携带绿色荧光蛋白基因的神经上皮干细胞移植治疗帕金森病

背景：神经干细胞异体移植的细胞替代疗法是治疗帕金森病的热点,但先前的研究重点关注移植细胞的形态学信息和动物的行为改变,作用机制尚未明确。目的：通过检测神经上皮干细胞脑内移植后帕金森病模型大鼠的旋转行为改变与其脑内多巴胺含量变化的关系,分析神经上皮干细胞移植治疗帕金森病的作用机制。方法：建立帕金森病大鼠模型,造模后分为2组,实验组将携带绿色荧光蛋白基因的胚胎神经上皮干细胞克隆后移植到帕金森病模型大鼠的纹状体内,对照组注射等量的生理盐水。取材后检测移植细胞的存活与分化,对比分析大鼠行为改变与其脑内多巴胺含量变化的关系。结果与结论：移植后实验组大鼠的旋转行为明显改善,移植细胞在宿主脑内存活良好,并分化出TH阳性细胞。实验组大鼠脑内多巴胺的含量明显高于对照组。提示携带绿色荧光蛋白基因的神经上皮干细胞脑内移植后帕金森病模型大鼠的旋转行为改善与其脑内多巴胺含量的变化成正比,分化出有功能的TH阳性细胞可能是神经干细胞移植治疗帕金森病的基本机制。     

神经前体细胞纹状体注入对帕金森病模型大鼠行为的影响

背景：胚胎干细胞经诱导产生神经前体细胞，再进行脑内移植，依旧具备增殖与分化的潜能，与宿主神经组织整合，使其有强的可塑性，这将有助于帕金森病的治疗效果观察。 目的：观察小鼠胚胎干细胞分化为神经前体细胞，以及定点移植对改进型帕金森病大鼠模型行为学的影响。设计：随机对照动物实验。单位：解放军第三军医大学基础医学部生理学教研室和神经生物学教研室。材料：健康成年Wistar大鼠50只，随机分为实验组45只，对照组5只。 方法：①实验组大鼠黑质致密部与中脑腹侧背盖区两点各注射6-羟基多巴5μL（2g／L）制备帕金森病大鼠模型，对照组注射生理盐水5μL／点，术后1周开始行为学检测，测定模型成功率，1次／周，连续7周。②选取成功帕金森病模型大鼠20只实施纹状体神经前体细胞移植，剂量为2μL[细胞悬液记数为（5～8）&;#215;10^6个／μL]。另取5只模型大鼠纹状体注射生理盐水2μL为生理盐水对照组。主要观察指标：①帕金森病模型成功率。②神经前体细胞移植对帕金森病模型大鼠旋转次数的影响。③移植的神经前体细胞在体分布，存活与分化情况。 结果：①6周后实验组45只大鼠中共有33只（73％）达到成功帕金森病模型标准。②细菌培养皿上用无血清培养基培养形成胚胎体5d后，约85％胚胎干细胞分化为Nestin阳性的神经前体细胞。③神经前体细胞脑内移植后的帕金森病大鼠的旋转次数明显少于生理盐水对照组。多数移植的神经前体细胞存活，部分分化为TH阳性神经元。 结论：小鼠胚胎干细胞诱导的神经前体细胞脑内移植后，分化为TH阳性神经元，帕金森病大鼠旋转次数明显减少。     

止颤汤干预神经干细胞移植帕金森病大鼠脑内多巴胺及其代谢产物的变化

背景：如何促进脑内多巴胺含量的增加以及减少多巴胺的代谢,是治疗帕金森病的热点所在。目的：从多巴胺代谢途径角度观察止颤汤对神经干细胞移植帕金森病大鼠的脑黑质中多巴胺及其代谢产物含量的变化。方法：以大鼠脑立体定位和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶建立帕金森病大鼠模型。应用高效液相色谱法测定帕金森病大鼠中脑多巴胺及其代谢产物的含量。结果与结论：止颤汤可以提高神经干细胞移植后帕金森病大鼠中脑多巴胺及其代谢产物双羟苯乙酸的含量,但对代谢产物高香草酸无明显影响。通过促进帕金森病大鼠干细胞移植后神经干细胞的存活,使之定向分化为多巴胺能神经元并分泌多巴胺,同时抑制多巴胺分解达到治疗作用。     

胚胎干细胞移植治疗脑血管疾病

背景：胚胎干细胞移植是否能够成为脑血管疾病治疗有效的方法已成为目前研究的热点。目的：探讨胚胎干细胞分化神经前体细胞移植治疗脑血管疾病的效果及可行性。方法：分别建立帕金森病、缺血性脑损伤以及血管性痴呆大鼠模型,并进行胚胎干细胞体外培养,诱导分化为神经前体细胞,将胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入相应脑血管疾病模型大鼠脑内,观察脑血管病变大鼠的旋转行为学变化、脑组织病理变化以及海马结构的变化和神经细胞数目的变化。结果与结论：胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入帕金森病大鼠脑内后,阿朴吗啡诱发的旋转次数逐渐减少,呈下降趋势,纹状体多巴胺的含量明显增高。胚胎干细胞分化神经前体细胞移植入缺血性脑损伤大鼠脑内后,能够长期存在于脑内,并迁移、分布于受损的海马,构成海马结构,进一步分化为神经元,并且受损海马内的神经细胞数量明显增加。说明移植的胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的胚胎干细胞可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能,增强神经的可塑性,诱导自身定向迁移并分化为成熟神经元。     

神经前体细胞纹状体注入对帕金森病模型大鼠行为的影响

背景:胚胎干细胞经诱导产生神经前体细胞,再进行脑内移植,依旧具备增殖与分化的潜能,与宿主神经组织整合,使其有强的可塑性,这将有助于帕金森病的治疗效果观察。目的:观察小鼠胚胎干细胞分化为神经前体细胞,以及定点移植对改进型帕金森病大鼠模型行为学的影响。设计:随机对照动物实验。单位:解放军第三军医大学基础医学部生理学教研室和神经生物学教研室。材料:健康成年Wistar大鼠50只,随机分为实验组45只,对照组5只。方法:①实验组大鼠黑质致密部与中脑腹侧背盖区两点各注射6-羟基多巴5μL(2g/L)制备帕金森病大鼠模型,对照组注射生理盐水5μL/点,术后1周开始行为学检测,测定模型成功率,1次/周,连续7周。②选取成功帕金森病模型大鼠20只实施纹状体神经前体细胞移植,剂量为2μL[细胞悬液记数为(5～8)×106个/μL]。另取5只模型大鼠纹状体注射生理盐水2μL为生理盐水对照组。主要观察指标:①帕金森病模型成功率。②神经前体细胞移植对帕金森病模型大鼠旋转次数的影响。③移植的神经前体细胞在体分布,存活与分化情况。结果:①6周后实验组45只大鼠中共有33只(73%)达到成功帕金森病模型标准。②细菌培养皿上用无血清培养基培养形成胚胎体5d后,约85%胚胎干细胞分化为Nestin阳性的神经前体细胞。③神经前体细胞脑内移植后的帕金森病大鼠的旋转次数明显少于生理盐水对照组。多数移植的神经前体细胞存活,部分分化为TH阳性神经元。结论:小鼠胚胎干细胞诱导的神经前体细胞脑内移植后,分化为TH阳性神经元,帕金森病大鼠旋转次数明显减少。     

鼠胚神经干细胞移植对帕金森模型大鼠的治疗作用

背景:干细胞移植是治疗帕金森的有潜力的方法之一。目的:观察神经干细胞纹状体移植对帕金森模型大鼠旋转行为及脑内多巴胺含量的影响。方法:采用6-羟基多巴胺定点注射毁损黑质纹状体的方法构建帕金森大鼠模型;向造模成功的大鼠纹状体内分别移植1×106(共计20μL)的第3代胚鼠神经干细胞或等量生理盐水。结果与结论:神经干细胞移植后,帕金森大鼠的旋转行为明显改善。干细胞移植后3周,免疫组化检测发现移植干细胞的帕金森大鼠脑黑质部位酪氨酸羟化酶阳性细胞数增多,纹状体内可见酪氨酸羟化酶阳性细胞;荧光显微镜下观察发现Hoechst33324d标记神经干细胞在移植针道附近最为密集,并向远隔部位迁徙。干细胞移植后8周,高效液相色谱检测显示移植干细胞的帕金森大鼠纹状体内多巴胺含量明显增高(P<0.01)。说明神经干细胞脑内移植能够减轻6-羟基多巴胺引起的大鼠中脑黑质多巴胺能神经元的损伤,改善大鼠的旋转行为。     

神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病效果比较

目的:目前对于体外诱导分化的多巴胺能神经元的生物学功能、体内存活状况,以及与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的疗效比较方面尚缺乏深入的研究.观察神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠的作用,并与胚胎中脑多巴胺能神经元组织移植治疗帕金森病大鼠的疗效进行比较.方法:实验于2006-06/2007-09在中山大学附属第一医院完成.①实验材料:健康成年雄性SD大鼠及孕14～15 d的SD大鼠由中山大学动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:在含表皮生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养液中培养胚胎大鼠中脑神经干细胞.经传代扩增后,在含白细胞介素1a、白细胞介素11、白血病抑制因子、胶质细胞源性神经营养因子的诱导分化液中向多巴胺能神经元分化,并进行免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测.参考Sauer和Lee等方法制备帕金森病大鼠模型,并将造模成功大鼠随机分组,每组9只:分化细胞组向每一坐标点注入1×1011 L-1神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元;胚胎中脑组注入 1×1011 L -1胚胎中脑多巴胺能神经元;手术对照组注入DMEM/F12细胞培养液.③实验评估:移植术后10、20、40、60 d诱发大鼠不对称旋转行为以观察治疗效果,并对移植区进行酪氨酸羟化酶免疫组织化学检测以了解移植细胞体内存活的情况.结果:①大鼠神经干细胞球在诱导分化液中呈贴壁生长,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出形态各异的细胞.免疫细胞化学染色显示,分化细胞中含有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞.流式细胞仪检测诱导分化6 d的细胞中酪氨酸羟化酶染色阳性细胞的比率为(16.7±2.8)%.②移植后20 d分化细胞组大鼠的不对称旋转行为开始明显下降(P < 0.05).移植后40 d和60 d,分化细胞组大鼠的旋转圈数与胚胎中脑组比较差异不显著(P > 0.05).③分化细胞组和胚胎中脑组大鼠纹状体移植区有酪氨酸羟化酶染色阳性细胞,多数细胞位于移植针道边缘.结论:神经干细胞诱导分化的多巴胺能神经元与胚胎中脑多巴胺能神经元移植治疗帕金森病大鼠具有相同的疗效.     

止颤汤干预神经干细胞移植帕金森病大鼠脑内多巴胺及其代谢产物的变化

背景:如何促进脑内多巴胺含量的增加以及减少多巴胺的代谢,是治疗帕金森病的热点所在.目的:从多巴胺代谢途径角度观察止颤汤对神经干细胞移植帕金森病大鼠的脑黑质中多巴胺及其代谢产物含量的变化.方法:以大鼠脑立体定位和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶建立帕金森病大鼠模型.应用高效液相色谱法测定帕金森病大鼠中脑多巴胺及其代谢产物的含量.结果与结论:止颤汤可以提高神经干细胞移植后帕金森病大鼠中脑多巴胺及其代谢产物双羟苯乙酸的含量,但对代谢产物高香草酸无明显影响.通过促进帕金森病大鼠干细胞移植后神经干细胞的存活,使之定向分化为多巴胺能神经元并分泌多巴胺,同时抑制多巴胺分解达到治疗作用.     

移植的神经干细胞在帕金森病模型小鼠脑内的存活与分化

目的 观察移植的神经干细胞在帕金森病(PD)模型小鼠脑内的存活与分化。方法 C57BL／6小鼠皮下注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)造成PD模型。用5-溴尿嘧啶(BrdU)标记的神经干细胞分别移植到模型鼠的一侧或两侧纹状体。用酪氨酸羟化酶免疫荧光评价MPTP对黑质多巴胺能神经元的毒性。用免疫组织化学和激光共聚焦鉴定移植的神经干细胞在体内的存活与分化。结果 MPTP使黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞显著减少；在细胞移植的纹状体内发现有明显散在分布的BrdU阳性细胞，表明移植的神经干细胞已经存活；激光共聚焦显示部分BrdU阳性细胞已分化为酪氨酸羟化酶阳性细胞。结论 移植的神经干细胞能在PD模型小鼠纹状体存活，并可分化出特定的多巴胺能神经元。     

神经干细胞移植对帕金森病鼠纹状体多巴胺含量的影响

目的观察神经干细胞定向移植后对帕金森鼠纹状体多巴胺含量的影响,证实神经干细胞移植治疗的可行性。方法建立帕金森病模型大鼠以及体外培养神经干细胞,然后将神经干细胞悬液立体定向移植到帕金森病模型鼠黑质纹状体区,测定纹状体的多巴胺含量,并与生理盐水组和非移植组相比。结果神经干细胞移植后帕金森病模型鼠纹状体多巴胺含量(346±26)μg/g与生理盐水组(58±56)μg/g和非移植组(72±60)μg/g比较明显增多,经t检验差异有显著性意义(t=13.99,12.57,P<0.05)。结论神经干细胞移植能减轻6-羟基多巴胺对黑质纹状体多巴胺能神经元的损伤。     

X盒结合蛋白1转染神经干细胞移植帕金森大鼠黑质中相关递质及核蛋白的表达

背景：既往研究发现,X盒结合蛋白1基因可以转染至神经干细胞中并稳定过表达X盒结合蛋白1,转染后的神经干细胞移植对脑梗死的治疗作用优于普通神经干细胞。目的：通过测定转染后神经干细胞移植对帕金森大鼠模型黑质内单胺类递质和α-突触核蛋白水平的影响,研究转染后的神经干细胞移植对帕金森病的治疗作用。方法：将27只帕金森病大鼠随机数字表法均分为3组。对照组侧脑室内移植PBS,神经干细胞组移植空白神经干细胞悬液,转染组移植X盒结合蛋白1基因修饰神经干细胞悬液。分别于移植后7,14,21,28d对各组大鼠进行诱导旋转实验观察神经功能：Westernblot检测α-突触核蛋白水平;黑质切片后免疫组化染色测酪氨酸羟化酶（＋）神经细胞。结果与结论：转染组大鼠黑质内α-突触核蛋白表达量降低,酪氨酸羟化酶（＋）神经细胞数高于神经干细胞组和对照组,且大鼠旋转实验中旋转行为改善。表明在帕金森病中,X盒结合蛋白1转染的神经干细胞分化为多巴胺能神经元的分化率高,转染后可降低α-突触核蛋白的聚集,从而改善帕金森症状起到治疗目的。     

小胶质细胞介导帕金森病模型小鼠的炎症损伤术

背景：研究表明帕金森病的黑质纹状体存在小胶质细胞的激活,但其释放炎症因子在帕金森病发病过程中的作用尚不明确。目的：观察小胶质细胞激活所释放的两种炎症因子整合素a及肿瘤坏死因子a在小鼠黑质部位的蛋白表达及酪氨酸羟化酶的礞白表达。方法：将C57BL／6小鼠经腹腔注射百草枯（10mg／kg）,设为巾f{金森病模型组,并设置对照组,观察两组小鼠行为活动。用高效液相法测定小鼠黑质纹状体多巴胺的含量。采用免疫组织化学法检测黑质部位酪氰酸羟化酶、整合索a及肿瘤坏死因子a蛋白表达。结果与结论：百草枯可造成帕金森病模型组小鼠运动减少,并伴有运动迟缓、震颤、探嗅、峰毛及尾巴硬类似于帕金森病样的行为表现,并且脑内黑质纹状体多巴胺含量降低（P〈0．05）,酪氨酸羟化酶蛋白表达降低（P〈0．05）,整合索a和肿瘤坏死因子a蛋白表达增N（P〈O．05）,肿瘤坏死因子a在模型组小鼠黑质纹状体有阳性表达,且主要分布在小胶质细胞上。结果表明小胶质细胞介导的炎症损伤参与了帕金森多巴胺能神经元的损害过程。     

骨髓基质多能成体祖细胞移植治疗大鼠帕金森病

背景:帕金森病是一种常见的神经系统变性疾病,胚胎干细胞移植治疗能缓解帕金森病的症状,但受技术和伦理学方面制约。与胚胎干细胞比较,骨髓基质多能成体祖细胞的许多特性也使其逐渐成为细胞移植治疗中理想的细胞资源之一。目的:探讨骨髓基质分离的多能成体祖细胞通过系统移植方式进入大鼠脑组织内并修复受损的神经功能。设计:随机对照实验。单位:武汉市第一医院神经内科。材料:实验于2003-10/2005-03在华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科完成。选用健康SD大鼠80只,体质量180～200g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。方法:制作实验性帕金森病大鼠模型,将在体外纯化、增殖和已用5-溴-2-脱氧尿苷处理过的骨髓基质多能成体祖细胞通过尾静脉注入帕金森病大鼠体内。3个月后,对移植大鼠采用免疫组化技术、RT-PCR、免疫电镜、行为学评定等方法鉴定移行入大鼠脑组织内的骨髓基质多能成体祖细胞、其分化的神经元样细胞以及神经功能的修复。主要观察指标:①行为学观察结果。②免疫组织化学染色结果。结果:骨髓基质多能成体祖细胞能移行入大鼠脑组织内并在中脑黑质和纹状体区分化为神经元样细胞;6-羟多巴诱导的大鼠行为损伤有明显恢复;多巴胺-β-羟化酶、神经生长因子和多巴胺转运体mRNA的表达水平明显升高;电镜下观察到骨髓基质多能成体祖细胞所分化的神经细胞与其它神经细胞形成突触联系。结论:骨髓基质多能成体祖细胞能在大鼠脑组织内分化为多巴胺能神经细胞并发挥相应的神经功能。     

小胶质细胞介导帕金森病模型小鼠的炎症损伤

背景:研究表明帕金森病的黑质纹状体存在小胶质细胞的激活,但其释放炎症因子在帕金森病发病过程中的作用尚不明确。目的:观察小胶质细胞激活所释放的两种炎症因子整合素α及肿瘤坏死因子α在小鼠黑质部位的蛋白表达及酪氨酸羟化酶的蛋白表达。方法:将C57BL/6小鼠经腹腔注射百草枯(10mg/kg),设为帕金森病模型组,并设置对照组,观察两组小鼠行为活动。用高效液相法测定小鼠黑质纹状体多巴胺的含量。采用免疫组织化学法检测黑质部位酪氨酸羟化酶、整合素α及肿瘤坏死因子α蛋白表达。结果与结论:百草枯可造成帕金森病模型组小鼠运动减少,并伴有运动迟缓、震颤、探嗅、竖毛及尾巴硬类似于帕金森病样的行为表现,并且脑内黑质纹状体多巴胺含量降低(P<0.05),酪氨酸羟化酶蛋白表达降低(P<0.05),整合素α和肿瘤坏死因子α蛋白表达增加(P<0.05),肿瘤坏死因子α在模型组小鼠黑质纹状体有阳性表达,且主要分布在小胶质细胞上。结果表明小胶质细胞介导的炎症损伤参与了帕金森多巴胺能神经元的损害过程。     

酪氨酸羟化酶修饰人脐血间充质干细胞移植帕金森病大鼠纹状体内的多巴胺含量

背景：研究表明,干细胞治疗比药物治疗更接近于恢复患者的生理模式,细胞移植治疗已逐渐成为一种趋势。目的：观察酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞移植后帕金森病大鼠纹状体内多巴胺含量的变化。 方法：将酶切鉴定后的新构建质粒pEGFP-C2-TH经电穿孔法转染第3代脐血间充质干细胞,注射到帕金森病大鼠右侧脑室,对照组注入PBS。观察移植细胞在大鼠脑组织内的迁移情况,高效液相色谱仪检测大鼠纹状体内多巴胺的含量。 结果与结论：质粒pEGFP-C2-TH转染的脐血间充质干细胞移植后8周,细胞逐渐向脑室转移,12周时迁移至皮质,可表达酪氨酸羟化酶抗原,且实验组多巴胺含量明显高于对照组（P＜0.05）。结果表明酪氨酸羟化酶修饰的脐血间充质干细胞经脑室移植对帕金森病大鼠具有明显的治疗作用。     

小胶质细胞介导帕金森病小鼠的氧化应激损伤

背景：研究证实,小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶可增加多巴胺能神经元对百草枯的摄取。造成百草枯对多巴胺能神经元的特异性杀伤作用。帕金森病的黑质纹状体存在小胶质细胞的激活,但其产生氧化应激作用机制尚不明确。目的：建立帕金森病小鼠模型,观察小胶质细胞介导的氧化应激损伤在帕金森病中的作用。方法：36只C57BL／6小鼠随机分为帕金森病模型组和对照组,每组18只。以腹腔注射百草枯10mg／kg为模型组,等体积生理盐水为对照组,分别观察小鼠行为活动改变。采用高效液相法测定两组小鼠黑质纹状体多巴胺的含量及免疫组织化学方法检测两组小鼠黑质部位酪氨酸羟化酶、mac-1蛋白表达,同时应用化学比色法测定两组小鼠黑质部位超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛水平的变化。结果与结论：模型组小鼠自发行为活动较对照组减少（P〈0．05）。高效液相法检测模型组小鼠黑质纹状体多巴胺含量及酪氨酸羟化酶蛋白的表达均显著低于对照组（P〈0．05）,mac-1蛋白表达高于对照组（P〈0．05）。模型组超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶活性较对照组均显著下降（P〈0．05）,丙二醛水平较对照组显著升高（P〈0．05）。提示中脑黑质部位小胶质细胞的激活致使氧化应激反应增强及抗氧化保护作用减弱可能是引起帕金森病发病的重要机制。