超声微泡促进TDL复合物介导基因转染的体外实验

目的 研究超声微泡促进TDL复合物介导的肝细胞生长因子(HGF)基因在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的转染效果.方法 将HUVEC接种在24孔板中,随机分为以下5组:(1) 空白对照组;(2) TDL复合物组;(3) TDL复合物 微泡组;(4) TDL复合物 超声组;(5) TDL复合物 微泡 超声组.荧光显微镜及流式细胞仪检测pIRES2-EGFP/HGF在细胞内的表达及转染效率.MTT法检测该方法对HUVEC生长活性的影响.RT-PCR及Western Blot检测HGF的mRNA及蛋白的表达.结果 TDL复合物 超声 微泡组的绿色荧光强度及转染率均高于其它各组,并对细胞活性无明显影响.TDL复合物 超声 微泡组的HGF mRNA及HGF蛋白的表达也均高于各组.结论 超声微泡可提高TDL复合物介导的基因在体外培养HUVEC的转染效率,并对细胞活性无明显影响,该方法为提高非病毒载体的转染效率提供一个新策略,可能成为缺血性心脏病基因治疗的有效手段之一.     

超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。     

超声破坏SonoVue微泡介导Ang-1基因的体外体内转染

目的 探讨超声破坏微泡造影剂在体外及体内介导Ang-1基因转染的效率及其促血管新生的作用.方法 293T细胞悬液分为3组:A组(微泡+超声+质粒组),B组(单纯超声照射+质粒组)及C组(对照组,每孔仅加入目的基因质粒);转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量检测基因的转染效率,PCR及Western-blot分别检测细胞转染后的目的基因表达与蛋白翻译.27只健康成年中国家兔行急性前壁心肌梗死造模后随机分为3组:组Ⅰ(超声辐照+微泡+质粒组)、组Ⅱ(超声辐照+质粒组)、组Ⅲ(对照组,心肌梗死后不做任何处理);于基因转染前后分别行心肌超声造影(MCE)检查,并于2周后处死取心肌组织行PCR及Western blot检测Ang-1 mRNA及其蛋白的表达,心肌组织Ⅷ因子染色检测其新生毛细血管密度.结果 48 h后可在荧光显微镜下观察到A组及B组转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,其中C组未见明显绿色荧光表达,A组的绿色荧光表达量明显高于B组;流式细胞仪检测A组转染效率较B组显著提高(P＜0.01).体内转染中,心肌超声造影可见组Ⅰ转染前充盈缺损处出现片状造影剂回声,PCR可检测出Ang-1 mRNA表达,Western blot可检测出目的基因的蛋白产物,余各组则无明显造影剂充填,PCR、Western blot均无法检测出Ang-1基因及其蛋白的表达;心肌毛细血管计数显示组Ⅰ新生毛细血管数量显著提高,余各组仅见少量新生毛细血管.结论 超声破坏微泡造影剂可明显提高Ang-1基因的体外及体内转染效率,具有良好的促血管新生作用.     

超声介导微泡破裂增强体外基因转染的方法学研究

目的 对超声促进基因转染的方法进行系统的优化研究,初步确定超声介导微泡破裂(UMMD)增强体外基因转染的最优参数.方法 选用 Ishikawa、Hela 和 MCF-7 3种细胞系为研究对象,用1 MHz超声仪.超声强度为1.0W/cm2,系统研究不同参数下的细胞活力及两种DNA质粒[红色荧光蛋白质粒(DsRed)和荧光索酶质粒(pCMV-LUC)的基因转染情况,优化UMMD的转染条件(质粒浓度、占空比及辐照时间),分析SonoVue微泡对基因转染的增强作用.结果 基因转染率随着质粒浓度的增加而增高,当质粒浓度达到30 μg/孔时转染率最高,两种DNA质粒的最佳转染浓度相同.与10%占空比的超声辐照相比,20%占空比的转染率显著提高(P＜0.01).辐照3 min时基因表达率最高,但存活率无明显下降(89.03±2.01)%,为最佳辐照时间.无超声辐照时,单独应用质粒或微泡十质粒的样本几乎不表达红色荧光蛋白.与单纯超声辐照相比,超声辐照联合SonoVue微泡可显著提高基因转染效率(P＜0.01).结论 UMMD的转染参数影响转染效率和细胞活力,优化的参数有利于促进基因转染.     

超声辐照SonoVue增强脂质体介导pEGFP-N1转染乳腺癌细胞

目的 探讨超声辐照SonoVue介导增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)转染乳腺癌MCF-7细胞的最优条件以及超声联合微泡造影剂增强脂质体转染的效果.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,按照不同的辐照条件分组:不处理组,超声辐照十质粒组,微泡浓效组,超声声张组,辐照时间组及工作周期组.分别进行超声辐照,辐照后以MTT法测细胞存活度,流式细胞仪测pEGFP-N1瞬时转染率,取得最佳的辐照条件.重新准备细胞后先以脂质体转染细胞,2 h后加入超声微泡并以最佳条件辐照,用同样的方法测细胞存活率及转染率.结果 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期(占空比)为超声辐照SonoVue介导pEGFP-N1转染MCF-7细胞的最优条件,转染率为(14.21±2.55)%,细胞存活率为(84.60±2.85)%.在增强脂质体转染的实验中,超声微泡脂质体组的转染率最高(22.15±2.69)%,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05),此时细胞存活率为(80.13±3.61)%.结论 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期是MCF-7细胞的最佳转染条件,超声联合微泡能够增强脂质体转染的效果.     

超声靶向微泡破坏技术介导基因转染的研究进展

基因转染技术的高速发展不仅革新了生物学和医学许多基本问题的研究,也推动了诊断和治疗的进步。基因作为核酸类生物活性大分子,极易在体内降解,因此传递基因的载体尤为重要。超声靶向微泡破坏(UTMD)技术利用超声波和微泡之间的相互作用,以及其产生的生物学效应,使微泡携基因进行转染,并与多种载体联合应用,为疾病的治疗提供了有效手段。本文就UTMD技术介导基因转染的研究进展进行综述。     

超声介导SonoVue微泡破裂对hAng-1基因完整性和表达效率的影响

目的 探讨超声联合SonoVue微泡介导hAng-1基因转染293T细胞的转染效率及基因完整性和表达状况.方法 构建eGFP-C3-hAn-1质粒,根据不同实验组的设计,应用相应的微泡联合超声辐照条件进行293T细胞的eGFP-C3-hAng-1基因转染,转染后48 h,以荧光显微镜观察到绿色荧光为转染成功标志;流式细胞术检测基因转染阳性细胞率,台盼蓝染色检测细胞生存率;RT-PCR和Western blot技术检测hAng-1基因的mRNA和蛋白表达;琼脂糖凝胶电泳检测经超声辐射后质粒的完整性.结果 ①微泡浓度为20%,DNA浓度为15 mg/L时进行基因转染可获较好转染效率和细胞生存率;②转染体系中血清的存在并不影响转染效率和细胞生存率;③最适转染条件下的超声辐照剂量不会影响DNA的完整性,且转染后的基因可正常表达mRNA并翻译目的蛋白.结论 微泡联合超声辐照能够介导体外细胞治疗性基因的转染,血清的存在并不影响基因的转染,转染后的基因能顺利地表达并具有正常功能.     

自制脂质微泡联合超声辐照介导pGL3-Promoter-EGFP质粒转染卵巢癌细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡介导基因转染卵巢癌细胞的可行性及转染效率.方法 (1)以不同声强作用SKOV3细胞60 s,筛选出对细胞活性无明显抑制的声强;(2)将筛选出的声强分别与不同浓度的微泡联合作用于SKOV3细胞,筛选出对细胞无明显抑制的最适声强和微泡浓度的组合;(3)将SKOV3细胞分成5组,不同方式转染pGL3-Promoter-EGFP质粒:(1)裸质粒组;(2)质粒 微泡组;(3)质粒 超声组;(4)质粒 超声 微泡组;(5)质粒 脂质体组,比较各组转染效率.结果 (1)声强0.5、0.75 W/cm2的超声辐照,细胞死亡率＜10%;(2)0.24×108/ml或0.12×108/ml浓度的微泡联合0.5W/cm2超声辐照,细胞死亡率＜10%;(3)第4组与第5组转染效率无区别(P=0.133),但高于第1、2、3组(P＜0.001).结论 适当浓度微泡联合超声辐照能将外源基因在卵巢癌细胞中高效转移.     

超声辐照联合微泡造影剂介导人血管生成素-1基因体外转染293T细胞的研究

目的 探讨超声辐照联合微泡造影剂的基因转染系统介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的转染效率.方法 将六孔板中的293T细胞悬液分为4组:A组,超声+质粒组,每孔加入10 μg目的 基因质粒;B组,超声+微泡+质粒组,每孔加入微泡和质粒混合液,终浓度分别为质粒10 μg/孔,微泡200 μl/孔;C组,脂质体+质粒组,每孔加入4 μl脂质体和5 μg质粒;D组,对照组,每孔仅加入10 μg目的 基因质粒.A组和B组均接受超声辐照,照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,作用时间为30 s.转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量观察基因的转染效率.结果 48 h后,荧光显微镜下观察到转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组、D组的基因转染效率分别为(3.5±0.4)%、(20.8±1.2)%、(18.0±0.9)%和(0.2±0.1)%.结论 超声本身即有促进基因转染的作用,超声辐照联合微泡造影剂后则增强了这种作用,明显增加了基因的转染效率.     

微泡造影剂联合超声辐照介导的绿色荧光蛋白质粒转染小鼠肝癌的实验研究

目的探讨微泡造影剂SonoVue联合超声辐照在介导体内基因转染中的作用。方法建立小鼠肝癌皮下移植瘤模型，尾静脉注入绿色荧光蛋白质粒（pEGFP），添加或不添加SonoVue，脉冲多普勒超声辐照（1MHz，2W／cm^2）瘤组织。持续时间1、5、10min，7d后流式细胞仪、荧光显微镜评价pEGFP转染率。HE染色行肿瘤病理学检查。结果SonoVue联合超声辐照组pEGFP的转染率显著高于单纯超声辐照组（P〈0．01）；仅SonoVue与单纯pEGFP2组间转染率无显著差异（P〉0．05）；辐照时间5、10min时pEGFP表达明显高于1min（P〈0．05）。5与10min组间pEGFP表达无显著差异（P〉0．05）。HE染色肿瘤组织无坏死灶出现。结论微泡造影剂联合超声辐照可明显提高基因转染率，且对组织无损害。     

声诺维增强超声辐照介导pEGFP-N1转染RPE细胞的实验研究

目的探讨超声与微泡造影剂声诺维（SonoVue）介导基因转染体外培养RPE细胞的作用。 方法在24孔板中,用1MHz,2W/cm2,50Hz的脉冲波辐照RPE细胞2min,质粒用量6μg/孔,加或不加20%浓度的SonoVue,72h后流式细胞仪测瞬时转染率,台盼蓝染色检测细胞活性。 结果单纯超声辐照组转染率为（1.07±0.22）%,加SonoVue组为（12.58±1.75）%（P〈0.05）,各组细胞生存率在95%以上。 结论SonoVue能促进超声辐照基因转染RPE细胞,且对细胞基本无损伤。     

超声和共聚物P85介导HepG2细胞基因转染的实验研究

目的 探讨超声和共聚物Pluronic P85能否介导HepG2细胞基因转染,并摸索超声辐照条件.方法 质粒DNA用EGFP,超声辐照加或未加P85的HepG2细胞,48 h后荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪定量分析转染率,锥虫蓝染色评价细胞活性.结果 0.8 W/cm2、30 s时达到较理想的转染效率.超声 P85组转染率为单独超声组的3倍左右,超声 P85组细胞成活率80%左右,单独超声组细胞成活率60%左右.结论 超声和共聚物能介导HepG2细胞基因转染,在0.8 W/cm2、30 s时达较理想的转染效率,P85使超声介导的细胞损伤有一定程度的增加.     

声诺维联合超声辐照增强绿色荧光蛋白质粒转染血管内皮细胞的实验研究

目的探讨造影剂声诺维(SonoVue)联合超声辐照人脐血管内皮细胞(HUVEC)时增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP)的瞬时转染效率。方法使用连续多普勒超声辐照方式介导pEGFP转染HUVEC,照射条件为频率1.9MHz,TIS0.8,SATA为80.0mW/cm2,时间持续5min,添加或不添加2%SonoVue,pEGFP浓度为50μg/ml。48h后用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)瞬时转染表达率,并用台盼蓝染色检测细胞活性(生存率)。结果单纯超声辐照组GFP转染率仅为1.5%±0.2%,SonoVue联合超声辐照组为16.1%±1.9%(P<0.001);两组细胞生存率分别为94.1%±2.3%和91.1%±4.1%(P>0.05)。结论SonoVue联合超声辐照条件可增强pEGFP转染HUVEC的效率,而对细胞活性无明显影响,此方法可用于目的基因转染。     

Bioeffects of Ultrasound-Stimulated Microbubbles on Endothelial Cells: Gene Expression Changes Associated with Radiation Enhancement In Vitro

Ultrasound can be used to target endothelial cells in cancer therapy where the destruction of vasculature leads to tumor cell death. Here, we demonstrate ultrasound bioeffects in which the levels of genes in endothelial cells can be significantly altered by ultrasound-stimulated microbubble exposure. These were compared with established effects of radiation on endothelial cells at a gene level. Human-endothelial cells were exposed to ultrasound and microbubbles, radiation or combinations of ultrasound, microbubbles and radiation. Gene expression analyses revealed an up-regulation of genes known to be involved in apoptosis and ceramide-induced apoptotic pathways, including SMPD2, UGT8, COX6B1, Caspase 9 and MAP2K1 with ultrasound-stimulated microbubble exposure but not SMPD1. This was supported by immunohistochemistry and morphologic changes examined with cell microscopy, which showed changes in SMPD1 gene product in cells with microbubble exposure. This supports the hypothesis that ultrasound-stimulated microbubbles can induce significant bioeffect-related changes in gene expression and can affect ceramide signaling pathways in endothelial cells, leading to apoptosis.     

靶向超声造影剂促进反义基因转染的体外研究

目的 探讨超声破坏造影剂微泡联合半乳糖化多聚赖氨酸(G-PLL)对基因治疗肝癌的靶向促进作用.方法 将合成的超声造影剂微泡、G-PLL及c-myc反义寡核苷酸(ASODN)耦联物,结合超声辐照作用于表达c-myc基因的人肝癌及人肺癌细胞株进行体外效应研究.观察细胞形态学改变及耦合物与细胞结合情况并检测c-myc基因的表达情况.结果 镜下显示肝癌细胞较肺癌细胞更易于与耦联物结合,多数细胞呈凋亡改变.经超声辐照,耦联物作用后的人肝癌及肺癌细胞c-myc基因表达量均有降低,而G-PLL对肝癌细胞c-myc基因表达有明显抑制作用.结论 超声辐照下,造影剂结合G-PLL及反义基因耦联物可靶向性促进反义基因转染肝癌细胞.     

载组织型纤溶酶原激活物及精-甘-天-丝氨酸四肽超声微泡造影剂的实验研究

目的 制备一种同时携带组织型纤溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator,tPA)与精-甘-天-丝氨酸四肽(RGDS)靶向配体的新型脂质超声微泡造影剂.方法 以冷冻干燥法制备包载tPA的脂质超声微泡造影剂并应用共价键桥连剂法结合RGDS配体.光镜及荧光显微镜观察其形态;测量其粒径、表面电位、pH值;以ELISA法测定tPA包封率;流式细胞仪检测RGDS携带率;琼脂糖纤维蛋白平板法检测其纤溶活性;以该造影剂对正常家兔肝脏进行静脉声学造影,绘制时间-强度曲线,检测其成像功能.结果 微泡膜上同时携带tPA和RGDS,浓度(7～9)×109/ml,粒径(2.08±0.93) μm,表面电位-51.3,pH值5.58,tPA包封率(81.12±2.44)%,RGDS携带率(94.49±6.19)%.微泡在超声辐照条件下显示溶栓活性.声学造影后,该造影剂能明显增强实验兔肝实质回声.结论 以冷冻干燥法和共价键桥连剂结合法能成功制备同时包载tPA并携带RGDS的脂质超声微泡造影剂,将为血栓的靶向释药促溶治疗提供一条新的可行之路.     

超声微泡造影剂声诺维与基因转染的研究

超声微泡是一种新型基因转染的载体,超声辐照微泡（SonoVue）可增加基因在体内及体外的转染效率。若在不损伤基因和组织的前提下促进基因的转染,合适的辐照条件是非常重要的。