黄芪甲苷对高糖环境下脂肪干细胞衰老的延缓作用

目的 探讨黄芪甲苷（astragalosideⅣ，Ast）减缓高糖环境下人脂肪间充质干细胞（human adipose-derived stem cells,hADSCs）衰老的作用。方法 通过用含不同浓度葡萄糖的培养基培养hADSCs，筛选出最适高葡萄糖浓度；用不同浓度的Ast干预高糖环境下的hADSCs，筛选出最适Ast干预浓度。将hADSCs分为4组：对照组用含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养；甘露醇组用含5.5 mmol/L葡萄糖和19.5 mmol/L甘露醇的培养基培养；高糖组用含最适高浓度葡萄糖的培养基培养；Ast组用含最适高浓度葡萄糖和最适浓度Ast的培养基培养。4组均培养72 h，通过SA-β-Gal染色观察细胞衰老，AnnexinⅤ-FITC/PI检测凋亡；qRT-PCR及Western印迹检测hADSCs中p16、Pink1、Parkin、LC3(LC3Ⅱ/Ⅰ)及p62的表达情况；透射电镜观察线粒体及自噬小体情况。结果 最适高葡萄糖浓度为25 mmol/L，最适Ast干预浓度为20 mg/L。AnnexinⅤ-FITC/PI检测显示，与对照组比较，高糖组hAD...     

百草枯致人肾小管上皮细胞凋亡及抗凋亡的PCR基因芯片研究

目的:从转录组学角度对人肾小管上皮细胞的凋亡及抗凋亡基因表达变化机制作初步探讨。方法:人肾小管上皮细胞体外培养,用CCK8试剂盒检测百草枯中毒对人肾小管上皮细胞的毒性作用,测定半数有效剂量的浓度。实验组使用一定浓度百草枯处理人肾小管上皮细胞,对照组使用无血清培养基,均培养24小时。使用光镜观察,并用流式细胞仪分析确定凋亡存在,收集两组细胞提取总RNA。采用人凋亡信号通路PCR芯片检测两组细胞的相关基因表达情况,并使用qPCR验证差异基因CASP5、CD154、Bcl-2A1的表达情况。结果:百草枯可致人肾小管上皮细胞的CASP5凋亡基因及CD154和Bcl-2A1抗凋亡基因表达升高(P0.05);用qPCR验证的结果与上述结果趋势一致。结论:CASP5可能在百草枯致人肾小管上皮细胞凋亡的过程中发挥其促凋亡的作用,而CD154及Bcl-2A1可能在百草枯致人肾小管上皮细胞抗凋亡相关的机制发挥作用。     

骨髓间充质干细胞移植对顺铂诱导的急性肾损伤的保护作用

目的探讨外源性骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对顺铂诱导的急性肾损伤的保护作用。方法取C57BL/6小鼠骨髓,梯度离心法分离MSCs,采用PKH-26标记。24只雄性小鼠建立顺铂诱导的肾损伤模型后随机分为正常组,对照组和移植组,移植组于顺铂注射后24 h经尾静脉注入MSC,对照组注入等量生理盐水。于术后3 d处死小鼠,留取血标本,观察血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）水平。留取肾组织,荧光显微镜及HE染色方法观察移植MSC在肾组织中的分布及肾组织结构。结果术后第3天,移植组小鼠血清BUN,血清Cr水平明显低于生理盐水对照组;HE染色肾小管坏死和管型在移植组小鼠也明显低于生理盐水对照组。结论 MSC移植可促进急性肾损伤的修复。     

骨髓间充质干细胞移植对顺铂诱导的急性肾损伤的保护作用

目的探讨外源性骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对顺铂诱导的急性肾损伤的保护作用。方法取C57BL/6小鼠骨髓,梯度离心法分离MSCs,采用PKH-26标记。24只雄性小鼠建立顺铂诱导的肾损伤模型后随机分为正常组,对照组和移植组,移植组于顺铂注射后24 h经尾静脉注入MSC,对照组注入等量生理盐水。于术后3 d处死小鼠,留取血标本,观察血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平。留取肾组织,荧光显微镜及HE染色方法观察移植MSC在肾组织中的分布及肾组织结构。结果术后第3天,移植组小鼠血清BUN,血清Cr水平明显低于生理盐水对照组;HE染色肾小管坏死和管型在移植组小鼠也明显低于生理盐水对照组。结论 MSC移植可促进急性肾损伤的修复。     

改良诱导方案诱导SD大鼠脂肪源性干细胞定向分化为软骨细胞

背景:软骨组织工程是骨科研究的热点,在种子细胞的研究上由于软骨细胞存在老化现象更多的研究集中在干细胞向软骨细胞分化上.分化条件经历单细胞因子、联合细胞因子及贯续细胞因子的应用.目的:观察改良诱导方案诱导SD大鼠脂肪源性干细胞定向分化为软骨细胞的能力.设计、时间及地点;观察性实验,于2008-06/12在遵义医学院珠海校区中心实验室完成.I材料:SPF级健康SD大鼠5只,鼠龄18～22 d,体质量约25g,用于脂肪干细胞的培养基扩增.方法:在无菌条件下从SD大鼠腹股沟区取皮下脂肪组织约3 g,Ⅰ型胶原酶消化后,1 000 r/min离心10 min,待细胞长满瓶底80%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化,按1:2或1:3比例传代培养.加入软骨诱导培养基14 d后阿新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测脂肪干细胞向软骨细胞的诱导分化.主要观察指标:流式细胞仪检测大鼠脂肪干细胞表面CD44、CD45和CD49d的表达.结果:SD大鼠脂肪组织分离培养出的细胞经流式细胞仪检测CD44、CD49d表达阳性,CD45表达阴性.加入软骨诱导培养基定向诱导72 h后,细胞生长缓慢,逐渐变成圆形,并渐渐有软骨结节形成;诱导分化2周后,阿新蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性.结论:SD大鼠脂肪组织能够分离培养出脂肪干细胞,生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,能向软骨细胞分化.     

蒲公英甾醇对顺铂诱导的急性肾损伤保护作用及其机制

目的 探讨蒲公英甾醇对顺铂诱导急性肾损伤抗炎作用及其相关机制.方法 将24只C57小鼠随机分为空白组、顺铂诱导的急性肾损伤模型组、模型加蒲公英甾醇治疗组.蒲公英甾醇预治疗24?h后,给予顺铂组和蒲公英甾醇治疗组一次性腹腔注射顺铂22?mg/kg,诱导急性肾损伤,72?h后取肾脏组织.分析各组小鼠血肌酐(Scr)、尿素氮...     

姜黄素和万古霉素对大鼠肾小管上皮细胞乳酸脱氢酶释放百分率及丙二醛的影响

目的探讨姜黄素和万古霉素对大鼠肾小管上皮细胞乳酸脱氢酶释放百分率及丙二醛的影响。方法将健康SD大鼠的肾小管上皮细胞经分离后原代培养,根据细胞培养液中所含药物不同,分为空白对照组、姜黄素+万古霉素试验组、姜黄素试验组和万古霉素试验组,4 h后测定乳酸脱氢酶(LDH)释放百分率,同时考察各组在0 h、6 h、12 h、24 h、30 h、36 h、48h的丙二醛(MDA)含量变化。结果 LDH释放百分率为万古霉素试验组>姜黄素+万古霉素试验组>姜黄素试验组,差异均有统计学意义(P<0.05);细胞培养上清液MDA含量在姜黄素+万古霉素试验组与万古霉素试验组中的含量均随着时间延长而增高,且从24 h开始,在相同时间里,万古霉素试验组中的MDA含量增高更显著(P<0.05)。结论万古霉素对大鼠肾小管上皮细胞可能具有肾损伤作用,而姜黄素对其肾损伤具有改善作用,其机制可能与降低氧化应激反应有关。     

脂肪源性干细胞对造血干/祖细胞支持作用的研究进展

机体的正常造血依赖造血干/祖细胞(HSPC)的增殖分化,以及支持其生长发育、构成骨髓造血微环境基质细胞的间充质干细胞(MSC)的作用.目前常用的促进造血的MSC主要来源于骨髓,但从骨髓中获取MSC受到了数量、取材及分离纯化的限制.与骨髓相比,脂肪组织分布广泛、来源丰富、取材简单,并且含有数量更多的多能干细胞群,如脂肪干...     

尿毒症毒素对人肾小管上皮细胞外基质的影响及临床意义

目的 探讨尿毒症毒素对人肾小管上皮细胞外基质的影响及临床意义。方法 无菌收集40份尿毒症患者血清和20例正常人血清,培养及鉴定人肾小管上皮细胞株（HK-2）,采用消化法检测羟脯氨酸含量,ELISA方法检测纤连蛋白（FN）、金属蛋白酶-1（MMP-1）、金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）的蛋白分泌量,RT-PCR方法检测MMP-1、TIMP-1 mRNA的表达。结果 5％-20％浓度尿毒血清组胶原蛋白、FN分泌量均较正常对照组增高（P〈0．01）,且随着尿毒血清浓度的升高而增高,以分子量〉10000ku的组分增高最为显著（P〈0．01）。各浓度尿毒血清组MMP-1／TIMP-1基因表达和蛋白分泌的比值均较正常对照组降低（P〈0．01）,且随着尿毒血清浓度的增高而降低,以分子量〉10000ku尿毒血清组降低最为显著,而分子量〈5000ku尿毒血清组较正常对照组增高（P〈0．01）。结论 慢性肾衰竭患者体内蓄积的尿毒症毒素可能通过促进人肾小管上皮细胞外基质的分泌,减少其降解,加速肾小管．间质纤维化的进展,其中以分子量〉10000ku的尿毒症毒素作用最为显著。     

骨髓干细胞移植对急性缺血性肾损伤大鼠肾小管细胞活性的影响

目的观察和分析骨髓干细胞(BMSCs)移植对大鼠急性缺血性肾损伤后肾小管上皮细胞坏死、变性及增殖的影响。方法 Percoll密度梯度离心法分离获取BMSCs。制作大鼠急性缺血性肾损伤模型,通过下腔静脉进行BMSCs移植。分别于缺血再灌注后24h、48h、7d、14d获取肾脏标本,HE染色作肾组织学观察,免疫组织化学染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果缺血再灌注后24h、48h,BMSCs移植组肾小管上皮细胞未见坏死及明显变性,而对照组细胞坏死及变性明显;缺血再灌注后7d、14d,BMSCs移植组和对照组肾小管上皮均无细胞坏死,但对照组可见部分细胞胞浆肿胀及间质内少许红细胞;BMSCs移植组较对照组肾小管上皮PCNA阳性细胞数增多,组间差异具统计学意义。结论 BMSCs移植可减少急性缺血性肾损伤的肾小管上皮细胞变性、坏死,而促进肾小管上皮细胞的增殖。     

骨髓间充质干细胞体内分化为肾小管上皮细胞的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能否在体内分化为肾小管上皮细胞。方法取SD雄性大鼠胫、股骨骨髓,密度梯度离心法分离MSCs,采用4,6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)进行标记。32只雌性SD大鼠复制缺血再灌注肾损伤模型后随机分为移植组和对照组,移植组于缺血45min后经下腔静脉注入用DAPI标记的MSCs,对照组注入等量的生理盐水。分别于术后1d、2d、3d、4d处死大鼠,留取肾组织,荧光显微镜观察移植的MSCs在肾组织中的分布,采用能与肾小管内腔壁特异结合的蓖麻血凝素(Ricinus communis agglurinin,RCA)对迁移入肾脏的MSCs分化状况进行鉴定。结果移植组术后第三天肾组织内可见DAPI标记细胞,第四天DAPI标记细胞明显增多(P<0.05),且多数DAPI标记细胞能结合RCA。对照组没有发现DAPI标记细胞。结论移植的外源性MSCs能够迁移、定居于肾组织中并分化为肾小管上皮细胞。     

体外分离培养人源性脂肪间充质干细胞及其鉴定

目的 体外分离培养人皮下脂肪来源的细胞群,依据国际标准规定通过形态观察、免疫表型检测及多种分化潜能的鉴定证实体外获得的细胞群为脂肪来源的间充质干细胞.方法 采用0.1％胶原酶Ⅰ及0.25％胰酶双消化法进行细胞的体外分离,LG-DMEM培养基加入体积分数为10％胎牛血清,于37℃、5％ CO2的饱和湿度条件下培养,待细胞生长至70％ ～ 80％融合时消化传代扩增.通过倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞免疫表型表达;取第3代细胞,于培养基中分别加入成骨及成脂诱导剂进行定向诱导分化,并对诱导后的细胞染色鉴定.结果 分离培养的细胞群呈长梭状,漩涡样贴壁生长;流式细胞仪检测P2代细胞,其中CD73,CD105,C90,CD44,CD29及CD49d呈阳性表达,而CD14,CD34,CD45,HLA-DR及CD106呈阴性表达;成骨诱导3周后,茜素红染色、VON-KOSSA染色及细胞碱性磷酸酶染色都呈阳性;成脂诱导2周后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论 胶原酶胰酶双消化法从脂肪组织中分离获得的细胞可贴壁生长;流式细胞仪检测证实细胞表达与间充质干细胞相符的免疫表型;定向诱导后具有成骨及成脂分化能力;符合间充质干细胞的特性.     

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

背景：由于人胎盘来源的间充质干细胞具有多方面的优点,近年来已成为干细胞研究的热点。目的：分析鉴定羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的生物学特性,探讨其作为皮肤种子细胞在三维气液培养构建组织工程皮肤中的应用情况。方法：用胰酶胶原酶多步消化法获取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞,通过流式细胞术、反转录-聚合酶链反应和免疫荧光染色技术,鉴定两种细胞的表面分子标记、干细胞特性、与皮肤角质形成细胞的相似性,并利用两种细胞为种子细胞以鼠Ⅰ型胶原为基质进行三维气液培养。结果与结论：①流式细胞术检测体外培养羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞均高表达CD90、CD73、CDl05,不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。②反转录聚合酶链反应检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和NANOG,羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和KLF4,两种细胞均有干细胞特性。③反转录-聚合酶链反应检测羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8,羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8,免疫荧光染色见羊膜上皮细胞表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14,说明羊膜上皮细胞与皮肤角质形成细胞更具相似性,在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。④利用两种细胞成功构建组织工程皮肤,苏木精-伊红染色切片显示其具有一定的皮肤结构,且羊膜上皮细胞发生了初步分化。以上结果说明羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞通过三维培养构建人皮肤组织是可行的。     

低氧时脂肪间充质干细胞如何向跟腱细胞分化

背景：脂肪间充质干细胞在跟腱组织工程再生领域越来越受到重视,研究其诱导分化的有利环境（氧体积分数）尤为必要。 目的：将脂肪间充质干细胞与跟腱细胞在不同氧体积分数条件下间接共培养,比较氧体积分数对脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化能力的影响。 方法：无菌条件下获取SD大鼠跟腱细胞。SD大鼠脂肪间充质干细胞直接购买,经培养传至第1代后,与跟腱细胞一起在常氧（体积分数20%）和低氧（体积分数2%）条件下经Transwel 间接共培养体系共培养。在培养7,14和21 d ,实时荧光定量 PCR 检测跟腱细胞的特异指标胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ, Tenomodulin , Thrombospondin-4,Scleraxis 基因相对表达量,免疫荧光染色法检测胶原蛋白Ⅰ和Thrombospondin-4蛋白表达量。 结果与结论：脂肪间充质干细胞与跟腱细胞经间接共培养后,低氧组检测到的跟腱细胞的相关特异指标在基因和蛋白水平上表达水平均高于常氧组。提示氧体积分数可显著影响脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的潜能,低氧是脂肪间充质干细胞向跟腱细胞分化的有利条件之一。     

羟基红花黄色素A对人肾小管上皮细胞冷缺氧/复氧凋亡的影响

目的:探讨羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)预处理组对人肾小管上皮细胞(HK2细胞)冷缺氧/复氧(冷H/R)损伤导致的细胞凋亡的影响。方法:HK2细胞株消化传代后采用计算机随机方法分为sham组(对照组)、冷缺氧/复氧组(冷H/R组,细胞冷缺氧4 h,复氧4 h)、HSYA预处...     

Differentiation of porcine mesenchymal stem cells into epithelial cells as a potential therapeutic application to facilitate epithelial regeneration

Epithelial denudation is one of the characteristics of chronic asthma. To restore its functions, the airway epithelium has to rapidly repair the injuries and regenerate its structure and integrity. Mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into many cell lineages. However, the differentiation of MSCs into epithelial cells has not been fully studied. Here, we examined the differentiation of MSCs into epithelial cells using three different media compositions with various growth supplementations. The MSCs were isolated from porcine bone marrow by density gradient centrifugation. The isolated MSCs were CD11^–CD34^–CD45^– CD44⁺CD90⁺ and CD105⁺ by immunostaining and flow cytometry. MSCs were stimulated with EpiGRO (Millipore), BEpiCM (ScienCell) and AECGM (PromoCell) media for 5 and 10 days, and epithelial differentiation was assessed by qPCR (keratin 14, 18 and EpCAM), fluorometry (cytokeratin 7‐8, cytokeratin 14‐15‐16‐19 and EpCAM), western blot analysis (pancytokeratin, EpCAM) and flow cytometry (cytokeratin 7‐8, cytokeratin 14‐15‐16‐19 and EpCAM). The functional marker MUC1 was also assessed after 10 days of air–liquid interface (ALI) culture in optimized media. Cells cultured in BEpiCM containing fibroblast growth factor and prostaglandin E₂ showed the highest expression of the epithelial markers: CK7‐8 (85.90%); CK‐14‐15‐16‐19 (10.14%); and EpCAM (64.61%). The cells also expressed functional marker MUC1 after ALI culture. The differentiated MSCs when cultured in BEpiCM medium ex vivo in a bioreactor on a decellularized trachea for 10 days retained the epithelial‐like phenotype. In conclusion, porcine bone marrow‐derived MSCs demonstrate commitment to the epithelial lineage and might be a potential therapy for facilitating the repair of denuded airway epithelium. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.     

不同方式透析前、后尿毒症血清对肾小管上皮细胞TGF-β1表达的影响

目的探讨不同方式透析前、后尿毒血清对肾小管上皮细胞TGF-β1表达的影响。方法24例尿毒症透析患者随机分为血液透析（HD）、高通量血液透析（HFHD）、血液透析滤过（HDF）三组,分别于透析前后取患者血清,二乙酰一肟法测定透析前后尿素比值,评价三种透析方式的充分性;用透析前后患者血清刺激体外培养的肾小管上皮细胞株（HK-2细胞）,然后用RT-PCR法检测HK-2细胞TGF-β1 mRNA表达,ELISA法检测HK-2细胞培养上清TGF-β1水平。结果三种透析方式的Kt/V值均大于1.2,达到充分透析的要求;HDF组透析后尿毒血清较透析前血清促HK-2细胞表达和分泌TGF-β1的作用减弱（P〈0.05）;而HD和HFHD组透析后与透析前比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论HDF能更有效地清除尿毒血清中致前纤维化细胞因子表达的毒素,由此推测HDF可能更有效地延缓尿毒症患者肾间质纤维化的进展。     

肾小管上皮细胞炎性损伤中的转分化-获得组织干细胞潜能的研究

目的：研究肾脏纤维化过程中转分化的肾小管上皮细胞获得的组织干细胞潜能。方法体外建立局部肾素-血管紧张素（AngⅡ）系统炎性环境下肾小管上皮细胞（NRK-52E）转分化的细胞模型,观察其胚胎肾发育基因 Pax2和组织干细胞表面标志 CD133分子的表达和变化情况。结果局部高浓度 AngⅡ可刺激 NRK-52E 细胞表达 Pax2和 CD133分子,其作用呈剂量和时间依赖关系。结论炎性损伤导致肾小管上皮细胞转分化后可获得组织干细胞潜能。