骨髓间充质干细胞Notch1信号通路异常与骨髓瘤骨病

背景:多发性骨髓瘤骨病的发病机制目前尚未完全明确,骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化障碍参与其中,而Notch1信号通路在间充质干细胞的增殖分化中起重要作用。目的:探讨Notch1信号通路在多发性骨髓瘤骨病中的作用。方法:分离培养多发性骨髓瘤患者和正常人骨髓间充质干细胞,Real-time PCR和Western blot检测成骨诱导分化前后Notch1和成骨基因Runx2的表达,以及Von Kossa染色鉴定钙质沉积程度。在多发性骨髓瘤患者间充质干细胞成骨诱导分化过程中,加入Notch1信号通路抑制剂DAPT和安慰剂,48 h后real-time PCR和western blot鉴定Notch1信号通路下游分子Hes1和成骨指标Runx2表达,2周后Von Kossa染色鉴定钙质沉积程度。结果与结论:成骨诱导48 h后,间充质干细胞的Notch1表达减低,但是骨髓瘤患者间充质干细胞的降低幅度小于正常对照间充质干细胞;48 h后Runx2的表达在骨髓瘤患者间充质干细胞的表达明显弱于正常对照间充质干细胞;2周后,Von Kossa染色鉴定钙质沉积程度,骨髓瘤患者间充质干细胞明显弱于正常对照间充质干细胞;48 h后Hes1表达在DAPT组明显低于安慰剂组;而Runx2的表达在DAPT组明显高于安慰剂组。2周后DAPT组钙质沉积明显强于安慰剂组。实验说明多发性骨髓瘤患者的间充质干细胞中,Notch1信号通路失活缺陷可能抑制其向成骨细胞分化。     

骨髓瘤细胞抑制骨髓间充质干细胞向成骨细胞的转化

目的：多发性骨髓瘤患者的长期生存率没有得到提高，因此进一步明确多发性骨髓瘤的发病机制并寻找理想的治疗方法是当前研究的重要课题。实验观察多发性骨髓瘤细胞对骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能及对其表达核因子KB受体激活剂配体，骨保护蛋白的影响。 方法：选择2006—07／2007—06在苏州大学附属第二医院住院的7例多发性骨髓瘤患者，患者经骨髓细胞学检查、血液生化测定及免疫球蛋白定量分析等符合多发性骨髓瘤诊断标准。正常成人骨髓由苏州大学附属第二医院血液科研究生捐献。患者对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。实验方法：常规分离培养两种来源骨髓间充质干细胞，采用直接免疫荧光标记及流式细胞术分析其表面标志。观察两种来源骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养条件下向成骨细胞分化的潜能，并在诱导培养的第1天和3周时分别加入RPMI8266或XG7多发性骨髓瘤细胞株，于培养28d后行Von—Kossa及TRAP染色；多发性骨髓瘤细胞与正常骨髓间充质干细胞共培养24h后，应用RT-PCR法检测核因子KB受体激活剂配体，骨保护蛋白的表达。 结果：①两种骨髓间充质干细胞形态无明显区别，表型特征相似，均可在成骨诱导培养后向成骨细胞分化。②Von—Kossa染色后提示来源于多发性骨髓瘤患者的骨髓间充质干细胞成骨分化潜能较差，矿化基质沉积较正常来源骨髓间充质干细胞少。两种骨髓间充质干细胞共培养第28天行Von—Kossa染色后，可见矿化基质沉积较不加入多发性骨髓瘤细胞株组明显减少（P〈0001），TRAP染色未发现破骨样细胞的存在。③RT-PCR结果显示，正常骨髓间充质干细胞不表达核因子KB受体激活剂配体，但表达骨保护蛋白，与骨髓瘤细胞共培养后，8226或XG7细胞可明显上调骨髓间充质干细胞表达核因子κB受体激活剂配体，相反骨保护蛋白表达明显受抑。 结论：多发性骨髓瘤细胞抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化及上调骨髓间充质干细胞表达核因子κB受体激活剂配体，抑制骨保护蛋白的表达可能是多发性骨髓瘤患者骨病发病的主要原因。     

Notch信号通路对VEGF促大鼠间充质干细胞增殖的作用

本研究旨在探讨Notch信号传导通路在VEGF促大鼠间充质干细胞增殖中的作用.体外培养大鼠间充质干细胞,取对数生长期的细胞用于实验研究.用Notch通路阻断剂DAPT阻断Notch信号传导,观察该通路在VEGF作用下大鼠间充质干细胞的增殖情况.实验分为4组：空白对照组、VEFG组、DAPT组及VEGF＋ DAPT组.应用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,RT-PCR法检测各组相关基因（Notch1、Notch2、Flk-1、HES-1）mRNA水平的变化.结果表明,细胞培养3d,各时间点（24h,48 h,72 h） DAPT组及VEGF＋ DAPT组细胞存活率均较低,细胞形态变圆脱落,数目明显减少;VEGF组存活率最高,差异具有统计学意义（P＜0.01）;与对照组相比,VEGF组的Notch1、Notch2和Flk-1的表达水平均上调,而DAPT组及VEGF＋ DAPT组Notch1和Notch2的表达水平均下调,差异均具有统计学意义（P＜0.05）;VEGF组Hes-1基因水平下调,而DAPT组及VEGF＋ DAPT组Hes-1基因水平上调,差异具有统计学意义（P＜0.05）;DAPT组及VEGF＋ DAPT组的Flk-1基因表达水平稍有下调,但差异无统计学意义（P＞0.05）.结论：Notch信号通路在VEGF作用下对大鼠间充质干细胞的增殖具有明显促进作用,而DAPT可抑制这种增殖效应.     

骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化过程中Wnt信号通路的调控效应

背景:骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关,而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用.目的:通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后相关基因表达的变化,寻找Wnt信号通路中调控骨髓间充质干细胞分化的靶基因.方法:采用大鼠第3代骨髓间充质干细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,7 d后用Trizol萃取培养瓶中的细胞总RNA,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征及成骨诱导后和成脂诱导后细胞形态特征.采用Wnt信号通路PCR芯片(大鼠)进行摹因芯片检测,以未诱导组为对照,计算成脂肪诱导,成骨诱导后相关基因上调/下调的比值.结果与结论:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞经成骨诱导后向成骨细胞方向分化,经成脂诱导后向脂肪细胞方向分化.②与未诱导组相比,骨髓间充质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1,kremen,FZD1,FZD7)等15个(ratio＞2),下调的基因(sFrp 5,β-catenin,Dvl3,Tcf7)等16个(ratio＜0.5).成骨诱导后,Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1,kmmen,β-catenin,Wnt11)6个,表达下调的基因(sFrp5,sFRP4,Fzd1)等15个.提示WnI信号通路在骨髓间克质干细胞成脂细胞分化和成骨细胞分化中发挥重要作用.     

间充质干细胞向成骨细胞分化中的Wnt信号通路

背景：研究表明Wnt信号通路在间充质干细胞向成骨分化中具有重要作用。
　　目的：归纳总结Wnt信号通路的机制、调控以及其参与间充质干细胞成骨分化的作用。
　　方法：应用计算机检索Pubmed和CNKI数据库中1998年9月至2013年3月相关文献,在标题和中以“Wnt,间充质干细胞,Wnt信号通路,成骨细胞分化,经典Wnt信号传导通路,非经典Wnt信号传导通路”或“Wnt,Mesenchymal stem cel s,Wnt signaling pathways,osteoblastic differentiation,canonical Wnt signaling,non-canonical Wnt signaling”为检索关键词进行检索。最后选择31篇符合标准的文献进行综述。结果与结论：Wnt信号传导通路在间充质干细胞向成骨细胞中充当着关键的角色,包括经典Wnt信号、非经典 Wnt 信号以及其内部多种因子都参与间充质干细胞增殖和分化的调控。经典 Wnt 信号传导通路与非经典Wnt信号传导通路能联合调控人间充质干细胞的多向性分化,其中Wnt信号传导通路在参与在间充质干细胞向成骨分化的过程中,Wnt11,FZD6,sFRP2,sFRP3和Ror2等因子的表达升高,而Wnt9a和FZD7的表达下降。但Wnt信号的各因子如何相互影响,如何利用Wnt信号的机制促使间充质干细胞更快、更准确地分化值得更进一步探讨与研究。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Hedgehog信号分子的表达

背景：Hedgehog 信号通路是一个在胚胎阶段调控多种组织器官发育的重要信号通路,在成骨发育方面具有重要的作用。但Hedgehog 信号分子在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞过程中的作用尚未清楚。目的：体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化,检测 Hedgehog 信号分子在成骨诱导分化过程中的变化。方法：从大鼠骨髓中分离得到骨髓间充质干细胞,进行地塞米松成骨诱导,通过免疫组化方法鉴定成骨的情况,Western Blot方法检测 Hedgehog 信号分子 SHH 和 IHH 在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达。结果与结论：成功分离得到骨髓间充质干细胞,地塞米松诱导培养 7,14,21 d 后,Ⅰ型胶原的表达量逐渐增加;在诱导成骨分化过程中,SHH 蛋白表达升高,诱导组的表达明显高于未诱导组的表达（P 〈 0.05）,而 IHH 蛋白的表达降低,诱导组的表达明显低于未诱导组的表达（P 〈 0.05）。结果提示,Hedgehog 信号分子参与地塞米松诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的过程,且 SHH 和 IHH 在间充质干细胞诱导成骨过程中的作用有差异。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Hedgehog信号分子的表达

背景:Hedgehog信号通路是一个在胚胎阶段调控多种组织器官发育的重要信号通路,在成骨发育方面具有重要的作用.但Hedgehog信号分子在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞过程中的作用尚未清楚.目的:体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨分化,检测Hedgehog信号分子在成骨诱导分化过程中的变化.方法:从大鼠骨髓中分离得到骨髓间充质干细胞,进行地塞米松成骨诱导,通过免疫组化方法鉴定成骨的情况,Western Blot方法检测 Hedgehog信号分子SHH和IHH在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达.结果与结论:成功分离得到骨髓间充质干细胞,地塞米松诱导培养7,14,21 d 后,Ⅰ型胶原的表达量逐渐增加;在诱导成骨分化过程中,SHH蛋白表达升高,诱导组的表达明显高于未诱导组的表达(P < 0.05),而IHH蛋白的表达降低,诱导组的表达明显低于未诱导组的表达(P < 0.05).结果提示,Hedgehog信号分子参与地塞米松诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的过程,且SHH和IHH在间充质干细胞诱导成骨过程中的作用有差异.     

红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中的Ca2＋/CaM信号通路

背景：课题组前期研究表明,红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,Ca2＋信号是实现其生物学信号传导的重要途径之一目的：探讨Ca 2＋/CaM 信号通路在红景天苷诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化中的作用及机制。方法：实验分为空白对照组和红景天苷诱导组,红景天苷诱导组将不同质量浓度红景天苷（5,10,20,50,100 mg/L）作用骨髓间充质干细胞24 h和100 mg/L红景天苷作用骨髓间充质干细胞12,24,48,72 h。采用Western blot方法分别检测红景天苷诱导骨髓间充质干细胞后神经标志分子MAP2和Ca 2＋/CaM信号通路中关键蛋白CaM、CaMKⅡ的表达水平。另外实验设阻断剂组,分别加Ca2＋信号通路特异性阻断剂：500μmol/L EGTA （细胞外Ca2＋螯合剂）、1 mmol/L Nifedipine （L型Ca2＋通道阻断剂）、10 mmol/L LY294002（PI3K抑制剂）分别作用细胞30 min后,再加入100 mg/L红景天苷作用细胞24 h,采用Western blot方法检测阻断Ca2＋/CaM信号通路后NSE、CaM的表达情况。结果与结论：①红景天苷诱导后,MAP2的表达上调（P〈0.01）,说明红景天苷可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞。②不同质量浓度红景天苷诱导骨髓间充质干细胞24 h后,10 mg/L红景天苷组CaM、CaMKⅡ的表达与其他诱导组比较显著上调（P〈0.01）;同一质量浓度红景天苷诱导72 h后CaM、CaMKⅡ表达明显下调（P〈0.01）。③阻断细胞外Ca 2＋和PI3K信号通路后,NSE与CaM的表达水平较红景天苷诱导组上调（P〈0.05）。结果表明,红景天苷通过抑制Ca2＋/CaM信号通路实现骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化。     

miR-34b对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及相关机制

目的:探讨mi RNA-34b在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达及其可能的作用靶点和作用机制。方法:采用密度梯度离心和全骨髓贴壁相结合的方法分离培养人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,h BMSCs),并在体外诱导成骨分化。采用实时荧光定量PCR技术,检测h BMSCs成骨分化过程中的mi R-34b的表达水平;然后过表达mi R-34b,进一步观察其对h BMSCs成骨分化的影响。同时检测过表达mi R-34b对成骨分化的关键信号通路之一Notch信号通路的活性影响,初步探讨其可能涉及的作用机制。结果:成功分离出h BMSCs,并构建了h BMSCs体外诱导成骨分化模型;且随着成骨诱导培养时间的延长,mi RNA-34b表达水平逐渐降低。ALP活性检测、茜素红染色检测结果显示过表达mi RNA-34b后,ALP活性显著降低,且茜素红染色的钙盐结节明显减少;同时Western blot实验结果显示过表达mi RNA-34b后,成骨特异性标记分子Runx2的蛋白表达水平显著下降(P0.05)。此外,过表达mi RNA-34b后,Notch信号通路的活性显著降低。结论:mi RNA-34b能够负向调控人骨髓间充质干细胞成骨分化;其作用机制可能与抑制Notch信号通路的活性有关,提示mi RNA-34b可以作为诊断和靶向治疗慢性炎症性骨疾病的潜在作用靶点。     

骨髓间充质干细胞缺氧后促红细胞生成素信号通路的改变

目的研究骨髓间充质干细胞缺氧后细胞死亡情况及促红细胞生成素信号通路成分的表达改变。方法从Wistar大鼠股骨提取骨髓分离培养骨髓间充质干细胞并在体外扩增。取第4至6代接近融合的骨髓间充质干细胞置于氧浓度为0．5％的缺氧箱内培养24、48、72、96h后行台盼蓝染色计数阳性细胞并提取蛋白行Western blot检测促红细胞生成素、促红细胞生成素受体、HIF-1α、ERK、磷酸化ERK表达改变,另取0．5％缺氧培养48h的细胞免疫荧光染色观察EPO表达改变,Hoechst 33342染细胞核。结果常氧浓度培养对照组骨髓间充质细胞组台盼蓝染色阳性率为3．5％±0．4％,缺氧培养24、48、72、96h组分别为3．9％±0．2％、5．0％±0．4％、5．9％±0．5％、7．1％±0．5％。Western blot和免疫荧光染色发现EPO表达在缺氧48h后开始明显上调。F20R表达在缺氧后24h即开始显著上调且倍数更高。总ERK在对照组和不同缺氧时间组表达改变不明显,但HIF-1α和磷酸化ERK缺氧24h后即上调,72h达高峰。结论骨髓间充质干细胞对单纯缺氧损害较耐受,缺氧后促红细胞生成素信号通路的主要成分均显著上调,提示促红细胞生成素信号通路在骨髓间充质干细胞耐缺氧和旁分泌保护能力中起着重要作用。     

系统性红斑狼疮小鼠骨髓间充质干细胞的成骨、成脂分化能力下降

背景：系统性红斑狼疮患者的骨髓间充质干细胞与正常人相比是否有不同,相关报道较少。 目的：对比系统性红斑狼疮模型小鼠与正常小鼠的骨髓间充质干细胞多向分化能力的差别。 方法：分离培养系统性红斑狼疮模型小鼠与C57BL小鼠的骨髓间充质干细胞（对照组）,分别进行成骨、成脂诱导分化,观察两种小鼠的骨髓间充质干细胞的分化能力。 结果与结论：C57BL小鼠的骨髓间充质干细胞经传代后,为长梭形,呈均匀分布生长;系统性红斑狼疮模型小鼠的骨髓间充质干细胞表现为生长缓慢,细胞相对C57BL小鼠要少一些。经过成骨诱导显示系统性红斑狼疮模型小鼠的钙结节和钙盐明显少于对照组,PCR检测成骨基因Runx2,碱性磷酸酶,骨钙素表达也明显下降。经过成脂诱导显示系统性红斑狼疮模型小鼠的脂滴明显少于对照组,PCR检测成脂基因PPARγ2,脂蛋白酯酶表达也明显下降。说明系统性红斑狼疮模型小鼠的骨髓间充质干细胞成骨与成脂能力都低于C57BL小鼠,系统性红斑狼疮模型小鼠的骨髓间充质干细胞的多向分化能力受损。     

前列腺素E2调控骨髓间充质干细胞成骨分化最佳浓度及其效应基因

背景：前列腺素E2不仅是参与机体炎症反应的炎性递质,而且在骨组织形成与改建过程中起着非常重要的调节作用,且前列腺素E2在其他干细胞如神经干细胞、胚胎干细胞的增殖分化中,也表现出类似的调节作用。目的：研究前列腺素E2对骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化的影响,检测其促增殖和成骨分化的最佳剂量,筛选出前列腺素E2的效应基因,评价前列腺素E2诱导成骨的作用机制。方法：提取SD大鼠骨髓间充质干细胞并鉴定,配制10-2,10-3,10-4,10-5,10-6g／L不同质量浓度的前列腺素E2溶液,分别与第3代骨髓间充质干细胞共培养,空白组为含体积分数10％胎牛血清的L．DMEM。M丌比色法及碱性磷酸酶定量检测,筛选出前列腺素E2促骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的最佳剂量。利用基因芯片筛选出最佳成骨诱导浓度前列腺素E2诱导后14d的骨髓间充质干细胞与未诱导组的差异表达基因。结果与结论：不同质量浓度前列腺素E2诱导实验数据进行统计学分析后发现前列腺素E2最佳促骨髓间充质干细胞增殖浓度为1×10-4g／L,前列腺素E2最佳促骨髓间充质干细胞成骨分化浓度为1×10-5g／L。基因芯片筛选发现Cxcll3、Cd55基因及PPAR、MAPK信号通路可能与前列腺素E2促骨髓间充质干细胞向成骨分化关系密切。     

动静态不同牵张条件下大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与分化

背景：在体外和体内关于细胞对于不同的机械牵张反应的大量研究表明,牵张能够刺激成骨。然而鲜有文献报道不同的牵张方式对于同种细胞的影响有何不同。目的：比较不同机械牵张方式对大鼠骨髓间充质干细胞的影响。方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,应用自行研制的牵张装置对骨髓间充质干细胞分别施加动态、静态和模拟临床的混合牵张牵张刺激,分别检测3种刺激方式下骨髓间充质干细胞的增殖能力、碱性磷酸酶活性及Runx2基因的mRNA表达,并测量细胞骨钙素的分泌情况。结果与结论：静态牵张组与对照组相比,细胞增殖能力提高18．67％,碱性磷酸酶活性、Runx2表达及骨钙素分泌无明显差异：动态牵张组相对于对照组,细胞碱性磷酸酶活性提高60．33％,Runx2表达上升49．67％,细胞外骨钙素的分泌提高了48％,然而细胞增殖则受到了抑制;混合牵张组相对于对照组,细胞增殖能力稍有上升但无统计学差异,其对碱性磷酸酶活性、Runx2表达以及骨钙素的分泌有一定的促进作用,但没有动态牵张组明显。结果提示,静态牵张能够显著刺激骨髓间充质干细胞的增殖,而动态牵张对于刺激骨髓间充质干细胞成骨向分化作用更为明显,混合牵张方式对于细胞增殖及成骨分化均有一定的促进作用。     

Notch信号系统调控骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：Notch信号系统在调控骨髓间充质干细胞的定向分化中起关键作用,但尚无涉及干细胞分化为心肌细胞及其分化机制的报道。目的：分析Notch信号系统在骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中的调控作用。方法：将分离培养的骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养,Jagged1组加入Notch激活剂Jagged1,DAPT组加入Notch激活剂Jagged1和抑制剂DAPT,对照组加入PBS缓冲液。用反转录-聚合酶链反应、免疫组化等方法检测干细胞分化为心肌细胞的情况及Notch信号系统的表达。结果与结论：骨髓间充质干细胞在体外可分化为心肌细胞,与DAPT组及对照组相比,Jagged1组的干细胞分化为心肌细胞的比率提高,心肌标志物表达增多,并且Notch1和Jagged1表达增强。证实Notch信号系统对骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞起正向调控作用。     

17β-雌二醇对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导调控

背景：研究发现骨髓间充质干细胞上存在雌激素受体,雌激素通过调节骨髓间充质干细胞的增殖、分化特性发挥促成骨作用。目的：观察17β-雌二醇对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导作用,并探讨其作用机制。方法：在基础成骨诱导培养基培养的第3代大鼠骨髓间充质干细胞中分别加入0（对照组）,0.001,0.01,0.1nmol/L17β-雌二醇干预。Elisa法检测培养的骨髓间充质干细胞分泌Ⅰ型胶原的水平,RT-PCR及Western blotting法分别检测Runx2因子mRNA及蛋白水平。结果与结论：与对照组比较,在给予0.001,0.01,0.1nmol/L17β-雌二醇干预后第5天,骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原表达显著升高（P〈0.05）,第7天仍旧呈高表达（P〈0.05）。同时,在17β-雌二醇干预的第5,7天,Runx2因子mRNA及蛋白表达水平随17β-雌二醇浓度的增加而升高（P〈0.05）,并呈剂量依赖性。表明17β-雌二醇可诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,其可能通过上调Runx2因子表达发挥促成骨作用。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,且可大量体外扩增培养,是重要的组织工程种子细胞。但尚无统一的体外培养及定向诱导方法。目的：探讨体外定向诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的可行性。方法：应用密度梯度离心法从兔四肢骨中分离纯化间充质干细胞,应用密度为1．073g／mL的Percoll分离液,3000r／minx30min离心,区别于相关报道的Ficoll分离液,2000—2500r／min×（20—30）min离心以及全骨髓培养法体外扩增至第3代,分别在普通培养基（对照组）和成骨诱导培养基（实验组）中培养。结果与结论：成功获得大量高纯度骨髓间充质干细胞。经成骨诱导后,实验组骨钙素含量明显高于对照组（P〈0．05）。实验组碱性磷酸酶和钙结节染色阳性,对照组均阴性。结果表明使用密度梯度离心法可成功建立兔骨髓间充质干细胞的分离培养体系,骨髓间充质干细胞可定向诱导为成骨细胞。     

骨髓间充质干细胞成骨分化中血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2的表达

背景：有研究表明血管内皮生长因子可促进内皮细胞增殖、分化和迁移,而骨髓间充质干细胞经诱导分化后细胞自身的血管内皮细胞生长因子及骨形态发生蛋白2如何表达,却鲜见报道。目的：观察兔骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。方法：取第3代新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,1d后将细胞分为两组：对照组不更换培养基;诱导组加入成骨诱导培养基进行成骨诱导,流式细胞仪检测其表面抗原。RT-PCR和Western-Blot检测细胞成骨分化过程中血管内皮细胞生长因子和骨形态发生蛋白2的表达。结果与结论：兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后,细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形,多角形,最后成集落层叠生长;在诱导过程中,碱性磷酸酶活性逐渐增高,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;诱导7d时Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色、14时骨钙素免疫细胞化学染色、21d时钙化结节染色阳性;RT-PCR和Western-Blot结果显示两组均有骨形态发生蛋白2和血管内皮细胞生长因子表达,诱导后第7,14,21天表达比较,差异有显著性意义（P〈0.05）,第7天,两者表达最强。说明兔骨髓间充质干细胞分离、提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,可诱导分化为成骨细胞。其在成骨诱导过程中,骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达均先增强后减弱,血管内皮细胞生长因子表达可能对血管生成有促进作用。     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓问充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。结果与结论：慢病毒转染3d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90％以上,实验组转染效率达85％以上。F盯．PCR和Westernblot检测结果显示,环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。     

柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞的成骨特征

背景：骨碎补能在促进骨生长且取得了良好的临床疗效,其主要成分柚皮甙能否诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化？目的：用柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化。并观察柚皮甙诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的能力。方法：用贴壁筛选法对兔骨髓间充质干细胞进行分离培养。对生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分别用50μg／L的柚皮甙和经典成骨诱导剂向成骨方向进行诱导,分别进行成骨鉴定。结果与结论：经典成骨诱导液、柚皮甙诱导液都能使骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,基质分泌增多,形成钙结节。用酶联免疫检测仪检测柚皮甙诱导组和经典成骨诱导组细胞吸光度值未见明显的差异。同时检测柚皮甙诱导液和L—DMEN细胞培养液的吸光度值发现两者差异无显著性意义（P〉0．05）。证实柚皮甙可成功诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化,无明显毒性作用。