化学诱导剂5-氮杂胞苷及模拟生物微环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

背景:研究显示干细胞有随环境发生分化即"环境依赖性分化"的特性,但骨髓间充质干细胞在心肌组织是否存在此种特性目前尚未形成公识.目的:观察化学诱导剂和模拟的生物微环境诱导对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响.设计、时间及地点:随机分组设计,细胞学体外对比观察,于2008-01/2009-02在苏州大学心血管内科干细胞移植实验室完成.材料:6～8周龄SD大鼠,用于骨髓间充质干细胞的培养;新生1～3 d同种系SD大鼠,用于心肌细胞的培养.方法:取SD大鼠股骨骨髓,培养至第2代,经流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞纯度97%以上,制成4×108L-1的细胞悬液,实验分为4组:单纯DMEM培养组:用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养;5-氮杂胞苷组:24 h后培养液内加入10 μmol/L的5-氮杂胞苷;心肌细胞裂解液组:将4倍于骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞裂解液加入骨髓间充质干细胞培养瓶中;间接接触组:在培养体系中放入millicell插入式细胞培养皿,28 d收获细胞.主要观察指标:免疫组织化学法检测诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、CD31的情况;RT-PCR法检测各组早期心肌细胞特异性转录因子GATA4、NKX2.5、β-肌球蛋白重链及α-肌球蛋白重链基因的表达情况.结果:免疫组织化学检测显示实验组诱导4周后特异性抗原呈阳性表达,实验组与单纯DMEM培养组相比,差异有显著性意义(P<0.05);间接接触组较心肌细胞裂解液组阳性细胞数目稍增多,但组间差异无显著性意义(P>0.05);CD31是血管内皮细胞的表面抗原标志,单纯DMEM培养组和5-氮杂胞苷组无表达,其他两组弱阳性表达,组间差异无显著性意义(P>0.05).实验组诱导4周后,均表达心肌前体细胞特异性转录因子NKX-2.5和GATA4,同时表达胚胎期占优势的心肌细胞特异性β-肌球蛋白重链,而没有表达成年期占优势的心肌细胞特异性标志α-肌球蛋白重链.结论:5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,心肌细胞裂解液和细胞间接接触模拟的心肌微环境也可以诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞,分化的细胞介于成熟的心肌细胞和心肌祖细胞之间的心肌细胞前体.     

人脐血源性间充质干细胞向心肌细胞的诱导分化(英文)

背景：与骨髓间充质干细胞相比，脐带血巾的细胞被视为“非常年轻”的细胞，其增殖和分化能力不会随着捐助者的年龄增加而减低，可能是一个极好的骨髓间充质干细胞的替代来源。目的：观察体外诱导脐血间充质干细胞分化成心肌细胞的特点。设计、时间及地点：观察性实验，于2005—03／2007—02在北京世纪坛医院完成。材料：收集获知情同意健康产妇脐血细胞。方法：分离单个核细胞，从中进一步分离间充质干细胞，传代培养至第3代，应用免疫荧光流式细胞仪标记间充质干细胞特异性抗原CD34，CD44和CD90。5-氮胞苷诱导分化4周后，免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反应分别检测心肌细胞标志物肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β-肌球蛋白重链的表达。主要观察指标：心肌细胞标志物肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β肌球蛋白重链的表达。结果：脐血源性间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后，呈现成纤维细胞样形态和克降增殖特点。免疫分型与骨髓来源间质干细胞一致，且免疫组织化学染色和反转录-聚合酶链反可检测到肌钙蛋白Ⅰ，GATA4和β-肌球蛋白重链的表达。结论：脐血源性间充质干细胞能够被诱导分化成心肌样细胞，并显示为心肌细胞的表观特征。     

骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养诱导分化为心肌样细胞

本研究探讨间充质干细胞（MSC）分化为心肌细胞（CM）的能力。对大鼠源MSC进行标记并将大鼠源MSC与初生大鼠CM直接接触共培养5—7天，诱导MSC向CM分化。用流式细胞仪检测细胞表面抗原，免疫荧光法检测标记细胞的心肌特异性标记物肌球蛋白和肌钙蛋白T表达。结果显示：体外培养的MSC表达CD90、CD44、CD105、CD54，不表达CD34、CD45、CD31等造血细胞、内皮细胞相关抗原。MSC与CM直接接触共培养后可分化为心肌样细胞，表达心肌特异蛋白肌钙蛋白T和肌球蛋白，CM与MSC比例为4：1时，MSC分化为心肌样细胞的比例最高。结论：MSC在与CM直接接触共培养条件下可被诱导分化为心肌样细胞，两种细胞按4：1比例混合培养后MSC分化为心肌细胞的效果最明显：     

大鼠骨髓间充质干细胞表达心肌基因表型的时间依赖效应

背景:前期实验已经证实30%心肌培养上清是诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳浓度.目的:在前期实验基础上,观察30%心肌培养上清条件下诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的时间依赖效应.设计、时间及地点:对比观察,于2007-08/2008-06在徐州市心血管病研究所完成.材料:健康成年SD大鼠,体质鼍180～220 g.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞和心肌细胞并在体外培养纯化.以1×108L-1的细胞密度种植心肌细胞,培养72 h后收集上清.将骨髓间充质干细胞的DMEM/F12培养基换为含有30%M199心肌细胞培养上清作为实验组,对照组仍将细胞接种在DMEM/F12培养基上继续培养.主要观察指标:30%心肌细胞培养上清诱导7,14,21d后,应用免疫细胞化学技术检测骨髓间充质干细胞中α-平滑肌肌动蛋白、β-肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达.结果:30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞后,细胞的形态没有改变,但与对照组相比,α-平滑肌肌动蛋白、β肌动蛋白和心肌特异性肌钙蛋白T的表达均呈阳性,其中以第14天的蛋白表达量最高(P＜0.01).结论:30%心肌细胞培养上清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的最佳诱导时间是14 d.     

成人脂肪间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的实验研究

目的 体外培养并诱导成人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）分化为心肌样细胞，为心肌细胞的替代治疗提供新的来源。方法 采用消化法和贴壁培养法分离培养ADMSCs，对第3代细胞进行免疫化学鉴定和5-氮杂胞苷（5-aza）诱导，于诱导后第7、14、21和28天行免疫化学鉴定．并测定GATA4和Nkx2．5表达和心房利钠肽（ANP）含量。结果 人脂肪中含有梭形细胞，CD44、CD13、CD105阳性表达，而CD45、CD34、HLA-DR、Ⅷ因子阴性表达。诱导后细胞排列方向一致．部分细胞聚集成团；结蛋白、α-横纹肌肌动蛋白、肌球蛋白重链和心肌肌钙蛋白T呈阳性表达。有GATA4和Nkx2．5的表达及心房利钠肽的分泌。结论 成人脂肪组织中含有问充质干细胞，且可在5-氮杂胞苷诱导21d后分化为心肌样细胞。     

脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞心肌样分化特性的比较

目的：骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞均具有分化为心肌细胞的潜能。观察脂肪干细胞体外诱导分化为心肌细胞的特性及相关基因表达，比较骨髓间充质干细胞与脂肪干细胞心肌分化能力的差异。方法：实验于2006—08／2007—04在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成。①实验材料：脂肪组织标本来源于本院手术患者，所有患者知情同意，术中收集多余的皮下脂肪。（爹实验方法：分离培养人脂肪干细胞，用5-氮胞苷诱导传4～6代的脂肪干细胞分化，平行培养第5代骨髓间充质干细胞，诱导条件相同，对照组培养液不添加任何诱导因子。③实验评估：采用免疫荧光技术观察脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞表达结蛋白Desmin和肌钙蛋白TroponinT的阳性细胞率。通过即时RT．PCR的方法检测诱导过程中细胞内GATA-4和NKX2．5的mRNA水平。结果：脂肪干细胞经5-氮胞苷诱导后3周，肌性基因标志结蛋白desmin和肌钙蛋白Troponin—T阳性细胞明显增加。与骨髓间充质干细胞组比较，脂肪干细胞表达心肌特异蛋白的阳性细胞率在诱导后第14天明显升高，而在第21天时，两组细胞的阳性表达率均达到60％左右，无明显的统计学差别，未加任何诱导条件的脂肪干细胞对照组培养14d时有2．5％和1．6％的细胞表达Desmin，Troponin．T，在骨髓问充质干细胞对照组未见心肌标记蛋白的阳性表达。即时PCR检测结果发现，诱导组与未经诱导组的脂肪干细胞均表达GATA-4和NKX2．5，骨髓间充质干细胞组在诱导后第7天出现GATA-4和NKX25的转录活性。结论：体外培养的脂肪干细胞能够被5-氮胞苷诱导分化为心肌样细胞，并且具有自发分化的能力，与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞的早期分化特性更有利于心肌干细胞移植治疗。     

诱导间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前很多体内外实验都已表明间充质干细胞具有向心肌样细胞或心肌细胞分化的能力,这使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能。目的:比较诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化实验方法的异同及存在的问题。方法:以"mesenchymal stem cells,cardiomyocyte,differentiation;间充质干细胞,心肌细胞,诱导;分化"为检索词,应用计算机检索2000-12/2010-12 PubMed数据库与万方数据库,与间充质干细胞诱导分化为心肌细胞相关的文章。结果与结论:间充质干细胞向心肌细胞分化的方法主要有:①心肌细胞条件培养液:间充质干细胞在体外经药物诱导或模拟体内心肌微环境能定向诱导分化为心肌样细胞。②与希望诱导成的目的细胞共同培养:间充质干细胞可经药物诱导诱导分化为心肌细胞,也可不经任何诱导在心肌微环境中分化为心肌细胞。虽然间充质干细胞在体外心脏病理条件下可分化为心肌细胞,使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能,但其研究有待进一步完善。     

5-氮胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化:超顺磁性氧化铁颗粒的标记

背景: 骨髓间充质干细胞体外经多种诱导剂均可成功转化为心肌样细胞,目前国内外报道中普遍采用的诱导剂为5-氮胞苷.超顺磁性氧化铁颗粒直径小,可被干细胞吞噬,加上其顺磁性可被MRI探测到信号,因而成为目前广泛应用于活体检测干细胞移植的理想示踪剂.目的: 与未经标记的干细胞相比,观察超顺磁性氧化铁颗粒标记方式对干细胞体外经5-氮胞苷诱导向心肌样细胞分化效应的影响.方法: 分离培养猪骨髓间充质干细胞,实验组采用P3代细胞经超顺磁性氧化铁颗粒标记,标记后细胞经5-氮胞苷体外诱导24 h后继续培养,对照组直接经5-氮胞苷诱导.2周后用抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I、连接蛋白43进行免疫细胞化学染色鉴定,经普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒.结果与结论: 5-氮胞苷诱导分化后细胞表达抗结蛋白、肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白I和连接蛋白43,且超顺磁性氧化铁颗粒标记诱导细胞内普鲁士蓝染色呈阳性.提示超顺磁性氧化铁颗粒标记骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷体外诱导后可以分化为心肌样细胞.     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存存怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用.设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300 g 6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用.取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组.主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后.部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞旱节律性跳动,晕心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性.对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变.其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性.结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟.     

聚乳酸-聚乙醇酸共聚物复合心肌样细胞体外构建工程化心肌组织

背景:研究证实,在一定的诱导条件下,骨髓间充质干细胞可能向心肌细胞等多种中胚层来源的间质细胞分化.目的:探索以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,体外构建工程化心肌组织的可行性.方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞加入含5-氮胞苷的培养液进行诱导分化,培养4周.将诱导成功后的细胞制成细胞悬液,缓慢滴注于预先制备好的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物上,培养14 d.以倒置相差显微镜观察诱导前后细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后骨髓间充质干细胞中心肌特异性肌钙蛋白l的表达,大体观察工程化心肌组织在培养期间的形态,透射电镜观察工程化心肌组织的超微结构.结果与结论:原代培养的骨髓间充质干细胞14 d形成集落,传代细胞体积变大,5-氮胞苷诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长.免疫荧光染色结果显示诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白Ⅰ.透射电镜可见肌丝、Z线样物质.结果证实,以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物为支架、骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌样细胞为种子细胞,可于体外构建出类似天然心肌的工程化心肌组织.     

人胎盘不同组织分离间充质干细胞的生物学特性

背景：胎盘间充质干细胞来源稳定,正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源。 目的：比较从胎盘组织绒毛膜与绒毛滋养层分离获取人胎盘间充质干细胞生物学特性的差异。 方法：手术剪剥离人胎盘表面羊膜,分别剪取胎儿侧的绒毛膜与绒毛滋养层组织机械破碎后,分别加含Ⅱ型胶原酶的PBS消化液消化,分离为单个核细胞,用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数5%CO2、95%饱和湿度下培养,48 h后全量换液,去除非贴壁细胞,添加新鲜培养基,当细胞融合90%左右时,胰酶传代。通过观察原代细胞总数,细胞生长形态,以及间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105的流式细胞测定结果比较从不同胎盘组织分离获得胎盘间充质干细胞的差异。 结果与结论：流式细胞仪测定结果显示,从绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞间充质干细胞表面标记CD90、CD73以及CD105的阳性率都在90%以上,两种来源的细胞生长都呈现典型的成纤维细胞形态,这表明绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞都具有间充质干细胞的特性。提示消化时间相同,酶浓度相同,以及摇床转速相同的情况下,可从绒毛膜中可以得到更多的细胞,对于后续培养更易获得较多的细胞。     

脐带间充质干细胞在不同培养体系条件下的生物学特性

背景：体外培养的脐带间充质干细胞在不同培养体系下生长状态差异显著,因此选取一种更适合的培养基相当必要。目的：对比观察人脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长增殖情况,并检测细胞免疫表型以及间充质干细胞的诱导分化能力。方法：在无菌条件下用贴块法收获人脐带间充质干细胞,用T75培养瓶培养传代后,取第3代脐带间充质干细胞分别种入到含体积分数为5%胎牛血清的DMEM/F12培养基、含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和Mesen PRO RSTM培养基中,培养第1,3,5,7天进行细胞计数,绘制细胞生长曲线。采用流式细胞仪分析第3代脐带间充质干细胞免疫表型,并检测其成骨及成脂肪诱导分化能力。结果与结论：培养出的第3代人脐带间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105,不表达CD29、CD31、CD34、HLA-DR。经成脂诱导后,油红O染色可见胞浆中有大量红色小脂滴;成骨诱导后,茜素红染色后镜下可见成骨样细胞团,说明脐带间充质干细胞在体外具有多向分化的潜能。在倒置显微镜下观察可见含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中的细胞集落密集,形态均匀,而其他2种培养基中的细胞集落密集程度和形态都不如前者好。在培养传代细胞时,可优先选择含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。     

大鼠骨髓间充质干细胞重建表皮细胞及皮肤附件简

背景：研究报道用烧伤大鼠血清作为诱导剂可以诱导间充质干细胞分化为表皮细胞。目的：体外诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞,单独或与必要的诱导剂组合移植修复皮肤创面缺损与重建表皮。方法：无菌环境取大鼠骨髓,选取贴壁细胞用L-DMEM培养液培养至第4代,通过流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞。用含20%烧伤大鼠血清 DMEM-F12培养液诱导骨髓间充质干细胞分化成表皮细胞,通过免疫组织化学鉴定。将Wistar大鼠制造全层皮肤缺损创面,分为3组,将BrdU标记的自体骨髓间充质干细胞及含有经诱导的骨髓间充质干细胞分别单次涂布到烧伤大鼠模型创面上,以未移植骨髓间充质干细胞做对照,观察再生皮肤创面收缩率及表皮层细胞与皮肤附件再生情况。结果与结论：分离、培养的骨髓间充质干细胞24 h后少部分细胞贴壁生长,形态长梭形,类似成纤维细胞,16 d时细胞贴满瓶底,呈鱼群样或网状排列,经流式细胞仪鉴定后加入20%烧伤大鼠血清的DMEM F-12培养基继续培养,细胞形态渐变为圆形或椭圆形细胞,经免疫组织细胞化学法和流式细胞术分析细胞角蛋白表达阳性,证实已分化为表皮细胞。动物实验结果表明无论是骨髓间充质干细胞单独移植还是与必要的诱导剂组合移植其皮肤的修复与再生情况均超过大鼠皮肤自然愈合,且不仅皮肤再生快,而且皮肤附件如毛囊等的再生也比对照组明显改善。初步推断间充质干细胞参与了表皮和皮肤附件毛囊的重建,从而改善皮肤愈合方式。     

原代人脐带间充质干细胞培养方法的研究

背景：如何获得大量稳定活力好的细胞是人脐带间充质干细胞培养的难点。 目的：通过组织块法、酶消化法和酶解组织块法3种细胞培养方法比较,筛选出最佳的人脐带间充质干细胞的培养方式。 方法：分离新鲜脐带10根,分别采用组织块法、酶消化法、酶解组织块法3种方式培养人脐带间充质干细胞,比较3种方式原代人脐带间充质干细胞爬出所需时间、细胞培养成功率、绘制细胞增殖曲线,利用流式细胞仪检测细胞表面标志,并进行多项分化能力检测。 结果与结论：酶解组织块培养法原代人脐带间充质干细胞爬出所需时间与酶消化法无显著差异,但明显短于组织块法（P 〈0.01）,原代人脐带间充质干细胞培养成功率显著高于其他两组,人脐带间充质干细胞增殖情况3组无显著性差异,酶解组织块培养法培养的第3代人脐带间充质干细胞其细胞表面标志及多项分化能力符合间充质干细胞的特性。酶解组织块培养法能缩短原代人脐带间充质干细胞爬出时间,显著提高原代人脐带间充质干细胞的成功率。     

miR-378对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响

背景：研究miR-378对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞生长增殖、细胞凋亡等生物学行为的影响,为进一步改善骨髓间充质干细胞在梗死心肌中的生存提供新方法。 目的：观察miR-378转染后的骨髓间充质干细胞耐受缺血缺氧及促进血管形成的能力。 方法：体外培养的骨髓间充质干细胞分为未转染组和转染组,未转染组为未转染miR-378的骨髓间充质干细胞,转染组则采用化学合成的miR-378模拟物转染SD大鼠骨髓间充质干细胞;将两组骨髓间充质干细胞置于缺血缺氧（无血清,体积分数为1%O2、5%CO2,94%N2）环境中培养24 h后,应用锥虫蓝染色计数法、MTS法检测两组细胞在不同时间点的生长及增殖情况,TUNEL法检测细胞凋亡情况;将两组缺血缺氧后的培养基上清液分别刺激人脐静脉内皮细胞,观察血管形成情况。 结果与结论：缺血缺氧干预后48 h和72 h,转染组的骨髓间充质干细胞活细胞数明显高于未转染组（均为P 〈0.01）;转染组的骨髓间充质干细胞表现出较高的增殖能力,缺血缺氧干预后24 h及48 h细胞增殖升高较未转染组明显,差异有显著性意义（P 〈0.01,P 〈0.05）;缺血缺氧后转染组骨髓间充质干细胞的凋亡比例明显下降（P 〈0.05）。两组细胞均可促进血管腔样结构形成,但转染组血管管腔样结构较未转染组显著增多（P 〈0.01）。研究结果提示miR-378可促进缺血缺氧后骨髓间充质干细胞的生长增殖并抑制其在缺血缺氧条件下的细胞凋亡,同时可提高其促血管生成的能力。     

人脐血间充质干细胞培养方法的比较

背景：脐血中含丰富的间充质干细胞,可以作为组织工程中一种新的种子细胞来源。目的：应用两种培养基体外培养、扩增、分离纯化脐血间充质干细胞,比较其生物学特性的差异。方法：无菌条件下采取40份足月顺产的脐血,肝素抗凝。应用Ficol 密度梯度离心法分离脐血单核细胞,随机分为两组,其中20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养,20份用DMEM培养基进行培养。对比两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量。选用生长情况良好的原代脐血间充质干细胞,用流式细胞仪检测间充质干细胞表面特异性标记表达情况。结果与结论：MesenGro组梭形的间充质干细胞平均出现时间、细胞集落平均出现时间、原代细胞平均培养时间、原代细胞平均数量为均优于DMEM组（P 〈0.01）。流式细胞仪检测显示,培养的细胞强表达间充质干细胞表面标志CD73和CD105,阳性率99.1%,不表达造血干细胞表面标志CD45和CD34,阴性率99.3%。结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面,MesenGro 人间充质干细胞培养基均优于DMEM培养基。选用MesenGro人间充质干细胞培养基可以更纯、更快、更好地从脐血中培养出表达间充质干细胞表面标志的细胞。     

羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的体外细胞毒性

背景：为优化羟基磷灰石的生物活性,前期实验利用等离子喷涂技术在羟基磷灰石表面等离子喷涂制备了压电陶瓷涂层,但此种新型材料的细胞毒性还不明确。目的：评价羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷涂层的体外细胞毒性。方法：将第3代比格犬骨髓间充质干细胞分别接种于羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件与羟基磷灰石试件上,接种5 d后,扫描电镜观察材料上细胞黏附情况。分别以羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件浸提液、羟基磷灰石试件浸提液、含5%二甲基亚砜和体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM溶液、只含体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM培养基培养第3代比格犬骨髓间充质干细胞,培养的1,3,5 d采用CCK-8法检测各组细胞毒性。结果与结论：骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件与羟基磷灰石试件表面增殖旺盛,达到复层生长,伪足与细胞之间连接很紧密,胞体丰富,表明两组材料具有良好的细胞相容性。CCK-8细胞毒性实验显示,羟基磷灰石/钛酸钡压电陶瓷试件与羟基磷灰石试件组细胞相对增殖率均在80%以上,毒性分级为1级,无细胞毒性。     

C57小鼠脂肪及骨髓间充质干细胞生物学特性的比较

背景：研究发现,脂肪源干细胞具有和骨髓间充质干细胞一样的贴壁和形成成纤维样克隆特性,并具有向骨、脂肪、软骨等多系分化的能力。 目的：比较C57小鼠脂肪源间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的生物学特点。 方法：在无菌的条件下分别从C57小鼠的脂肪和骨髓中获取脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。体外分离、培养并将脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞传至第3代,进行细胞形态、表面标记、生长动力学分化潜能测定和Notch信号相关基因的检测。 结果与结论：脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞形态学相似,第3代的脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均表达CD29、CD105、Sca-1,不表达CD34、CD133,但骨髓间充质干细胞还表达CD45;生长曲线和细胞克隆分析显示脂肪间充质干细胞的增殖速度明显比骨髓间充质干细胞快;脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均可向成骨、成脂、成软骨诱导分化,脂肪间充质干细胞更易向成骨诱导;Notch 相关基因检测显示脂肪源干细胞的 Jagged-1表达水平明显比骨髓间充质干细胞低,而 Hes-1的表达水平脂肪源干细胞明显高于骨髓间充质干细胞的表达水平。提示脂肪间充质干细胞比骨髓间充质干细胞扩增能力更强,更易向成骨分化,可能与Hes-1表达水平有关。     

脐血血浆替代胎牛血清培养脐带间充质干细胞及冷冻保存

背景：采用胎牛血清扩增培养及冷冻保存的间充质干细胞,在临床应用中存在一定的风险。目的：探讨以脐血血浆替代胎牛血清体外分离培养、扩增及冷冻保存脐带间充质干细胞的可行性。方法：选择符合广州脐血库供者合格性筛选标准的脐血,收集脐血干细胞制备过程中去除的血浆,经病原学及微生物检测合格,多份混合用于细胞培养。采用酶消化法从健康足月分娩新生儿的脐带组织分离获得脐带间充质干细胞,分为两组,分别以DMEM/F12为基础培养基,添加胎牛血清或混合脐血血浆,经培养扩增后,采用流式细胞仪检测细胞免疫表型,并进行间充质干细胞成骨、成脂分化鉴定。在含有10%二甲基亚砜的DMEM/F12培养基中,分别添加体积分数为20%的胎牛血清或混合脐血血浆作为冷冻保存液,对扩增至第3代的细胞冷冻保存至6个月以上,观察复苏后细胞的活率、贴壁情况、增殖、免疫表型及向成骨细胞分化的能力。结果与结论：两种培养体系下的脐带间充质干细胞均呈现典型的梭形漩涡状生长,间充质干细胞免疫表型的表达谱系基本无差异,均具有成骨、成脂分化的能力,但脐血血浆培养条件下细胞的增殖速度显著高于胎牛血清。冻存复苏后的细胞可正常贴壁,且具有向成骨细胞分化的能力,采用脐血血浆冻存的细胞具有更高的贴壁效率及扩增能力。上述结果表明,脐血血浆可以替代胎牛血清用于脐带间充质干细胞的扩增培养及冷冻保存,并维持了间充质干细胞的基本生物学特性,是大量扩增间充质干细胞用于临床治疗较为安全的选择。     

骨髓间充质干细胞的旁分泌能影响成骨细胞生物学功能

背景：有研究表明骨髓间充质干细胞移植可促进骨缺损的修复,但受损组织的缺血、缺氧和炎症反应限制了其临床应用。 目的：观察骨髓间充质干细胞旁分泌作用对成骨细胞MG63增殖、迁徙、分化功能的影响 方法：Ficol-Paque 密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,制备骨髓间充质干细胞条件培养基培养成骨细胞 MG63。CCK-8法检测 MG63细胞增殖能力变化;细胞划痕法检测 MG63细胞迁徙能力变化;微板检测MG63细胞合成碱性磷酸酶能力的变化;Real-time PCR法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量的变化;茜素红染色检测其矿化能力的变化。 结果与结论：骨髓间充质干细胞表型为 CD44、CD73、CD90表达强阳性,CD34表达阴性。与普通培养基（DMEM）相比,在骨髓间充质干细胞条件培养基作用下,MG63细胞的增殖速度明显加快;细胞划痕结果示其迁徙能力明显提高;诱导第4,7天后碱性磷酸酶基因表达量及蛋白合成量明显增多（P 〈;0.01）;Ⅰ型胶原及骨钙素基因表达量在诱导第4天后差异无显著性意义,诱导第7天后较对照组明显升高（P〈;0.05）;茜素红染色示骨髓间充质干细胞条件培养基诱导MG63细胞21 d后钙结节形成增多,矿化沉积作用增强。结果证实,骨髓间充质干细胞的旁分泌物质可以显著促进成骨细胞的增殖、迁徙、分化和矿化能力。