子痫前期孕妇外周血中游离胎儿DNA含量变化

目的探讨正常妊娠不同孕周及子痫前期孕妇外周血中游离胎儿DNA含量的变化。方法对2009年8月至2010年9月西安交通大学第二附属医院外周血样本90例(包括健康未孕10例,正常妊娠40例,子痫前期40例),应用甲基特异性PCR的原理及荧光定量PCR的方法,相对定量法检测u-maspin基因的含量。结果 (1)10例健康未孕样本未检出u-maspin基因;(2)40例正常妊娠样本有34例检出u-maspin基因,各孕期u-maspin基因检出量差异具有统计学意义(P<0.05),u-maspin基因的含量中孕是早孕的4.43倍,晚孕是早孕的5.13倍;(3)40例子痫前期样本均检出u-maspin基因,u-maspin基因的含量子痫前期轻度是正常晚孕的2.39倍,子痫前期重度是正常晚孕的5.78倍。结论孕妇外周血中游离胎儿DNA的含量随着妊娠进展而增加,能够反映子痫前期患病的严重程度。     

孕妇外周血胎儿游离DNA的检测及应用研究

从1997年首次在孕妇外周血中发现胎儿DNA以来,众多学者致力于将其应用于无创性的产前诊断。荧光定量PCR实现了胎儿游离DNA浓度的检测,目前研究发现,正常孕妇血浆胎儿DNA浓度稳定于某一水平,有望成为产前诊断和孕期检测的一项新指标。有学者认为,子痫前期母循环中胎儿DNA可有异常增高,而且子痫前期的孕妇在有临床症状前,孕妇血浆胎儿DNA水平异常增高,这与较多胎儿DNA释放到母血中,和肝肾功能异常导致胎儿DNA在母血中清除紊乱有关。此外许多妊娠合并症和并发症都伴有母外周血DNA水平的异常增高,例如:性连锁疾病、Rh血型不合、父系遗传性疾病、染色体非整倍体胎儿、早产等。现就孕妇外周血胎儿游离DNA的检测及临床应用作一综述。     

子痫前期孕妇外周血浆中高甲基化SIM2基因的含量变化

目的:通过检测高甲基化SIM2基因来分析游离胎儿DNA在正常妊娠孕妇及子痫前期孕妇外周血浆中含量的变化。方法:共收集114例外周血浆样本(包括健康未妊娠女性志愿者10例,产后48小时健康女性10例,正常妊娠孕妇57例,子痫前期孕妇37例),利用HpaⅡ、MspⅠ分别对提取的血浆DNA进行甲基化酶切反应后再进行实时荧光定量PCR反应,相对定量法检测高甲基化SIM2基因的含量。结果:①10例健康未妊娠女性志愿者及产后48小时健康女性外周血浆中均未检测出高甲基化SIM2基因;②57例正常妊娠孕妇中有43例检测出高甲基化SIM2基因,在不同妊娠阶段高甲基化SIM2基因含量的差异有统计学意义,高甲基化SIM2基因的含量在中期妊娠是早期妊娠的2.33倍,晚期妊娠是早期妊娠的5.28倍;③37例子痫前期孕妇中有36例检出高甲基化SIM2基因,高甲基化SIM2基因的含量在轻度子痫前期孕妇血浆中是正常晚期妊娠的3.05倍,在重度子痫前期孕妇中是正常晚期妊娠的6.32倍。结论:高甲基化SIM2基因是可靠的胎儿特异性标记,在孕妇外周血浆中高甲基化SIM2基因的含量随妊娠进展而增加,与孕周有关。高甲基化SIM2基因在子痫前期孕妇血浆中含量明显增加,能够反应子痫前期疾病的严重程度。     

ERG甲基化作为无创产前诊断唐氏综合征标记的可行性研究

目的探讨ERG基因是否可以作为孕早期血浆中检测胎儿DNA的通用标志物。方法随机选择早期妊娠孕妇70例,并以经体检确定为未孕健康妇女70例、分娩过21-三体胎儿的妇女11例和顺产后3 d妇女20例作为对照组。利用甲基化敏感限制性内切酶HpaⅡ、MspⅠ酶切后进行常规PCR的方法,检测血细胞、绒毛和血浆DNA目的基因ERG21-128序列的甲基化模式,并对妊娠组和对照组样本进行统计学分析。结果位于21号染色体上的ERG基因21-128序列在70例孕8、9、10周孕妇绒毛组织中甲基化而在母体血细胞中未甲基化,绒毛甲基化检出率为100%;在血浆中游离胎儿DNA ERG基因21-128序列的甲基化检出率为77.1%,敏感度为77.1%。其中8、9、10周甲基化差异无统计学意义（P〉0.05）。在70例未孕健康妇女、11例生产过21三体胎儿的健康妇女和20例产后3 d妇女的对照组的血浆中ERG 21-128序列均未甲基化。结论在母体和胎儿DNA中,ERG基因21-128区的甲基化有显著性差异,实验方法也比较简单,提示了ERG是无创性产前诊断DS的一个潜在标记物。     

孕妇外周血中胎儿细胞及DNA分离方法的比较

产前非创伤性诊断技术是国内外围生学关注的重要课题。近 10年来 ,由于相关分子生物学、流式细胞学技术的进展 ,人类对研究母亲外周血中胎儿细胞的工作迈进了一大步。但由于母血中胎儿细胞甚微 ,分离及纯化胎儿细胞的技术难点尚未解决 ,使该技术还无法在临床上广泛应用。本研究旨在探索可靠稳定的分离胎儿细胞和ＤＮＡ的方法 ,为产前诊断奠定基础。一、材料和方法1.材料来源 :(1)研究对象 :选择 1997年 10月至 1999年6月在武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科进行产前检查的健康孕妇 15 3例。年龄 2 1～ 35岁 ,孕 5～ 41周 ,血红…     

从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞方法学初探

从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行无创性产前诊断成为新的研究热点,胎儿有核红细胞被认为是最理想的研究对象［１］。本研究采用简单的不连续密度梯度离心法分离富集孕妇外周血中有核红细胞,进行Ｙ染色体特异性ＤＹＺ１基因的聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增以预测胎儿性别,探讨胎儿有核红细胞用于无创性产前诊断的一些问题一、资料和方法　　１．研究对象孕龄６～１４周,年龄２１～３０岁的孕妇共４５例,分为细胞制片组１５例,包括早孕８例,中孕７例;胎儿性别预测组３０例,包括早孕１８例,中孕１２例。此外,以未婚、无妊娠史的２例女…     

孕妇血浆中游离胎儿DNA测定在产前诊断中的应用

传统的羊膜腔穿刺和绒毛吸取是目前许多医院较为常用的产前诊断技术，因其操作易导致流产、胎儿损伤或死亡、宫内感染、羊膜破裂等，使其在临床上的推广和应用受到了限制。利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行遗传学诊断一直是无创性产前诊断的重要探索途径。但由于孕妇外周血中的胎儿细胞数量少，而且存在个体差异，目前很难从外周血中分离出完整的胎儿细胞，这无疑限制了这种方法在临床上的应用。1997年，有学者研究发现，孕妇血液循环中存在较丰富的游离胎儿DNA，这一发现为无创性产前诊断和筛查开辟了新领域。     

孕妇外周血富集分离胎儿细胞进行产前诊断

１９６９年,Ｗａｌｋｎｏｗｓｋａ首次报道在母血循环中可能存在胎儿细胞,随后一些学者相继证实了这一发现,但由于其含量极其稀少故很难用于产前诊断。到了１９９０年,随着分子生物学和细胞生物学等技术的完善,使得从母血循环中检测、分离胎儿细胞并用于产前遗传学诊...     

孕妇外周血胎儿有核红细胞在产前诊断中的作用

目前对遗传性疾病的产前诊断有数种方法。根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为侵入性产前诊断和非侵入性产前诊断。前者包括羊膜腔穿刺术、绒毛细胞吸取术及胎儿脐血穿刺等，虽然诊断精确度较高，但可导致流产等并发症，只能在高危孕妇中实施；后者的优点是既能行产前诊断又无危险性，适用于低风险的孕妇大群体筛选，尽早发现和杜绝异常胎儿，达到优生目的。许多学者致力于利用胎儿细胞进行产前诊断。利用孕妇外周血的胎儿细胞进行产前基因诊断三个关键性技术为：(1)证实母血中存在胎儿细胞和DNA。(2)建立可靠稳定的方法分离胎儿细胞和DNA。(3)应用灵敏性、特异性强的技术以微量胎儿细胞和DNA为模板诊断遗传性疾病。这是最具潜力的非侵入性产前诊断方法之一。     

从孕妇外周血中分离胎儿细胞进行产前诊断的研究进展

孕妇外周血中存在的微量的胎儿细胞是进行非创伤性产前诊断最理想的样本来源之一。目前常用的分选胎儿细胞方法有流式细胞术、磁激活细胞分离法等 ,其中单细胞分离法的建立是一个新的途径。利用分析胎儿细胞的遗传信息 ,可以进行遗传病的产前诊断 ,如诊断多种染色体病和基因病等     

孕妇外周血中胎儿细胞分选法在产前诊断中应用的研究进展

在母体外周血循环中，胎儿有核红细胞是最理想的研究指标，其相应的单克隆抗体中，以血型糖蛋白Ａ（ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎＡ，ＧＰＡ）特异性最强。目前常用的分选胎儿细胞方法有流式细胞技术、磁性分离法、抗体结合柱法、显微操作分离法、细胞培养等，前两者已广泛使用。通过多聚酶链反应，荧光原位杂交技术可将所得胎儿细胞进行性别预测及染色体异常的产前诊断     

用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断研究进展

目前对遗传性疾病的产前诊断有数种方法。根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为侵入性产前诊断和非侵入性产前诊断。前者包括羊膜腔穿刺术、绒毛细胞吸取术及胎儿脐血穿刺等,虽然诊断精确度较高,但易导致流产等并发症,只能在高危孕妇中实施;后者的优点是既能行产前诊断又无危险性,适用于低风险的孕妇大群体筛选,尽早发现和杜绝异常胎儿,达到优生目的。利用孕妇外周血的胎儿细胞进行产前基因诊断即是最具潜力的非侵入性产前诊断方法之一,近年来研究十分活跃,临床医师应注意这一领域的进展。一、孕妇外周血胎儿细胞的类…     

孕妇外周血中胎儿细胞的分选富集及其在无创伤性产前诊断中的应用

20世纪90年代以来，随着单克隆抗体技术、流式细胞计数技术以及聚合酶链反应(polymerase chain reaction，WR)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术的发展，已使从孕妇外周血中分离、纯化胎儿细胞，并进行无创伤性产前诊断成为可能，但目前对这一问题还存在不少争论。我们复习了国内外有关文献，对这方面的进展综述如下。     

孕妇外周血中胎儿细胞及胎儿DNA的检测

目的　建立从孕妇外周血中分离有核红细胞 (NRBC)及DNA的可靠方法 ,并鉴定其来源。方法　对88例孕妇外周血分别通过密度梯度离心法 ,流式细胞术 (FCM )和荧光激活细胞分离技术 (FACS)分离NRBCs。应用套式PCR技术对 6 5例孕妇血浆DNA进行正常男性SRY基因检测。结果　①NRBCs:2 7例样品经密度梯度离心 ,其中 14例分选到 1～ 10个NRBCs。FACS技术对 6 1例样品进行转铁蛋白受体阳性细胞 (CD71+ )分选 ,所有样品均有CD71+ 细胞 ,其浓度为 (0 35± 0 2 5 )× 10 -2 。②胎儿DNA :4 6例怀男胎孕妇血浆DNA中SRY基因检测出率为 6 5 2 2 % (30 / 4 6 ) ,怀女胎的 19例样品SRY基因未检出率为 94 74 % (18/ 19)。结论　从孕妇外周血中分选胎儿NRBCs和血浆中胎儿DNA的方法已取得较大进展。利用母血中胎儿细胞及DNA诊断遗传性疾病可望成为最佳非创伤性产前诊断技术     

荧光定量PCR检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

目的探讨荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR）方法检测孕妇血浆中胎儿DNA的可行性，探讨胎儿DNA在孕妇血浆中的含量及其在孕期的变化规律。方法以胎儿SRY基因序列作为胎儿DNA在孕妇血浆中的标志，应用荧光MGB（Minor Groove Binder）探针实时定量PCR方法连续测定30例孕妇在不同孕期和产后共237份血浆标本中胎儿DNA的含量。结果使用该方法最低可检测到20000个女性DNA中的一个男性DNA。孕妇血浆中最早检出SRY序列的时间为孕6^＋6周。孕8周起，所有怀男胎孕妇的标本中均可检出SRY序列，其含量随着妊娠的进展而增高，在晚期妊娠达高峰，产后24～48h血浆中SRY序列检测均为阴性。胎儿DNA在孕妇血浆总DNA含量中的相对浓度分别为孕早期4．88％、孕中期6．10％、孕晚期4．77％。全部实验无假阳性和假阴性出现。结论FQ-PCR方法是一种灵敏度和准确性高，特异性强的定量检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的方法，孕妇血浆中存在高浓度的胎儿DNA，可用于无创伤性产前基因诊断。     

孕妇外周血中胎儿DNA在唐氏综合征产前诊断的应用前景

产前诊断（prenatal diagnosis）是指在胎儿出生前诊断胎儿是否患有某种遗传性或先天性疾病的一种手段,对于预防和控制新生儿发病率具有重要的临床意义。目前,产前诊断主要以创伤性诊断方法为主,包括孕早期的绒毛穿刺、孕中期的羊水穿刺和孕晚期的脐带穿刺等。技术成熟,     

应用流式细胞技术富集孕妇外周血中胎儿有核红细胞

从孕妇外周血中分离胎儿细胞并进行遗传性疾病的检测 ,具有十分重要的临床价值。为了避免大量的母血细胞对胎儿细胞检测的干扰 ,必须对母血中的胎儿细胞进行分离富集。本研究采用流式细胞技术对 36例孕妇外周血中的有核红细胞 (ＮＲＢＣｓ)进行分离纯化 ,初步探讨ＮＲＢＣｓ在母血中的含量及与孕周的关系。一、资料与方法1.标本来源 :选择 1997年 10月至 1998年 6月在我院行产前检查的健康妊娠妇女 36例 (妊娠组 ) ,年龄 2 1～ 2 8岁 ,孕周 12～ 2 7周 ,均为第 1次妊娠 ,无严重贫血 (血红蛋白>90ｇ/Ｌ)等妊娠合并症或并发症。对照组分别选择…     

C21orf25片段在母胎间的甲基化差异及其临床价值

目的:阐明C21orf25片段在母胎间甲基化状态的差异,探讨其用于无创性产前诊断的价值。方法:收集388例孕妇血浆,其中126例同时提取外周血细胞及胎盘(或绒毛)组织DNA,采用甲基化敏感性限制性酶切联合荧光定量PCR(MSRE+PCR)技术,检测母胎间C21orf25基因、RASSF1A基因甲基化状态的差异,分析其影响因素,并分别以胎源性RASSF1A或SRY基因为参照位点,计算孕妇血浆中胎源性C21orf25与参照位点的浓度比,判断胎儿21号染色体数量。结果:C21orf25及RASSF1A在胎盘或绒毛组织中均呈高甲基化状态,而在母体外周血细胞呈现低甲基化状态。C21orf25在母胎间的甲基化差异程度受孕周的影响,早孕期小于中、晚孕期(P=0.002,P<0.01)。采用MSRE+PCR技术对孕妇血浆中C21orf25、RASSF1A片段的检出率分别为100%和96.9%。计算184例正常妊娠孕妇血浆中胎源性C21orf25/RASSF1A比值,确定其95%的参考值范围为0.20～3.46,以此为标准判断71例胎儿21号染色体数量,其中67例二倍体妊娠的准确率为94.0%(63/67),4例21三体综合征妊娠,2例C21orf25/RASSF1A比值高于参考区间上限而获得诊断。以SRY为参照位点,94例正常二倍体男胎妊娠中甲基化C21orf25/SRY比值为3.16±1.20,95%参考值范围为0.81～5.51,以此为标准判断35例男胎21号染色体数量,准确率为97.1%(34/35),2例21三体妊娠均获准确诊断。结论:高甲基化C21orf25基因可作为孕妇血浆中胎儿DNA的标志物,通过计算该位点与参照基因的浓度比值,有望进行唐氏综合征的无创性产前诊断。     

应用转铁蛋白受体和胎儿血红蛋白标记染色方法分选孕妇外周血中胎儿有核红细胞的研究

由于孕妇外周血中胎儿细胞的含量极少，Hahn，Holzgreve和Bianchi等报道，孕妇每毫升外周血中仅有1～2个完整胎儿细胞。所以采用特异性单克隆抗体对胎儿细胞进行标记，并结合流式细胞仪进行高效富集分选的技术，是分离、纯化孕妇外周血中胎儿细胞的最佳手段。但因目前尚未发现识别胎儿细胞的特异性抗体，故不同学者选用的标记性抗体也有所不同。本研究采用荧光激活细胞分离技术（fluorescence-activated cell sorting，FACS），通过对孕妇外周血及未孕妇女外周血中转铁蛋白受体（transferrin receptor，CD71）单标记染色和胎儿血红蛋白（fetal haemoglobin，HbF）单标记染色与双标记染色情况的比较，探讨CD71与HbF染色法分选胎儿有核红细胞的价值。