therapy

RNA interference (RNAi) gene silencing can be achieved by delivering vectors that transcribe short hairpin RNA (shRNA), which stably express small interfering RNA in target cells. Therefore, shRNA is of potential therapeutic use for inhibiting cancer cells, in which aberrant expression of certain mRNA's causes problems. However, this technique has not yet been developed for cancer therapy. The major problem for clinical use is lack of effective methods of delivery. In this article, we review the current strategies for shRNA delivery for target validation and their therapeutic uses in cancer to help further the understanding of challenges confronting shRNA technology, such as different principles of RNAi technology, basic construction of shRNA-expressing vectors and delivery barriers, which exist for both local and systemic delivery stratiges. Even if there are data showing that shRNA can be used in mice, we are still a long way from its application in human cancer therapy, because serious problems remain, including biodistribution and clearance of nanoparticles following systemic delivery of shRNA-expressing vectors.     

脊髓损伤后两种结构型一氧化氮合酶基因表达的变化

目的探讨大鼠脊髓损伤后两种结构型一氧化氮合酶(cNOS)mRNA表达的变化.方法以Nystrom方法建立大鼠脊髓压迫伤模型,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定伤段脊髓组织神经型及诱导型NOS(nNOS,eNOS)mRNA的表达情况.结果脊髓压迫伤后nNOSmRNA及eNOSmRNA表达均增强,伤后6h达到高峰,eNOSmRNA表达增强更明显.结论脊髓损伤后结构型NOSmRNA的表达主要在伤后早期增强,不同的结构型NOSmRNA表达增强的程度不同.     

过表达大鼠TIPE2基因重组腺病毒载体的构建

背景：TIPE2抗炎蛋白,通过对T细胞受体（TCR）和T细胞TOLL样受体信号途径实行负向调节,从而对适应性免疫和固有免疫起到负性调控作用,有效地维持机体内环境的稳定。目的：使用人工合成腺病毒载体构建能过表达大鼠TIPE2基因的重组腺病毒。方法：利用RT-PCR的方法,从大鼠淋巴细胞中扩增出大鼠TIPE2基因,克隆到穿梭质粒pShuttle-clontech的表达框中,然后将包含TIPE2的完整表达框,进一步亚克隆到黑猩猩来源的腺病毒包装载体AdC68,转染HEK 293A细胞,包装出重组腺病毒。并以其感染HEK293A细胞,采用western blotting方法检测TIPE2基因的表达水平。结果与结论：PCR扩增、酶切鉴定和测序结果表明,所获取的cDNA为TIPE2的蛋白编码基因,western blotting结果表明,重组腺病毒能可高效表达TIPE2基因。说明成功完成AdC68-TIPE2重组腺病毒的构建,该腺病毒载体,能稳定表达大鼠TIPE2基因。