新的珠蛋白基因突变引起少见地中海贫血四例报告及文献复习

目的分析4例少见地中海贫血（地贫）患者的DNA序列、临床表型，提高对地贫的认识。方法对2014年5月至2019年12月4例少见地贫患者的临床及DNA序列特征进行回顾性分析并复习相关文献。结果地贫基因常规检测显示，例1～3均未检测到常见的3种α株蛋白1/2（HBA1/A2）基因缺失及其3种点突变和16种β株蛋白（HBB）基因点突变，例4检测到αα^--SEA缺失。HBA1/A2和HBB基因全序列Sanger测序示：例1～4分别存在HBB:c.347C>A、HBB:c.1A>G、HBB:c.393T>G及HBA2:c.301-1G>A（IVS-II-142 G>A）突变。同时，例2的祖父、父亲和姑姑均为HBB:c.1A>G杂合突变。结论本研究发现了新的珠蛋白基因突变，HBB:c.347C>A、HBB:c.1A>G和HBB:c.393T>G以及HBA2:c.301-1 G>A（IVS-II-142 G>A）突变在中国地贫患者中为首次报道，HBB:c.393T>G突变为全球首次报道，丰富了地贫基因突变数据库。     

siRNA对血红蛋白H病红系细胞β珠蛋白的调控作用

目的研究靶向siRNA对体外定向分化培养的红系细胞β-珠蛋白的调控作用，为血红蛋白H（Hemoglobin H, HbH）病的基因治疗提供新的理论支持。方法①根据β-珠蛋白基因表达结果，在红系细胞中筛选出最佳siRNA序列及其有效作用剂量，检测有效剂量的最佳siRNA对红系细胞β-珠蛋白表达的调控和细胞凋亡的影响。②将有效剂量的最佳siRNA作用于HbH病红系细胞，检测转染后细胞β-珠蛋白表达、活性氧（ROS）和细胞凋亡率，综合评估转染siRNA对HbH病红系细胞的影响。结果①siRNA₂可在转染后96 h内显著下调体外培养的红系细胞β-珠蛋白的表达，但对α-珠蛋白无明显调控作用。siRNA₂的沉默效应和效应持续时间均与作用剂量有关。②siRNA₂可下调HbH病红系细胞β-珠蛋白表达，减少细胞内ROS生成，并减少细胞凋亡率。结论靶向性siRNA可下调HbH病红系细胞β-珠蛋白表达，减少细胞内ROS产生，下调细胞凋亡率。     

遗传性蛋白S缺乏症18例临床表现与基因分析

目的分析18例遗传性蛋白S（PS）缺乏症患者的临床表现及分子致病机制。方法对2016年7月至2019年2月就诊于中国医学科学院血液病医院的18例PS缺乏症患者进行回顾性分析，应用凝固法测定PS活性、应用发色底物法测定蛋白C（PC）和抗凝血酶（AT）活性并进行初步诊断，使用高通量测序（HTS）筛查凝血疾病相关基因变异并进行Sanger测序验证；使用Swiss-model软件进行三维结构分析。结果18例患者中男15例，女3例，中位年龄37（14～62）岁。均有深静脉血栓栓塞病史，PS活性为12.5～48.2 U/dl。所有患者均检出PROS1基因变异，其中5个无义突变（c.134_162del/p.Leu45*、c.847G>T/p.Glu283*、c.995_996delAT/p.Tyr332*、c.1359G>A/p.Trp453*、c.1474C>T/p.Gln492*）、2个移码突变（c.1460delG/p.Gla487Valfs*9、c.1747_1750delAATC/p.Asn583Wfs*9）和1个大片段缺失（外显子9 缺失）为首次报道。此外，1例妊娠期深静脉血栓形成女性患者的PS活性为55.2 U/dl，并且检出PROC基因c.565C>T/p.Arg189Trp突变。结论该研究新发现的基因突变丰富了与遗传性PS缺乏症相关的PROS1基因突变谱。     

不同家系遗传性蛋白C缺陷症12例临床表型和基因突变分析

目的探讨来自不同家系12例遗传性蛋白C（PC）缺陷症先证者的基因突变类型与临床特征。方法采用发色底物法检测血浆PC活性，酶联免疫吸附法检测PC抗原含量。采用PCR直接测序法分析先证者PROC基因9个外显子及其侧翼序列，对发现的疑似突变用反向（缺失突变用克隆）测序予以验证。结果12例先证者的PC活性均明显下降（18％～55％），其中10例先证者的PC抗原水平显著降低（13％～58％）。共发现11种PROC基因突变，其中c.383G>A（p.Gly128Asp）、c.997G>A（p.Ala291Thr）、c.1318C>T（p.Arg398Cys）和c.532G>C（p.Leu278Pro）4种杂合突变为首次发现；6种突变发生在丝氨酸蛋白酶结构域、4种发生在表皮生长因子同源区域（EGF）、1种突变在EGF和丝氨酸蛋白酶结构域之间的激活肽区域；缺失突变（p.Met364Trp fsX15和p.Lys192del）2种，其余为错义突变。有3例无亲缘关系的先证者检出p.Phe181Val和p.Arg189Trp纯合或杂合突变。所有基因突变可能来自先证者的父亲和（或）母亲，其中2个家系存在近亲婚配。先证者有9例出现静脉血栓形成、2例有不良妊娠表现、1例出现紫癜。结论PROC基因缺陷导致的PC缺陷症患者易发生静脉血栓形成，尤其当同时存在其他易栓因素时。     

11C-PiB PET/MRI在原发性系统性轻链型淀粉样变器官受累评估中的价值

目的分析¹¹C标记的匹兹堡化合物B（¹¹C-PiB）PET/MRI在原发性系统性轻链型淀粉样变（pAL）中评估器官受累的价值。方法回顾性分析2019年1月至2021年10月在华中科技大学同济医学院附属协和医院就诊的20例pAL患者及3名健康志愿者的临床资料，比较临床标准评估器官受累和PET/MRI评估的相关性，分析心脏相关生物学指标、疾病分期与心脏最大标准摄取值（SUVmax）之间的关系及24 h尿蛋白定量与肾脏SUVmax之间的关系。结果①纳入20例患者，初诊患者18例，非初诊患者2例。观察到¹¹C-PiB摄取阳性的脏器分别为：心脏15例（75％），肺部8例（40％），骨髓10例（50％），肌肉10例（50％），舌肌7例（35％），甲状腺6例（30％），唾液腺4例（20％），脾脏2例（10％），胃壁1例（5％）。②¹¹C-PiB在心脏及骨髓摄取的阳性率与临床评估标准具有很好的相关性。在肺组织、脾脏、腺体、肌肉和舌肌中，¹¹C-PiB PET/MRI评估的阳性率明显高于临床标准。但对于神经系统受累和脂肪组织的评估¹¹C-PiB PET/MRI具有局限性。③分析18例初诊患者心脏相关生物学指标与心脏SUVmax之间的关系。左心室射血分数（LVEF）<50％且室间隔厚度（ISV）≥1.2 cm的患者相较LVEF≥50％且ISV<1.2 cm的患者其心脏SUVmax更高（P<0.05）。心脏SUVmax值在Mayo2004分期、Mayo2012分期各期之间差异有统计学意义，分期越晚，SUVmax值越高（P<0.05）。心脏SUVmax与心肌肌钙蛋白酶Ⅰ、N 末端前体脑钠肽水平呈明显正相关（P<0.01），肾脏SUVmax与24 h尿蛋白定量无明显相关性（P>0.05）。结论全身¹¹C-PiB PET/MRI作为一种淀粉样蛋白的可视化系统，若用于器官水平的定性评估，具有提高早期无创性诊断pAL水平的潜力；用于器官水平（尤其是心脏）的定量评估，有望更精准评估器官功能和预测疾病预后。     

基于二代测序技术分析骨髓纤维化患者基因突变对芦可替尼疗效的影响

目的评估基因突变对芦可替尼治疗骨髓纤维化（MF）疗效的影响。方法回顾性分析2017年7月至2020年12月服用芦可替尼治疗并应用二代测序技术检测127个血液肿瘤相关基因突变的56例MF患者的临床资料，分析突变基因与芦可替尼疗效的关系。结果①56例患者中，原发性骨髓纤维化（PMF）36例、真性红细胞增多症（PV）后骨髓纤维化（PPV-MF）9例，原发性血小板增多症（ET）后骨髓纤维化（PET-MF）11例。②50例（89.29％）携带驱动基因突变，22例（39.29％）携带基因突变≥3个，29例（51.79％）检出高危基因突变（HMR）。③对于基因突变≥3个的MF患者，芦可替尼仍有较好的改善体质性症状及缩小脾脏的效果（P＝0.001，P<0.001）。与基因突变<3个组比较，基因突变≥3个组停药前持续用药时间（TTF）及无进展生存期（PFS）明显缩短［356（55～1061）d对471.5（50～1270）d，z＝−2.701，P＝0.007；444（91～4109）d对1248.5（91～7061）d，z＝−2.030，P＝0.042］。④与未检出HMR的患者比较，≥2个HMR患者的芦可替尼缩脾效果较差（t＝10.471，P＝0.034），TTF及PFS明显缩短（P<0.001，P＝0.001）。⑤在携带ASXL1、EZH2、SRSF2等附加基因突变患者中，芦可替尼缩脾、症状改善及稳定骨髓纤维化作用较差，携带ASXL1、EZH2突变患者TTF［ASXL1：360（55～1270）d对440（55～1268）d，z＝−3.115，P＝0.002；EZH2：327（55～975）d对404（50～1270）d，z＝−3.219，P＝0.001］及PFS较未携带者明显缩短（ASXL1：457（50～1331）d对574（55～1437）d，z＝−3.219，P＝0.001；EZH2：428（55～1331）d对505（55～1437）d，z＝−2.576，P＝0.008］。结论MF患者携带的基因突变类型、数量以及HMR对芦可替尼疗效有一定影响。     

遗传性凝血因子Ⅴ缺乏症九例基因分析

目的分析9例遗传性凝血因子Ⅴ（FⅤ）缺乏症患者的临床表现及分子致病机制。方法对1999年4月至2019年9月就诊于中国医学科学院血液病医院的9例遗传性FⅤ缺乏症患者进行回顾性分析：应用活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）及FⅤ促凝活性（FⅤ∶C）测定进行表型诊断；使用高通量靶向测序筛查F5基因变异，Sanger测序验证并分析双亲携带情况；Swiss-model进行三维结构分析，ClustalX-2.1软件进行同源保守性分析。结果9例患者的FⅤ∶C为0.1～10.6 U/dl，其中8例患者有出血病史，以皮肤/黏膜出血最为多见（3例），其余1例未发生出血事件。所有患者中纯合子5例，复合杂合子4例，共检测到12个致病或疑似致病F5基因突变，其中c.6100C>A/p.Pro2034Thr、c.6575T>C/p.Phe2192Ser、c.1600_1601delinsTG/p.Gln534*、c.4713C>A/p.Tyr1571*和c.952+5G>C为首次报道。结论该研究新发现的基因突变丰富了与遗传性FⅤ缺乏症相关F5基因突变谱，高通量测序方法可以有效检测F5基因突变。     

B7H3与纤维连接蛋白相互作用对人慢性髓性白血病细胞凋亡影响的初步探讨

目的探讨B7H3和纤维连接蛋白（FN）相互作用对人慢性髓性白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。方法采用流式细胞术检测K562细胞中B7H3分子的表达，构建B7H3过表达细胞。采用免疫共沉淀技术检测B7H3与FN的相互作用。添加外源FN后，通过细胞实验检测细胞黏附和细胞凋亡的变化。Western blot法检测凋亡相关蛋白及PI3K/AKT信号通路的变化。结果① K562细胞低表达B7H3分子，慢病毒转染后得到稳定表达B7H3的细胞系K562 OE-B7H3及其对照细胞系K562 NC-B7H3细胞。②B7H3与FN之间存在相互作用（P＝0.036）。③B7H3与FN的相互作用促进细胞黏附（P<0.05），抑制细胞凋亡（P<0.05）。④B7H3与FN相互作用激活PI3K/AKT信号通路（P<0.05）。结论B7H3与FN相互作用促进了细胞黏附，可能通过激活PI3K/AKT信号通路抑制K562细胞的凋亡。     

二代测序技术检测儿童急性淋巴细胞白血病的基因突变谱及其预后意义

目的分析儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的基因突变谱及其预后意义。方法回顾性分析2016年11月至2019年12月福建医科大学附属协和医院采用二代测序技术（NGS）行基因突变检测的141例初治ALL患儿的临床资料，分析基因突变谱及其对ALL患儿预后的影响。结果141例患儿中，83例（58.9％）检出体细胞突变，包括37个Ⅰ类及123个Ⅱ类突变位点。单核苷酸变异（SNV）为最常见的突变类型。KRAS（20/160，12.5％）为最常见的突变基因，其次为NOTCH1（11.9％）及NRAS（10.6％）。RAS通路（KRAS、FLT3、PTPN11）、PAX5及TP53突变仅在B-ALL患儿中检出，而FBXW7、PTEN突变仅在T-ALL患儿中检出；NRAS突变主要在B-ALL中检出，而NOTCH1突变主要在T-ALL中检出。每例T-ALL患儿检出的平均基因突变个数显著高于B-ALL患儿（4.16±1.33对2.04±0.92，P＝0.004）。按照有无遗传变异将患儿分为突变组和无突变组，两组的性别、年龄、初诊白细胞计数、微小残留病监测结果、预计3年无事件生存（EFS）率及总生存（OS）率差异均无统计学意义（P值均>0.05）；但突变组T-ALL以及融合基因阴性患儿的比例显著高于无突变组（P值分别为0.021和<0.001）。进一步亚组分析，在融合基因阴性的患儿中，有Ⅰ类突变的患儿预计3年EFS率显著低于无Ⅰ类突变的患儿（85.5％对100.0％，P＝0.039）；在B-ALL患儿中，伴TP53突变的患儿预计3年EFS率显著低于不伴有TP53突变的患儿（37.5％对91.2％，P<0.001）。结论体细胞突变在儿童ALL中较为常见，与临床表型及预后具有一定的相关性，NGS可作为传统MICM分型检查的重要补充。     

骨髓纤维化患者RAS基因突变特征及其预后意义

目的分析骨髓纤维化（MF）患者RAS基因突变的分子特征及其临床特点和预后意义。方法收集2011年12月至2019年12月在我中心有二代基因测序数据的226例MF患者临床资料，回顾性分析RAS基因突变特征、与临床和实验室参数之间的关系，及对总生存（OS）期的影响。结果226例原发性骨髓纤维化（PMF）及真性红细胞增多症（PV）或原发性血小板增多症（ET）后骨髓纤维化（post-PV/ET MF）患者中，共14例（6.2％）检出RAS基因突变：NRAS突变9例（4.0％），KRAS突变8例（3.5％），NRAS及KRAS突变并存3例（1.3％）。所有NRAS突变均发生在第12-13号密码子。RAS基因突变多为亚克隆突变，常与SETBP1、SRSF2、MPL共同发生。伴RAS基因异常患者平均突变基因个数（3.36个）与无RAS基因异常组（1.77个）相比，差异有统计学意义（P<0.001）。RAS基因突变患者与无突变患者相比，外周血单核细胞水平升高（P＝0.003），血小板水平减低（P＝0.026），骨髓原始细胞比例升高（P＝0.022），脾脏肋缘下≥10 cm患者比例更高（P＝0.005）。突变组患者非常高危（VHR）染色体核型比例（18.2％，2/11）显著高于无突变组患者（2.3％，3/133）（P＝0.031）。单因素分析中，NRAS基因突变的MF患者及PMF患者的OS时间较无突变患者显著缩短（P＝0.001，P＝0.008）。多因素分析显示，NRAS突变是影响OS的独立预后不良因素。结论RAS突变常与外周血单核细胞水平升高、血小板计数减低、骨髓原始细胞比例升高、VHR染色体核型等高危临床特征及实验室参数相关，多为发生在MF晚期的亚克隆突变。伴NRAS基因突变PMF及MF患者的OS时间显著缩短。     

Ⅱ型冷球蛋白血症的临床特征及预后

目的探讨Ⅱ型冷球蛋白血症患者的临床特征及预后。方法回顾性分析2015年5月至2020年1月北京协和医院确诊的61例Ⅱ型冷球蛋白血症患者的临床资料。结果61例患者中，男性26例（42.6％），中位诊断年龄为53（28～79）岁。继发病因包括丙型肝炎病毒（HCV）感染（21.3％）、乙型肝炎病毒（HBV）感染（21.3％）、自身免疫性疾病（14.8％）和血液系统肿瘤（11.5％）。31.1％患者为特发性。常见首诊症状包括皮肤紫癜、蛋白尿、血尿、肾功能不全、发热及关节痛。实验室检查显示，中位冷球蛋白水平为215.9（22.0～17 075.8）g/L，54例（88.5％）为IgM单克隆。类风湿因子（RF）升高患者占93.2％，C3下降患者占57.6％，C4下降患者占61.0％。共49例（80.3％）患者接受治疗，总体临床缓解率为75.5％，预计3年总生存率为89.3％。结论Ⅱ型冷球蛋白血症是一种多系统受累的全身性疾病，病因以肝炎病毒感染多见。早期诊断和干预对于改善预后有重要意义。     

抗人T细胞猪免疫球蛋白治疗重型再生障碍性贫血患者的药物代谢动力学研究

目的研究抗人T细胞猪免疫球蛋白（p-ATG）在重型再生障碍性贫血（SAA）患者的药物代谢特点。方法2017年2月至2017年12月纳入接受p-ATG联合环孢素A（CsA）免疫抑制治疗的SAA患者，p-ATG剂量为20 mg·kg⁻¹·d⁻¹，持续12 h静脉给药，连续5 d。应用三抗体夹心ELISA方法检测p-ATG血药浓度，药代动力学分析软件拟合，计算相关参数并绘制药物代谢曲线。随访记录不良事件并评估治疗后6个月血液学反应。结果入组16例接受p-ATG治疗的SAA患者，女8例，男8例，中位年龄22（12～49）岁，中位体重62.5（37.5～82.0）kg。其中14例可进行p-ATG药代动力学评价。p-ATG在体内分布为二室模型，平均药物浓度峰值时间（T_max）为（5.786±2.486）d，平均峰浓度（C_max）为（616±452）mg/L，平均半衰期（T_1/2）为（10.479±8.242）d。平均药物浓度时间曲线下面积［AUC_（0-t）］为（5.807±3.236）mg/L·d。14例患者治疗后6个月8例获得血液学反应，有效组与无效组患者AUC_（0-t）分别为（7.50±3.26）mg/L·d对（4.50±2.18）mg/L·d，C_max分别为（627±476）mg/L对（584±382）mg/L。结论连续5 d输注后p-ATG血药浓度达峰值，后缓慢下降，半衰期10.479 d，用药后60 d体内检测到残存药物浓度。尚不能得出药物代谢与疗效及不良反应的关系。     

基于CSF3R突变与治疗后微小残留病对CEBPA双突变急性髓系白血病预后再分层研究

目的研究CSF3R突变与治疗后微小残留病（MRD）在CEBPA双突变急性髓系白血病（AML）患者中的预后意义。方法回顾性分析2012年1月至2018年9月就诊于吉林大学第一医院血液科的66例具有完整二代基因测序结果且进行了系列MRD监测的AML患者，研究治疗前CSF3R突变和治疗后MRD水平与患者治疗疗效及长期预后的相关性。结果CSF3R突变患者的5年无复发生存（RFS）率和总生存（OS）率分别为15.2％和18.2％，明显低于无CSF3R突变患者的38.7％和60.6％（P值分别为0.006和0.038）。2个疗程化疗后MRD转阴患者的中位RFS与OS时间分别为64个月与未达到，明显长于MRD阳性患者的15个月和 48个月（P值分别为0.004和0.050）。Cox风险比例模型分析显示，CSF3R突变（HR＝0.317，95％CI 0.129～0.779，P＝0.012）、WT1突变（HR＝0.304，95％CI 0.115～0.804，P＝0.016）、NRAS突变（HR＝0.153，95％CI 0.061～0.385，P<0.001）为影响患者RFS的独立不良预后因素，CSF3R突变与MRD阳性趋向为OS的独立预后因素（P值分别为0.071与0.088）。基于CSF3R突变与治疗后MRD将患者分为野生型CSF3R且MRD转阴组、突变型CSF3R或MRD阳性组、突变型CSF3R且MRD阳性组，三组患者RFS（P<0.001）与OS（P＝0.006）差异均有统计学意义。结论CSF3R突变与2个疗程化疗后MRD状态均可预测CEBPA双突变AML患者的长期预后，据此可对患者进行预后再分层。     

外周血宏基因组二代测序技术在血液病合并发热患者中的临床应用价值

目的探讨外周血宏基因组二代测序技术（mNGS）在血液病合并发热患者中的临床应用价值。方法回顾性分析2020年3月至2021年6月在天津医科大学总医院血液科住院治疗的血液病合并发热并进行外周血mNGS检测的90例患者共98份标本的mNGS结果及临床资料，分析病原分布特征与血mNGS的检验效能。结果外周血mNGS阳性率为68.37％（67/98），明显高于传统检查（37.76％，P<0.001）与血培养（9.18％，P<0.001）。单纯检出病毒、细菌、真菌阳性样本分别占38.81％、14.93％、2.99％；混合感染占43.28％，其中以病毒和细菌混合型最为多见（25.37％）；病毒阳性55例次（82.09％），细菌阳性30例次（44.78％），真菌阳性14例次（20.90％）。外周血mNGS与传统检查的临床认可率为64.63％（63/98）；以传统检查结果作为参照标准，外周血mNGS敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）和阴性预测值（NPV）分别为75.68％、36.07％、41.79％和70.97％，整体一致率为51.02％。传统检查阴性的22例次肺部感染，有14例次外周血mNGS检出病原，其中10例次为临床认可。结论该组血液病合并发热患者外周血mNGS病毒检出率高、混合感染比例高；外周血mNGS阳性率明显高于血培养以及传统实验室检查；外周血mNGS在血液病合并发热患者病原检出方面具有较高的临床认可率、敏感性及阴性预测值。     

慢性淋巴细胞白血病CD49d表达模式与分子遗传学和热点突变基因的相关性

目的探索慢性淋巴细胞白血病患者CD49d表达模式与分子遗传学和热点突变基因的相关性。方法流式细胞术检测CD49d表达模式，以单峰与双峰、阴性与阳性为分组依据。采用组合探针荧光原位杂交（FISH）进行分子遗传学分析，二代测序（NGS）进行基因突变检测。结果CD49d阳性患者43例（23.89％），CD49d阴性患者137例（76.11％），CD49d单峰表达患者96例（53.33％），CD49d双峰表达患者84例（46.67％）。与CD49d阴性组患者相比，CD49d阳性组患者Rai分期高（P＝0.048），脾脏增大比例高（P＝0.030）。与CD49d单峰患者相比，CD49d双峰患者脾脏增大比例高（P＝0.009）。CD49d双峰阴性组11q22−发生率显著高于单峰阴性组（24.29％对10.45％，P＝0.043）。CD49d单峰组+12发生率高于双峰组（16.67％对5.95％，P＝0.035），单峰阳性组+12发生率高于双峰阴性组（17.24％对4.29％，P＝0.045），单峰阴性组+12发生率高于双峰阴性组（16.42％对4.29％，P＝0.024）。CD49d阳性组BIRC3突变率高于CD49d阴性组（11.63％对2.92％，P＝0.037）。结论CD49d与11q22−、+12和BIRC3基因突变有显著的相关性，CD49d呈双峰表达与预后较差指标相关。     

不同方法和标本检测华氏巨球蛋白血症患者MYD88突变的初步探索

目的探索如何提高华氏巨球蛋白血症（WM）患者MYD88突变检测的阳性率和准确率。方法回顾性分析2017年6月至2021年6月上海交通大学医学院附属瑞金医院66例初诊WM患者MYD88突变检测结果，分析不同方法和标本检测MYD88突变的阳性率和准确率。结果66例WM患者中51例MYD88突变阳性，整体阳性率77％。根据检测方法分类：二代测序（NGS）和等位基因特异性PCR（AS-PCR）检测突变阳性率显著高于一代测序Sanger法（84％对71％对46％，P<0.05）。根据标本取材部位分类：淋巴结和骨髓标本检测突变阳性率显著高于外周血标本（79％对84％对52％，P<0.05）。NGS检测淋巴结、骨髓和外周血MYD88突变阳性率分别为86％、90％和67％。AS-PCR检测淋巴结、骨髓和外周血MYD88突变阳性率分别为78％、81％和53％。39例WM患者进行≥2次MYD88突变检测，以每例患者最终突变检测结果作为标准，判断不同方法和标本的准确率。淋巴结（18例）和骨髓（13例）NGS检测准确率显著高于外周血（4例）标本（100％对100％对75％，P<0.05）。淋巴结（15例）、骨髓（11例）和外周血（16例）AS-PCR检测准确率的差异无统计学意义（93％对91％对88％，P>0.05）。结论在检测WM患者MYD88突变情况方面，NGS或AS-PCR法优于Sanger法，淋巴结和骨髓标本优于外周血标本。     

伴ASXL1基因突变初诊急性髓系白血病患者的临床特征及生存分析

目的研究伴ASXL1基因突变初诊急性髓系白血病（AML）患者的临床特征及生存。方法对2016年1月至2021年4月就诊于山东大学齐鲁医院的初诊非M₃型AML患者的临床资料进行回顾性研究，分析ASXL1突变阳性患者的临床特征及生存。基因突变检测采用二代测序法。结果①初诊且资料完整的256例AML患者纳入研究，其中ASXL1突变阳性（ASXL1⁺）47例，阴性（ASXL1⁻）209例。将所有患者分为老年组（≥60岁）92例、中年组（45～59岁）92例和青年组（≤44岁）72例。②与ASXL1⁻患者相比，ASXL1⁺患者年龄大、WBC高、首疗程完全缓解（CR₁）率低（P值均<0.05）。老年组ASXL1⁺患者WBC、异常细胞占有核细胞比例高于ASXL1⁻患者（P值均<0.05）；青年组ASXL1⁺患者WBC高于ASXL1⁻患者（z＝−2.314，P＝0.021）。③ASXL1突变与IDH2突变相关（P＝0.018，r＝0.34）。在ASXL1⁺患者中，高变异等位基因频率（VAF）组（VAF>40％）外周血原始幼稚细胞比例高于低VAF组（VAF<20％），且碱基重复和替换突变患者的异常细胞占有核细胞比例高于缺失突变患者（P值均<0.05）。④ASXL1⁺患者中位总生存（OS）时间和无进展生存（PFS）时间均短于ASXL1⁻患者（10个月对20个月，10个月对 17个月；P值均<0.05）。多因素分析示异常细胞占有核细胞比例≥20％、复杂核型、TET2突变均为影响ASXL1⁺患者预后的独立危险因素（P值均<0.05）。结论伴ASXL1突变非M₃型AML患者初诊时WBC、异常细胞占有核细胞比例均高，CR₁率低，OS及PFS时间短。ASXL1突变患者中高VAF、碱基重复和替换突变与预后不良有关，异常细胞占有核细胞比例高、复杂核型和TET2突变均为影响预后的独立危险因素。     

CD19嵌合抗原受体T细胞制备条件优化及其体内外杀伤作用研究

目的优化小鼠CD3⁺T细胞体外刺激活化体系及最佳感染时间，构建小鼠CD19嵌合抗原受体T细胞（mCD19 CAR-T），并验证其在体内外的杀伤效果。方法磁珠分选纯化小鼠的脾脏CD3⁺T细胞，在可溶性抗CD3/CD28抗体、佛波酯+离子霉素、包被抗CD3/CD28抗体3种不同条件下刺激培养，分别于8、24、48和72 h流式细胞术检测细胞活性情况；用包含小鼠CD19抗体的scFv质粒转染Plat-E细胞，包装逆转录病毒后感染活化的CD3⁺T细胞，制备鼠特异性的CD19嵌合抗原受体T细胞（mCD19 CAR-T）。mCD19 CAR-T细胞在体外与B淋巴瘤细胞株A20细胞共培养，利用流式细胞术检测其对A20细胞的靶向杀伤效果；建立淋巴瘤小鼠模型，体内输注mCD19 CAR-T细胞，检测CAR-T细胞的体内杀伤和分布情况。结果包被抗CD3/CD28抗体的刺激活化效果最佳，且在刺激后24～48 h具有较好的细胞活性；抗mCD19的逆转录病毒感染CD3⁺ T细胞效率［（32.27±7.56）％］稳定，制备的mCD19 CAR-T细胞可特异性杀伤A20肿瘤细胞，48 h时A20细胞凋亡率为24.3％；体内检测发现输注mCD19 CAR-T细胞第6天即可检测到脾脏中CD19⁺细胞比例［（1.83±0.58）％］显著降低，到建模后第12天骨髓和脾脏中CD19⁺细胞清除更为显著，与A20细胞组相比差异具有统计学意义［脾脏：（0.36±0.04）％对（47.00±13.46）％，P<0.001；骨髓：（1.82±0.29）％对（37.30±1.44）％，P<0.0001］。且mCD19 CAR-T细胞在外周血、脾脏和骨髓中均有分布，GFP⁺CD3⁺ CAR-T细胞比例分别为（2.90±1.12）％、（4.96±0.80）％、（13.55±1.56）％，以骨髓中占比最高。结论获得优化的CD3⁺ T细胞活化刺激体系和最佳感染时间，稳定构建了抗mCD19 CAR-T细胞，并在体内外验证其具备良好的杀伤能力。     

靶向CLL-1嵌合抗原受体T细胞的构建及其功能验证

目的探索开发一种靶向CLL-1的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）并验证其功能。方法通过流式细胞术检测急性髓系白血病（AML）细胞系和AML原代细胞CLL-1靶点的表达水平。构建CLL-1 CAR载体并制备出相应慢病毒，感染激活后T细胞生产出CAR-T细胞，并通过体外和体内实验验证CLL-1 CAR-T细胞的功能。结果AML细胞系和原代AML细胞中均表达CLL-1。制备的CLL-1 CAR-T细胞转导率为77.82％，在AML细胞系以及AML原代细胞中，CLL-1 CAR-T细胞能明显特异性杀伤表达CLL-1的靶细胞系和原代肿瘤细胞。相对于未转导的T细胞，CLL-1 CAR-T细胞在杀伤靶细胞和原代肿瘤细胞时分泌IL-6、IFN-γ等细胞因子水平更高（P值均<0.001）。在AML人源性异种移植小鼠模型中，相对于未转导的T细胞，CLL-1 CAR-T细胞表现出有效的抗白血病活性并延长小鼠存活时间［未达到对22（95％ CI 19～24）d，P＝0.002］。结论靶向CLL-1的CAR-T细胞成功开发并具有较好的肿瘤杀伤作用。     

再生障碍性贫血小鼠模型中免疫活化T细胞动力学研究

目的探索再生障碍性贫血（AA）小鼠模型中供者来源T细胞不同时间点动力学变化。方法构建AA小鼠模型，分别于不同时间点采用流式细胞术测定模型小鼠脾脏与骨髓内供者T细胞比例、活化分子表达、细胞周期及功能亚群，评估不同时期T细胞功能状态。结果①半致死剂量照射联合主要组织相容性抗原（MHC）半相合的淋巴结细胞输注成功构建T细胞免疫介导的AA小鼠模型。②AA小鼠脾脏中供者T细胞从移植第3天后开始明显浸润，并逐渐出现CD4⁺/CD8⁺比例倒置，第5天开始进入骨髓，以CD8⁺细胞浸润为主。③CD69在供者CD4⁺细胞中表达高峰晚于CD8⁺细胞，CD25在CD4⁺细胞与CD8⁺细胞中表达水平的变化趋势相同，但在CD8⁺细胞中的表达高于CD4⁺细胞。④脾脏内供者CD4⁺细胞S/G₂/M期比例在移植后第3天即达高峰，约12％，而CD8⁺细胞中S/G₂/M期比例在移植后第5天达高峰，约20％，且两者在进入骨髓后S/G₂/M期比例均再次升高，但移植第3天后其比例在脾脏与骨髓CD8⁺细胞中持续高于CD4⁺细胞。⑤脾脏内免疫活化的T细胞经历短暂的中枢记忆T细胞（T_CM）阶段后迅速分化为效应记忆T细胞（T_EM），进入骨髓后部分T_EM分化为效应细胞进一步发挥效应功能。结论AA小鼠模型中供者T细胞进入异体后迅速活化，5天内达增殖高峰，并完成向T_EM细胞的分化，5天后开始进入骨髓进一步增殖损伤造血。