宫颈永生化细胞和癌细胞胞膜差异蛋白质组学研究

目的建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞（H8细胞株）和宫颈癌细胞（CaSKi细胞株）胞膜蛋白双向电泳图谱,寻找特征性的差异蛋白点。方法提取两种细胞胞膜蛋白质进行双向凝胶电泳（2-dimensronal gel electrophore-sis,2-DE）,建立电泳图谱,然后筛选出差异点进行基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱（matrix-assisted laser desorption/i-onization time-of-flight tandem mass spectrometry,MALDI-TOF-MS/MS）分析,鉴定出蛋白质。结果获得了分辨率和重复性均较好胞膜蛋白2-DE图谱,并分析找出了13个的差异蛋白点,对其中3个显著差异点进行质谱分析和初步鉴定。结论建立了H8和Caski细胞胞膜蛋白2DE图谱,并初步发现LRC8D、EDAR、MTX1蛋白在宫颈癌前病变和宫颈癌细胞胞膜中存在差异表达,为宫颈癌及癌前病变的诊断及癌变机制提供了帮助。     

中国汉族肢端恶性黑素瘤的差异蛋白质组学研究

目的：研究恶性黑素瘤与正常皮肤组织的蛋白质表达差异,寻找可能的恶性黑素瘤的诊断标志蛋白和治疗靶点。方法：选取经病理确诊的3例恶性黑素瘤切除标本,提取样本的总蛋白质,运用差异凝胶电泳技术分离蛋白质,DeCyder软件分析蛋白图谱的差异,以基质-辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对差异表达蛋白质进行质谱鉴定。结果：质谱鉴定出差异蛋白质点12个,按功能分为4类,其中上调蛋白质3类,为14-3-3蛋白sigma、角蛋白和serpin B3;下调蛋白质1类,为白蛋白。结论：14-3-3蛋白sigma和serpin B3可能参与恶性黑素瘤的发生和发展,其差异表达提示了可能的恶性黑素瘤的发病机制。     

宫颈永生化细胞和癌细胞的胞质蛋白双向电泳图谱的建立及初步分析

目的:建立HPV-16阳性的宫颈上皮永生化细胞(H8细胞株)和宫颈癌细胞(CaSKi细胞株)胞质蛋白双向电泳图谱,并初步分析找出特征性的差异蛋白点.方法:分别培养H8和CaSki细胞,用亚细胞结构蛋白质提取试剂盒提取胞质蛋白进行双向电泳,用ImageMaster 2D V2002.1图像分析软件分析电泳图谱,筛选差异蛋白点.结果:获得了分辨率和重复性均较好的宫颈永生化细胞和癌细胞胞质蛋白2-DE图谱,并分析找出了显著的差异蛋白点8个,其中3种蛋白质在宫颈癌细胞株表达上调,1种蛋白质表达明显下调,2种蛋白质在宫颈癌细胞株表达缺失,2种蛋白质在永生化细胞株表达缺失.结论:应用亚细胞蛋白双向凝胶电泳技术对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的胞质蛋白分析,能有效找出蛋白质表达差异点,为进一步确定宫颈癌前病变和癌细胞的关键性差异蛋白质的结构和功能奠定了基础.     

蜈蚣提取液治疗肝癌Bel-7404细胞后的差异表达蛋白研究

目的 筛选蜈蚣提取液(ECP)治疗肝癌Bel-7404细胞后的相关差异表达蛋白,探讨其药物治疗机.方法 一步抽提法制备肝癌Bel-7404细胞株治疗组ECP浓度(10 mg/mL)和对照组(RPIM1640完全培基培养)的总蛋白质,双向凝胶电泳建立两组总蛋白的双向凝胶电泳图谱,PDQuest软件对其图谱比较,MALDI-TOF-MS对差异表达的蛋白质进行分析并获取肽质量指纹图谱,数据库搜索鉴定主要差异表达蛋白质.结果 共发现76个差异表达蛋白点(P<0.05).治疗组中41个表达下调,35个表达上调.选择最明显的14个蛋白质斑点作质谱分析,其中肽基脯氨酰顺反异构酶A(PPIA)、核纤层蛋白-Bl(Lamin-B1)、黄素还原酶(FRase)、转铁结合蛋白2(Tbp2)、唾液酸合成酶(SAS)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),周期素依赖激酶抑制蛋白1(P21)和半乳凝素(Gal-7)在治疗组中表达上调,角蛋白(CK-19)、肌动蛋白(Actin)、转内质网ATP(三磷酸腺苷酶)酶(TER AIPase)、ω-1谷胱甘肽转移酶(GSTOl-1)、抑制蛋白(PFNl)及碱性磷酸酶(ALP)在治疗组中表达下调.结论 ECP能诱导肝癌Bel-7404细胞内某些蛋白异常表达,能多途径抑制肝癌细胞的生长,诱导其凋亡或直接死亡.     

宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织差异表达蛋白分析

目的探讨蛋白质组学方法筛查正常宫颈与宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)组织中的差异表达蛋白质标志物,为研究CIN发生的分子机制及临床诊治工作提供依据。方法收集2008年8月至2009年9月间首都医科大学附属北京妇产医院妇瘤科收治的正常子宫颈组织因子宫肌瘤手术行全子宫切除术患者9例为对照组、CIN组织23例(其中CINⅠ7例、CINⅡ8例、CINⅢ8例)。应用二维荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2-DDIGE)及DeCyder软件寻找差异表达蛋白质点,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分析差异蛋白质点,数据库搜索鉴定差异表达最明显的S100蛋白家族A9(S100 calcium-binding protein A9,S100A9),真核延长因子1α1(eukaryoticelongation factor 1-alpha-1,eEF1A1)及丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)3种蛋白质;应用免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)(其中正常宫颈组织10例、CINⅠ10例、CINⅡ10例、CINⅢ10例)及蛋白印记法(Western blotting)(其中正常宫颈组织12例,CINⅠ～Ⅱ12例,CINⅢ12例)进一步验证上述3种蛋白在CIN组织和正常宫颈组织的表达差异。结果获得CIN组织与正常宫颈组织2-D DIGE图,成功鉴定25个蛋白;免疫组化及蛋白印迹验证结果提示:S100A9蛋白表达于细胞质中,在CIN中表达水平高于正常组,差异有统计学意义(P=0.010);eEF1A1蛋白表达于细胞质中、PKM2蛋白表达于细胞核中,2者在CIN中表达水平均低于正常组,差异有统计学意义(P分别为0.352,0.000)。结论在正常宫颈组织与CIN组织之间存在差异蛋白质表达,S100A9蛋白可能成为辅助诊断CIN的相关标志物,PKM2蛋白可能成为抑制CIN发生的蛋白质,并可根据2种差异蛋白表达预测CIN的发生发展。     

应用基质辅助激光解吸质谱的源内衰变及串联质谱技术测定重组人纽兰格林的C端序列

目的测定重组人纽兰格林的C端序列。方法用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI—TOF-MS）的源内裂解（ISD）及串联质谱技术（TOF—TOF,LIFT）,测定重组蛋白纽兰格林的C端序列。结果用该方法鉴定了重组蛋白纽兰格林C端序列的10个氨基酸残基。结论与现有的C-端序列测定方法比较,该方法简便快捷,可适用于部分重组蛋白药物的质量控制。     

TA2小鼠自发乳腺癌血清蛋白质组学研究

目的:采用双向电泳-质谱技术寻找TA2小鼠自发性乳腺癌发生相关的差异蛋白.方法:收集5只TA2自发乳腺癌小鼠和5只正常TA2小鼠血清,将血清标本进行双向电泳,经软件分析结合人工比对确认差异蛋白点,基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱对差异蛋白点进行鉴定.结果:在TA2自发乳腺癌小鼠和正常TA2小鼠血清间共找到11个差异蛋白质点,成功鉴定出5种蛋白质,它们分别为:妊娠区带蛋白、对氧磷酶、HemK家族修饰性甲基化酶、结合珠蛋白和血清淀粉样P成分.其中这5种蛋白均在TA2自发乳腺癌小鼠高表达,而在正常TA2小鼠呈低表达或表达缺失.结论:通过双向电泳质谱技术鉴定出的5种差异蛋白与乳腺癌的发生有一定关系,初步阐述了TA2小鼠自发乳腺癌发生的机制.     

SELDI-TOF-MS技术结合LCM技术分析结肠癌细胞蛋白质组学构成

目的表面增强激光解吸电离质谱(SELDI-TOF-MS)技术结合激光捕获微切割(LCM)分析正常结肠粘膜上皮细胞和结肠癌细胞的蛋白质组学构成.方法将新鲜结肠标本常规制备冰冻组织切片,通过激光捕获微切割从组织冰冻切片中分别切取结肠粘膜上皮细胞和结肠癌细胞,SELDI技术分析蛋白质组学构成.结果激光捕获微切割可正确有效地分离结肠癌和正常粘膜上皮细胞;比较结肠癌和正常结肠粘膜细胞的飞行质谱图提示有多处峰存在显著性差异.结论 SELDI技术结合激光捕获微切割技术可以快速有效分析结肠癌细胞的蛋白质构成;所获结果为结肠癌发生发展过程细胞蛋白质文库的建立提供了依据.     

联合磁性微球和基质辅助的激光解吸/离子化-飞行时间质谱筛选肾细胞癌血清差异蛋白

目的 采用联合磁性微球和基质辅助的激光解吸/离子化-飞行时间(MALDI-TOF-MS)技术筛选肾细胞癌患者血清差异蛋白峰.方法 采用弱阳离子磁性微球从99份血清标本(肾细胞癌62份,肾脏良性占位病变37份)捕获血清蛋白,MALDI-TOF-MS质谱仪检测蛋白峰,Biomarker Wizard 3.1和Biomarker Patterns Software 5.0分析数据,以47例肾细胞癌及26例肾脏良性占位病变标本建立肾细胞癌诊断模型,15例肾细胞癌和11例肾脏良性占位病变标本进行盲法验证.结果 发现7个蛋白峰具有统计学差异(P＜0.05),以质荷比2945.35、15340.8、6984.51、5819.23的4个蛋白峰建立肾细胞癌诊断模型,该模型区分肾细胞癌与肾脏良性占位病变的敏感性为83.0%,特异性为84.6%;盲法验证,该模型诊断肾细胞癌的敏感性为80.0%,特异性为81.8%.结论 采用磁性微球与MALDI-TOF-MS技术可以检测肾细胞癌血清中的差异蛋白峰,并建立敏感性、特异性较高的肾细胞癌诊断模型.     

肝癌细胞线粒体蛋白的MALDI-TOF质谱鉴定方法研究

目的:探索胶上蛋白原位酶切、肽质量指纹图(PMF)分析以及数据库检索方法的优化条件,建立适合于亚细胞比较蛋白质组学研究的质谱鉴定策略.方法:从考马斯亮蓝染色的2-DE胶上取下牛血清白蛋白(BSA)标准蛋白进行胶内原位酶切,与基质(CHCA)混匀后进行MALDI-TOF MS分析;对来源于人肝细胞癌细胞株QGY-7703线粒体的差异表达的候选蛋白点L9,按照通过BSA标准蛋白优化的条件进行MALDI-TOF质谱鉴定;其肽质量指纹图(PMF)经MS-Fit检索.结果:经数据库检索,BSA的肽质量指纹图(PMF)匹配肽质量数为10/11,序列覆盖率为19%,说明实验条件完全可信.候选蛋白点L9的PMF数据经数据库检索后,排名前两位的蛋白均为OXCT(3-oxoacid CoA transferase 1 precursor),其匹配肽段为9/13,序列覆盖率为24%;且OXCT的理论分子量(56kda),理论等电点(7.1),与胶上L9蛋白的位置相符.故候选蛋白点L9确认为OXCT(3-oxoacid CoAtransferase1 precursor).结论:本文所确定的鉴定策略适用于线粒体比较蛋白质组学的研究.     

不同恶性度膀胱癌细胞系的比较蛋白组学研究

目的 利用比较蛋白质组学双向电泳技术,观察不同恶性程度和侵袭力的人膀胱移行细胞癌细胞系T24和BIU-87蛋白表达谱的变化.方法 人膀胱癌细胞(BIU-87和T24)经培养后提取总蛋白.双向凝胶电泳,经考马斯亮蓝染色后比较两者蛋白图谱寻找差异表达蛋白质.采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和蛋白质数据库检索鉴定差异蛋白.结果 比较T24和BIU-87的蛋白质斑点发现差异大于2倍的蛋白质点153个,对其中94个差异蛋白斑点进行了质谱鉴定和肽质量指纹图分析.相对于BI-U-87,恶性度高的T24表达上调的蛋白质有Rho GDP-解离抑制因子1、组织蛋白酶D、细胞角化蛋白19、ACTG1蛋白、超氧化物歧化酶、热休克蛋白、ACTB蛋白和硫氧还蛋白4等;表达下调的蛋白有14-3-3 δ蛋白、orphan hormone nuclear receptor RORalpha3等.结论 人膀胱移行细胞癌T24和BIU-87细胞有153个蛋白质的表达发生变化.深入分析这些差异表达蛋白的功能与调控,有望为寻找恶性程度相关的生物学标记物提供重要的实验依据.     

喉鳞形细胞癌比较蛋白质组的初步研究

目的:研究喉癌及癌旁喉正常黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳分离喉癌及癌旁喉正常黏膜组织总蛋白质,考马斯亮蓝染色显色、ImageMaster 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.取差异表达的蛋白质点进行质谱鉴定.结果:获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,并找出在喉癌和癌旁喉正常黏膜组织差异表达的33种蛋白质.其中有22种蛋白质在喉癌组织中表达上凋,11种蛋白质表达明显下调.随机取10个在喉癌组织中表达上调的蛋白点进行质谱指纹图分析,查询数据库初步鉴定出了8个蛋白质.结论:本研究建立了分辨率和重复性较强的喉癌及喉正常黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,差异表达的蛋白质可能成为潜在的诊断喉癌的肿瘤标志物和治疗靶分子,对探讨喉癌的发生机制有重要意义.     

胰腺癌差异蛋白质组学研究

目的 通过差异蛋白质组学研究,确定胰腺癌组织及相应正常胰腺组织之间蛋白质表达谱的差异,进而阐明其表达水平的变化与胰腺癌发生发展之间的关系.方法 选取胰腺癌组织及相应正常胰腺组织6对,提取总蛋白进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,经PDQuest软件分析,获得差异表达蛋白质点.差异蛋白质点经过切取、酶解后进行电喷雾四极杆飞行时间...     

HPV永生化细胞系与SiHa细胞系蛋白质表达差异的质谱分析

目的：分析人乳头瘤病毒（HPV）永生化细胞系与SiHa细胞系之间的蛋白质表达差异,探讨从HPV感染到宫颈癌发生间的变化。方法高效液相色谱（LC）与质谱（MS）联用对HPV永生化细胞系与SiHa细胞系的蛋白质进行鉴定,然后通过蛋白质组学和生物信息学分析两种细胞系之间的蛋白表达,及一种新型翻译后修饰－琥珀酰化修饰的差异。结果在两种细胞系中,质谱鉴定到的蛋白总数为10691个,琥珀酰化修饰位点共6342个;非标定量分析共发现572种差异表达蛋白。HPV永生化细胞系中高表达的273种蛋白多集中在疾病的相关通路,而宫颈癌细胞系中高表达的299种蛋白多集中在代谢通路和核糖体通路。琥珀酰化修饰无差异,但发现一个新的琥珀酰化修饰位点———血清和糖皮质激素激酶1（SGK1）K41琥珀酰化。结论与HPV永生化细胞系相比,SiHa细胞系代谢能力及翻译蛋白能力更强;而HPV永生化细胞中高表达蛋白则大多与疾病相关,且更易发生恶化。     

宫颈癌腹腔镜根治术与开放性手术的疗效分析

目的:观察宫颈癌(FIGO分期Ⅰa2~Ⅱa)患者应用腹腔镜根治术与开放性手术疗效,为合适宫颈癌术式选择提供依据。方法:选取2012~2014年在弋矶山医院妇科住院并行宫颈癌根治术的82例患者(FIGO分期Ⅰa2~Ⅱa)作为研究对象,按手术方法分为观察组(腹腔镜手术)和对照组(开放性手术)各41例,比较两组围术期情况、病理及随访资料。结果:与对照组比较,观察组手术时间缩短(t=3.735,P=0.000)、术中出血减少(t=3.539,P=0.000)、肛门排气时间及住院时间均缩短(t=3.252、4.210,P均<0.01);观察组清扫淋巴结数量(23.60±6.82)枚多于对照组(20.08±6.39)枚,差异有统计学意义(t=2.412,P=0.018);术后生活质量EORTC QLQCA30量表评分观察组72.44±9.78,对照组66.15±8.72,两组差异有统计学意义(t=3.074,P=0.003);但两组并发症发生率、术后复发生存率、子宫主骶韧带及阴道切除长度比较差异均无统计学意义(χ~2=0.901、0.311、0.456,t=0.216、1.140、1.966,P均>0.05)。结论:腹腔镜宫颈根治术具有微创、安全、临床疗效佳等优势,是治疗宫颈癌可靠有效的方法,值得推广应用。     

宫颈癌细胞中与UTF1相互作用的蛋白分析

【摘要】目的 探讨宫颈癌细胞中与转录辅激活因子（UTF1）相互作用的蛋白。方法 构建稳定表达FLAG HA 双标签标记的UTF1蛋白的SiHa 细胞株,利用FLAG HA 串联亲和纯化( TAP) 双标签纯化实验,对目的条带进行质谱分析。结果 成功构建稳定表达FLAG HA 双标签标记的UTF1 细胞株。通过质谱分析得到UTF1相互作用的蛋白数据,结果显示UTF1 捕获蛋白参与DNA修复、代谢、核糖体、细胞连接、细胞因子相互作用、吞噬等多种生物学过程,以及Jak STAT、MAPK、mTOR、VEGF、 wnt 等多条信号通路,并与系统性红斑狼疮、帕金森症、阿尔兹海默症、自身免疫性疾病等的发病相关。结论 UTF1 捕获蛋白参与细胞多种生理及病理过程,为进一步了解UTF1在肿瘤发病机制中的作用提供了新的线索。     

乳腺癌转移相关蛋白蛋白质组学初步研究

目的筛选人乳腺癌腋窝淋巴结转移相关蛋白,并对所筛选的两个差异蛋白进行验证。方法选取有淋巴结转移和无淋巴结转移的乳腺癌新鲜标本各10例,提取组织蛋白进行双向凝胶电泳（2D PAGE）,通过对比分析筛选出差异蛋白点并进行质谱鉴定(MALDI TOF MS)。免疫组织化学SP法检测72例乳腺癌组织中差异表达蛋白Stathmin和Ezrin。结果质谱鉴定出214个蛋白位点。排除胶原蛋白、血清白蛋白及电泳弥散等造成的部分相同蛋白后,筛选出表达差异≥3.0倍的蛋白36个。免疫组织化学检测显示Stathmin、Ezrin蛋白在乳腺癌淋巴结转移组和无淋巴结转移组阳性率分别为73.5%、47.4% 和78.6%、46.9%,两组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论淋巴结转移组和无转移组乳腺癌组织存在多种差异蛋白。Stathmin、Ezrin蛋白可能参与了乳腺癌的浸润与转移过程。     

黄芪注射液对宫颈永生化上皮细胞生长的作用及其细胞周期调控机理

目的:研究黄芪注射液对宫颈永生化上皮细胞生长的调节作用及细胞周期调控机理。方法:选择宫颈永生化上皮细胞(H8细胞)进行实验,用不同浓度的黄芪注射液进行处理,采用MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测不同细胞周期的比例以及不同免疫细胞亚群的含量,采用PCR法检测细胞周期相关蛋白的mRNA含量。结果:黄芪注射液处理能够以剂量依赖性的方式降低细胞活力,200μg/mL浓度的抑制效应最显著;200μg/mL黄芪处理组的NK细胞、CD3~+CD4~+CD8~-T细胞含量以及CD3~+CD4~+CD8~-/CD3~+CD4~-CD8~+T细胞比例高于0μg/mL黄芪处理组,CD3~+CD4~-CD8~+T细胞含量低于0μg/mL黄芪处理组;200μg/mL黄芪处理组的G0/G1期、S期细胞比例以及cyclinA、cyclinB、cyclinD1的mRNA含量低于0μg/mL黄芪处理组,G2/M期细胞比例高于0μg/mL黄芪处理组(均P<0.05)。结论:黄芪注射液对宫颈永生化上皮细胞的生长具有抑制效应,其作用途径包括调节免疫细胞含量、停滞细胞周期和下调细胞周期相关蛋白的表达。