山胡椒内生真菌Trichoderma sp. SHJN1和Perenniporia sp. SHJG1的抗肿瘤活性成分研究

目的 从民族药山胡椒内生真菌Trichoderma sp.SHJN1和Perenniporia sp.SHJG1的代谢物中寻找活性先导化合物。方法 采用正相硅胶、反相硅胶、Sephadex LH-20凝胶及制备型HPLC等对Trichoderma sp.SHJN1和Perenniporia sp.SHJG1发酵物进行分离纯化,再通过NMR、ESI-MS等鉴定化合物结构,同时采用人乳腺癌细胞（MCF-7）和人肺癌细胞（A549）对这些化合物的抗肿瘤活性进行初步评价。结果 从2株内生真菌次级代谢产物中共分离鉴定了12个化合物：alantrypinone （1）、oryzalactam （2）、phomoindene A （3）、cis-gregatin B （4）、huaspenone B （5）、stigmasta-7,22-dien-3β,5α,6α-triol （6）、ergosterol （7）、1-deoxy-2-demethylviridiol （8）、viridiol （9）、trichodermamides A （10）、chromone （11）、对-羟基苯乙酸（12）。抗肿瘤活性评价结果显示,化合物3 抑制MCF-7细胞增殖活性IC₅₀为（62.9±1.02）μmol·L^-1[顺铂（cisplatin,DDP） IC₅₀为（30.1±1.67）μmol·L^-1];化合物8 和9 抑制A549细胞增殖活性的IC₅₀分别为（34.6±1.57）μmol·L^-1和（44.9±1.74）μmol·L^-1[DDP IC₅₀为（20.6±1.42）μmol·L^-1]。结论 化合物3 ,8 和9 具有潜在抗肿瘤活性。     

LC-QQQ-MS/MS分析苯磺酸氨氯地平中痕量苯磺酸酯类基因毒性杂质

目的 建立LC-QQQ-MS/MS分析测定苯磺酸氨氯地平中痕量苯磺酸酯类基因毒性杂质苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯和苯磺酸异丙酯的检测方法。方法 采用Agilent Zorbax SB-C₁₈（3.0 mm×100 mm,1.8 μm）色谱柱,以水（含5 mmol·L^-1甲酸铵和0.1%甲酸）和甲醇（含5 mmol·L^-1甲酸铵和0.1%甲酸）为流动相,梯度洗脱,流速0.4 mL·min^-1,电喷雾离子化（ESI）,正离子模式下MRM采集。结果 苯磺酸甲酯定量下限为20 ng·mL^-1,苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯和苯磺酸异丙酯定量下限为1 ng·mL^-1;方法精密度良好,保留时间和峰面积RSD均<5%（n=10）;苯磺酸甲酯在20~1 000 ng·mL^-1,苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯和苯磺酸异丙酯在1~1 000 ng·mL^-1内呈良好的线性关系,r≥0.998;方法准确度良好,平均加样回收率（n=10）分别为99.77%,100.19%,94.21%和92.43%。5个不同厂家生产的苯磺酸氨氯地平中苯磺酸甲酯的含量均-1）,苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯和苯磺酸异丙酯的含量均-1）。结论 该方法可用于苯磺酸氨氯地平中痕量基因毒性杂质苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸丙酯和苯磺酸异丙酯含量的检测分析。     

HPLC测定盐酸丙卡特罗片中有关物质的含量

目的 建立高效液相色谱法测定盐酸丙卡特罗片中的有关物质。方法 采用Waters Symmetry Shield^TM C₁₈（4.6 mm×150 mm,5 μm）,以1.0 mmol·L^-1庚烷磺酸钠-甲醇-醋酸（81∶15∶4）为流动相;流速为1.0 mL·min^–1;柱温为35℃;检测波长为254 nm。结果 杂质A、B、C线性相关系数均>0.999,其平均回收率为95.0%~105.0%（n=9）,校正因子分别为1.0,0.4,0.5。结论 该法专属性强、简便可靠,适用于盐酸丙卡特罗片有关物质检查,为其质量控制提供检测依据。     

罗汉果苷V通过Wnt/β-catenin信号通路对糖尿病状态成骨细胞增殖与分化的影响

目的:探索罗汉果苷V(mogroside V,MV)对糖尿病状态下成骨细胞增殖分化的影响及其可能的作用机制。方法:构建糖尿病大鼠模型,分离培养正常大鼠和糖尿病大鼠下颌骨成骨细胞。CCK8法检测不同质量浓度MV对糖尿病大鼠成骨细胞的毒性和增殖活性,并筛选出适宜的MV浓度用于后续实验;取正常大鼠和糖尿病大鼠下颌骨成骨细胞,分别设立正常对照组、高糖组及MV+高糖组,茜素红染色及定量分析检测成骨分化情况,实时荧光定量PCR检测成骨相关因子ALP、OCN及Wnt/β-catenin信号通路相关因子Runx2,β-catenin,Axin2,Lef1及Osterix的mRNA表达。结果:0~0.4 g·L^-1质量浓度范围内MV对糖尿病状态成骨细胞均未表现出毒性,且浓度为6.25×10^-3g·L^-1时促进细胞增殖活性最强;与高糖组相比,MV+高糖组(含质量浓度为6.25×10^-3g·L^-1 MV)成骨分化能力增强,ALP、OCN、Runx2、β-catenin、Lef1、Osterix的表达显著升高,Axin2的表达显著降低。 结论:罗汉果苷V可促进糖尿病状态成骨细胞增殖与分化,其机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。     

HPLC-MS/MS分析阿哌沙班中基因毒性杂质及基质效应消除研究

目的 建立HPLC-MS/MS测定阿哌沙班中基因毒性杂质胺化物、开链酰胺和肼基物的方法。方法 色谱柱为Zobax Eclipse XDB C₁₈(3.0 mm×150 mm,3.5μm);胺化物和开链酰胺测定采用梯度洗脱法,流动相A为10 mmol·L^-1乙酸铵溶液,流动相B为乙腈;肼基物测定采用等度法,流动相为水-甲醇(30∶70)。电喷雾离子化法在正离子模式下进行多重反应离子监测结构确认。结果 胺化物、开链酰胺和肼基物平均回收率分别为99.6%,92.2%和97.5%,RSD分别为3.8%,1.9%和7.2%(n=9);定量限分别为0.05,0.05,0.05 ng·mL^-1。结论 该方法有效地消除了分析中出现的基质效应,可用于阿哌沙班中基因毒性杂质的定量检测。     

16种核苷与核苷酸LC检测方法的建立及质谱裂解规律的研究

目的 建立通用LC-MS法用于分离和鉴定核苷(酸)化合物。方法 选用ODS-AQ柱,流动相A为缓冲液1(120mmol·L^-1 Na₂HPO₄,120mmol·L^-1 KH₂PO₄和3mmol·L^-1 TBAOH),流动相B为水,流动相C为甲醇,梯度洗脱,对16种核苷和核苷酸化合物进行分离分析。采用电喷雾离子化(ESI)检测,喷雾电压4000V(正离子模式)/3500V(负离子模式),雾化气压力45psi,干燥气流量10L·min^-1,去溶剂温度350℃。碎裂电压为180V,碰撞能量设置为5~30eV,对4种不同类型的核苷和核苷酸化合物的质谱碎片进行分析。结果 建立的LC方法对16个代表性核苷(酸)化合物达到了基线分离(R>2.0),基于质谱碎片规律,构建核苷(酸)化合物的质谱平台。结论 建立的LC-MS方法可为未知的核苷(酸)化合物的分离与鉴定提供参考。     

福建道地药材枇杷叶ISSR反应体系的建立与优化

目的 建立适于福建产枇杷叶的ISSR分析的PCR反应体系,筛选适宜引物,并确定最佳退火温度。方法 改良的CTAB法提取嫩叶中DNA,通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件,利用梯度PCR确定引物最佳退火温度。结果 适于枇杷叶ISSR最佳的反应体系为：总反应体积为25 μL,其中模板DNA 60 ng,Taq DNA聚合酶0.9 U,引物浓度0.4 μmol·L^-1,dNTP浓度200 μmol·L^-1,10×Buffer(含Mg²⁺) 2.5 μL,加入灭菌去离子水至25 μL。扩增程序为：预变性94 ℃ 7 min,变性94 ℃ l min,复性最佳退火温度1 min,延伸72 ℃ 1 min,35个循环,72 ℃延伸10 min。在100条引物中筛选出14条扩增条带清晰且条带数目较多的引物,最佳退火温度为48~58 ℃(因引物不同而异)。 结论 建立了枇杷叶ISSR最佳反应体系,筛选出14条引物并确定了最佳退火温度,为应用ISSR技术鉴定枇杷叶的种质资源和遗传多样性研究奠定了基础。     

己酮可可碱联合骨髓间充质干细胞对高糖诱导的肾小球系膜细胞炎症因子及NF-κB信号通路的影响

目的 探讨己酮可可碱（pentoxifylline,PTX）联合骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）对高糖作用下肾小球系膜细胞炎症因子及NF-κB信号通路的影响。方法 体外高糖培养小鼠肾小球系膜细胞,分为6组：对照组、糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）组、MSCs组、MSCs+PTX 0.1 mmol·L^-1组、MSCs+PTX 0.3 mmol·L^-1组和MSCs+PTX 1 mmol·L^-1组。采用ELISA检测各组系膜细胞IL-6和TNF-α含量,采用Western blotting检测各组系膜细胞中NF-κB p65,IKKα及IKKβ蛋白的表达。结果 与对照组相比,DN组系膜细胞的IL-6和TNF-α含量显著增高（P<0.05）,NF-κB p65、IKKα及IKKβ蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）。与DN组相比,MSCs组及MSCs组联合不同浓度PTX干预组的系膜细胞分泌的IL-6及TNF-α含量出现明显降低（P<0.05）,NF-κB p65、IKKα及IKKβ蛋白表达量显著降低（P<0.05）。与MSCs组比较,MSCs+PTX 0.1 mmol·L^-1组、MSCs+PTX 0.3 mmol·L^-1组及MSCs+PTX 1 mmol·L^-1组的IL-6和TNF-α含量显著下降（P<0.05）,NF-κB p65、IKKα和IKKβ的蛋白相对表达量明显降低（P<0.05）,且呈现PTX浓度依赖性。结论 PTX联合MSCs通过抑制高糖诱导下肾小球系膜细胞中NF-κB信号通路的表达及炎症因子水平对DN具有一定的治疗作用。     

LC-MS/MS同时测定人血浆中6种抗真菌药物浓度

目的 建立LC-MS/MS方法同时测定人血浆中氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、羟基伊曲康唑、卡泊芬净6种抗真菌药物的浓度。方法 向50 μL血浆样本中加入含同位素内标的甲醇沉淀蛋白后稀释进样分析。色谱柱为Kinetex C₁₈（3 mm×100 mm,2.6 μm）,流动相为0.1%甲酸-水（含5 mmol·L^-1乙酸铵）和0.1%甲酸-甲醇,梯度洗脱,流速为0.6 mL·min^-1,进样量为5 μL,分析时间为5 min。采用电喷雾离子源,正离子多反应监测模式扫描,用于定量分析的离子对分别为m/z 307.0→220.2（氟康唑）、m/z 350.1→224.1（伏立康唑）、m/z 701.4→683.2（泊沙康唑）、m/z 705.2→392.2（伊曲康唑）、m/z 721.5→408.3（羟基伊曲康唑）、m/z 547.4→131.1（卡泊芬净）。结果 6种抗真菌药物在0.1~20 μg·mL^-1内线性良好（r≥0.995 0）,准确度为90.35%~114.94%,仪器精密度RSD均<15%（定量下限处<20%）。提取回收率和基质效应分别为71.99%~90.38%和96.78%~134.17%。稳定性符合生物样本分析方法验证要求。应用本方法测定25例侵袭性真菌感染患者的血浆谷浓度,其中伏立康唑谷浓度0.70~12.94μg·mL^-1,氟康唑4.57~12.64 μg·mL^-1,个体间差异较大。结论 本方法操作简单快捷,准确度和灵敏度高,重现性良好,适用于临床治疗药物监测。     

离子色谱法测定小儿止咳糖浆中氯化铵的含量

目的 建立离子色谱法测定小儿止咳糖浆中氯化铵含量的方法。方法 离子色谱法采用IonPac^TM AS11-HC阴离子交换色谱柱(2.0 mm×250 mm)与IonPac^TM AG11-HC保护柱(2.0 mm×50 mm),检测器为抑制电导检测器,电导检测池温度为35℃,柱温为30℃,进样量为25 μL,以10 mmol·L^–1氢氧化钾溶液为流动相,流速为0.5 mL·min^–1。结果 氯离子浓度为10~400μg·mL^–1时,峰面积与其浓度呈良好的线性关系(r=1.000 0,n=6);平均回收率为100.57%(RSD=0.41%,n=6)。结论 该方法专属性强、准确度高,可用于小儿止咳糖浆中氯化铵的含量测定。     

UPLC同时测定生脉饮口服液中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素的含量

目的 建立UPLC测定生脉饮口服液中有效成分（五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素）含量的方法。方法 采用XBridge^® BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm,2.5 μm）,以乙腈（A）-水（B）为流动相进行梯度洗脱,流速0.5 mL·min^-1,进样量5 μL;柱温为40℃;检测波长为203 nm。结果 五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素检测质量浓度线性范围分别为1.950~124.8μg·mL^-1（r=0.999 9）、1.375~88.00μg·mL^-1（r=0.999 9）、1.594~102.0μg·mL^-1（r=0.999 9）;定量限≤0.137 5μg·mL^-1,检测限≤0.068 8μg·mL^-1;仪器精密度、稳定性、重复性试验的RSD≤1.18%;加样回收率分别为98.65%（RSD=0.82%）,98.47%（RSD=1.21%）,99.24%（RSD=0.99%）。结论 该方法操作简便,仪器精密度、稳定性、重复性好,可用于生脉饮口服液中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素含量测定。     

心脉隆对离体人脐动脉血管张力的影响及其机制

目的：探讨心脉隆对离体人脐动脉血管张力的影响,并分析其机制。方法：运用离体血管张力测定实验方法,累积加入不同浓度的心脉隆,观察其对静息人脐动脉的张力影响;加入60 mmol·L^-1 KCl、1 μmol·L^-1苯肾上腺素（PE）使血管收缩、张力平稳后,观察不同浓度心脉隆对预收缩的人脐动脉张力的影响;同时观察细胞外Ca²⁺浓度、L-型钙通道阻滞剂维拉帕米（VEP）对心脉隆血管效应的影响。结果：心脉隆能浓度依赖性收缩静息状态下内皮完整的离体人脐动脉,对KCl、PE预收缩的离体人脐动脉有进一步增加张力的作用,在无钙灌流液中诱发的血管收缩效应明显减弱,随着细胞外Ca²⁺浓度增加其致血管收缩张力增加,维拉帕米能显著抑制心脉隆对人脐动脉的收缩反应。结论：心脉隆可促进细胞外Ca²⁺内流和细胞内Ca²⁺释放,从而具有浓度依赖性地收缩离体人脐动脉的作用。     

丙泊酚抑制GRP78/PERK/CHOP通路改善PE诱导H9C2细胞凋亡的研究

目的:研究丙泊酚对苯肾上腺素(phenylephrine, PE)诱导H9C2心肌细胞的影响及机制。方法:H9C2细胞均分为5组,PE诱导细胞凋亡模型,用0.5,1,1.5 mmol·L^-1丙泊酚预处理。采用流式细胞术检测凋亡率;RT-qPCR检测GRP78/PERK/CHOP通路的mRNA表达;蛋白质印迹检测GRP78/PERK/CHOP通路蛋白、caspase-12、caspsae-3、SERCA2a的表达;定磷法检测SERCA2a活性。结果:PE诱导心肌细胞凋亡率升高,GRP78/PERK/CHOP通路mRNA及蛋白表达升高,caspase-12、caspsae-3表达升高,SERCA2a蛋白表达及活性降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。中、高浓度的丙泊酚可明显逆转PE诱导的上述指标变化,且差异有统计学意义(P均<0.05)。结论:丙泊酚通过恢复SERCA2a的活性及表达量、抑制GRP78/PERK/CHOP通路,降低PE诱导的心肌细胞凋亡。     

UHPLC-Q-TOF-MS/MS分析浙贝母不同部位化学成分

目的 建立UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析浙贝母不同部位（花、叶、茎和鳞茎）化学成分,探讨浙贝母中不同部位化学成分的差异。方法 浙贝母样品提取后,以水（含有25 mmol·L^-1的醋酸铵及25 mmol·L^-1的氨水）-乙腈为流动相,经UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.7 μm）梯度洗脱分离,在电喷雾离子源正离子模式下进行分析,通过二级串联质谱分析,对采集的图谱进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理等进行特征峰提取;用主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析进行数据分析。结果 共鉴定出113个化学成分。主成分分析结果显示浙贝母花、鳞茎、茎、叶明显分为4类,表明不同部位之间化学成分差异显著;正交偏最小二乘法-判别分析结果显示浙贝母花和茎、鳞茎、叶之间差异化合物分别为16,19,12个。其中,异戊烯基腺嘌呤核苷、脯氨酰天冬氨酸、反玉米素、乙胺嗪在浙贝母花中含量较高。结论 本研究建立了一种快速、准确、可靠的浙贝母不同部位的鉴别方法,为浙贝母资源的综合开发利用提供了科学依据。     

丹参水溶性成分拮抗脂多糖诱导HTR8/SVneo滋养层细胞凋亡的作用机制

目的 探讨丹参水溶性成分拮抗脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导HTR8/SVneo细胞凋亡的相关作用机制。方法 以不同浓度(0,100,200,400,800,1 600 ng·mL^-1)LPS处理HTR8/SVneo细胞,采用实时定量聚合酶链式反应验证HTR 8/SVneo细胞炎症模型的建立;细胞活力检测试剂盒检测各组细胞活力;划痕试验评估各组细胞向损伤区域迁移能力;流式细胞术检测各组细胞凋亡率并分析各组细胞线粒体膜电位。结果 200 ng·mL^-1 LPS干预后HTR8/SVneo细胞的NLRP3炎症小体指标及炎症因子表达量增高(P<0.05)。与LPS组相比,丹酚酸B(0.08 μmol·L^-1)、丹酚酸C(0.4 μmol·L^-1)、紫草酸(0.08 μmol·L^-1)干预后HTR8/SVneo细胞活性明显升高(P<0.01)。与LPS组比较,丹参水溶物质组凋亡率显著降低(P<0.05或P<0.01),线粒体膜电位水平显著升高。结论 丹参水溶物质能够提高LPS干预后HTR8/SVneo细胞活力,改善细胞迁移能力,提高细胞线粒体膜电位,进而抑制细胞凋亡。     

氯沙坦钾氢氯噻嗪片体外药物释放关键影响因素的研究

目的 研究影响氯沙坦钾氢氯噻嗪片体外药物释放的关键因素。方法 以pH值3.5缓冲液为溶出介质,采用桨法+沉降篮(转速50 r·min^–1)测定体外溶出量。HPLC色谱柱为Kromasil 100-10 C₈,流动相为0.01 mol·L^–1磷酸二氢钾溶液(pH值2.5)-乙腈(2∶3),检测波长230 nm,进样量20 μL,流速为2.3 mL·min^–1。结果 研究发现,证实自研片和原研片在该介质中释放差异的主要原因系包衣粉中着色剂不同。进一步研究发现,喹啉黄铝色淀本身的形态和性质在酸介质中有延缓药物释放的作用,此外包衣粉中的水溶性聚合物羟丙纤维素与pH值3.5缓冲液的相互作用也是延缓药物释放的重要因素。结论 速释薄膜包衣粉中着色剂和水溶性聚合物实际上对药物的体外释放有直接的影响。     

九牛造提取物与鞣花酸单体在大鼠体内药动学比较研究

目的 考察大鼠灌胃九牛造提取物与鞣花酸单体后体内鞣花酸的药动学特征及差异。方法 SD大鼠分别灌胃九牛造提取物3 g·kg^-1与鞣花酸单体205.5 mg·kg^-1（含等量鞣花酸）后,在不同时间点采集血浆,通过HPLC测定鞣花酸的血药浓度,应用DAS 2.0软件拟合大鼠体内鞣花酸的药动学模型,计算药动学参数。结果 大鼠灌胃九牛造提取物后,拟合得到以下药动学参数：t_max=0.25 h;C_max=（1.32±0.30） mg·L^-1;AUC_（0-t）=（2.55±0.54） mg·h·L^-1;AUC_（0-∞）=（3.30±0.53） mg·h·L^-1;t_1/2β=（69.32±2.37） h;大鼠灌胃给予鞣花酸单体后,t_max=0.50 h;C_max=（0.40±0.09） mg·L^-1;AUC_（0-t）=（1.30±0.25） mg·h·L^-1;AUC_（0-∞）=（1.81±0.23） mg·h·L^-1;t_1/2β=（8.16±1.18） h。前者较后者达峰时间提前一半,达峰浓度和血药浓度-时间曲线下面积分别提高约3.30和1.46倍,末端消除半衰期延长约8.49倍。结论 鞣花酸化合物在提取物和单体2种不同给药情况下,药动学行为存在明显差异。大鼠灌胃九牛造提取物后,与口服鞣花酸单体相比,鞣花酸化合物的生物利用度明显提高。