毛冬青酸抗血栓实验研究及机制探讨

目的：研究毛冬青酸(I1exo1ic acid，ILa)的抗血栓作用及其作用机制。方法：测闭塞性血栓形成时间(occlusivc thrombus formarion time，OT)；称大鼠下腔静脉血栓湿重；测大鼠血浆凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(KPTT)；测大鼠血浆优球蛋白溶解时间(ELT)；ADP、胶原诱导家兔血小板聚集，测5min血小板最大聚集率(MPAR5M)；放射免疫法测大鼠胸主动脉壁6-酮-PGFla和血小板内cAMP含量。结果：iv ILa20、40、80mg／kg均可明显延长大鼠颈总动脉OT，减轻大鼠下腔静脉血栓湿重，缩短ELT，对PT和KPTT无影响；iv ILa25、50mg／kg均能明显抑制ADP、胶原诱导的血小板聚集；iv ILa20、40、80mg／kg，大鼠胸主动脉壁6-酮-PGF1a含量均增加；ILa3、6mg／m1 PRP 37℃水浴15min，血小板内cAMP含量均增加。结论：ILa具有抑制动、静脉血栓形成的作用。     

新型重组膜联蛋白B1的特征及其抗血液凝固活性的比较

目的 研究毕赤酵母重组膜联蛋白B1的特征变化．比较其和原核表达产物对血细胞凝集与血栓形成过程的影响。方法 对毕赤酵母重组膜联蛋白B1行SDS-PAGE．等电聚焦．脱磷酸反应．蛋白质N端氨基酸测序．白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)测定及大鼠下腔静脉血栓形成观察。结果 毕赤酵母重组膜联蛋白B1显示两条电泳带．其中一条带的相对分子质量比原核表达产物大．已被磷酸化．等电点较理论值低．两条带的N端均携带了来自载体的4个氯基酸．毕赤酵母重组膜联蛋白B1和大肠杆菌谷胱甘肽转移酶融合膜联蛋白B1具有明显的抗凝及抑制血栓形成作用。结论 虽然毕赤酵母重组膜联蛋白B1的分子特征较原核产物有了明显变化．但其抗凝及抑制血栓功能基本未受影响。     

叶下珠有效部位静脉注射对动物血栓形成及凝血系统的影响

目的:探讨静脉注射叶下珠有效部位(含corilagin 60 %以上,简称PUW)的抗血栓作用及其机制,同时评价PUW对凝血系统的影响. 方法:采用小鼠尾静脉注射花生四烯酸 (arachidonic acid, AA) 致肺微循环血栓、电刺激大鼠颈动脉血栓和结扎大鼠下腔静脉引起的血栓模型综合评价PUW的抗血栓形成作用;利用玫瑰花结试验观察PUW对血小板与中性粒细胞之间黏附反应的影响;评价PUW对家兔优球蛋白溶解时间 (euglobulin lysis time,ELT)、凝血酶原时间 (prothrombin time, PT) 及白陶土部分凝血活酶时间 (kaolin partial thromboplastin time, KPTT) 和大鼠尾静脉出血时间的影响.结果:PUW静脉注射可明显减少AA引起的小鼠死亡数、延长电刺激颈动脉闭塞时间并减轻下腔静脉血栓的湿重和干重;PUW显著降低血小板-中性粒细胞之间的黏附率,其半数抑制浓度为39.7 mg/L.10 mg/kg的PUW 静脉注射明显缩短ELT、延长KPTT和尾静脉出血时间,对PT无明显影响.结论:PUW 静脉注射具有明显的抗血栓形成作用,其机制与阻抑血小板-中性粒细胞间相互作用密切相关;PUW有引起出血的倾向,但与阿司匹林或尿激酶比较,其出血的危险性明显减小.     

柏椿颗粒的抗炎、止血作用的实验研究

探讨柏椿颗粒的抗炎、止血作用。琼脂皮下注射法制作大鼠肉芽肿模型,用不同剂量的柏椿颗粒分别给大鼠灌胃给药,用妇乐冲剂作对照,观察以上两种药物对肉芽肿的影响,并进行病理切片;用不同剂量的两种药物分别给大鼠和小鼠灌胃给药,检测其出血时间（BT）、凝血时间（CT）、凝血酶原时间（PT）和白陶土部分凝血活酶时间（KPTT）。结果：柏椿颗粒能抑制子宫炎症及肉芽肿的肿块,减少浆细胞的浸润;能缩短BT、CT、PT和KPTT。提示：柏椿颗粒具有抗炎、止血作用,且优于妇乐冲剂。     

猪囊尾蚴Annexin32的组织定位

目的：用免疫组化方法对猪囊尾蚴抗原Annexin32进行组织定位。方法：首先将Annexin32在大肠杆菌中进行表达，表达的Annexin32蛋白经亲和层析、凝血酶切割纯化，以囊虫病病猪血清检测表达蛋白的抗原性；然后将纯化蛋白免疫新西兰白兔，获得抗Annexin32的多克隆抗体；最后将新鲜剥离的囊尾蚴进行冰冻切片，用免疫组化方法进行定位研究。结果：表达的Annexin32蛋白可以被囊虫病病猪血清特异地识别。制备的多克隆抗体的效价为1：40万。免疫组化定位结果显示，Annexin32主要在囊壁中表达，头节部表达较少；囊尾蚴周边肌肉组织也有表达。结论：Annexin32主要分布于囊尾蚴的囊壁，而且它可能是一种分泌性蛋白，可以分泌到周围的肌肉组织中。     

倒卵叶五加总皂甙对大鼠血栓形成及家兔凝血功能的影响

目的：观察倒卵叶五加总皂甙对实验性血栓形成与凝血功能的影响。方法：经舌下静脉注射该制剂，观察其对动、静脉血栓模型的影响，测定复钙时间、凝血酶原时间与凝血时间。结果：倒卵叶五加总皂甙明显抑制大鼠动静脉血栓形成，明显延长家兔复钙时间、凝血酶原时间和凝血酶时间，结果：倒卵叶五加总皂甙具有抗血栓形成与抗凝作用。     

溶栓素抗凝血和抗血栓形成作用的实验研究

目的：评价溶栓素的生化药效,研究溶栓素的抗凝血和抗血栓作用。方法：应用玻片法和毛细管法研究溶栓素对小鼠凝血时间的影响;应用大鼠体内、体外血栓形成法及家兔体外血栓形成法研究溶栓素对血栓形成的影响;研究溶栓素对大鼠凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）和纤维蛋白原含量（Fbg）的影响。结果：溶栓素剂量在0.25、0.5及1.0 mg•kg^-1体重时,能明显地延长小鼠凝血时间;在0.2、0.4及0.8 mg•kg^-1体重时,能有效抑制大鼠体内、体外血栓形成;在0.2 mg•kg^-1体重时,能有效地抑制家兔体外血栓形成;在0.2、0.4及0.8 mg•kg^-1体重时,能显著地降低大鼠Fbg含量,对APTT、PT未见显著影响。结论：溶栓素具有明显的抗凝血和抗血栓作用,是一种有临床应用前景的治疗血栓性疾病的药物。     

双叶抗栓素抗血栓形成作用的研究

本文报道了五叶参、桑叶抗血栓形成的新作用。通过体外实验研究证实,五叶参、桑叶水煮制备液能明显抑制ADP、复合诱聚剂诱导的血小板1分、5分、最大聚集率,并促进解聚发生(P均<0.05):二种药物还对体外血栓形成具有显著的抑制作用(P均<0.05;五叶参、桑叶与PPP混合后,尚能抑制多种凝血因子活性.使KPTT、PT、TT、AT、RVV-RT、RVV-CT等凝血试验时间延长(P均<0.05);此外.二种药物皆可加速红细胞电泳速度。上述结果表明,五叶参、桑叶是二种具有抑制血小板功能、凝血象及红细胞聚集性等多个环节的抗血栓形成药物,值得进一步研究探讨。     

口服类肝素理化性质和药理活性的研究

目的：制备口服类肝素样品并研究其理化性质、促脂酶释放活性和抑制血栓形成作用。方法：猪十二指肠通过提取分离得到类肝素样品，采用常规方法测定其抗Xa因子活性、活化部分凝血激酶时间(APTT)活性等各项理化性质，采用比色测定法考察其促进肝脂酶(HL)和脂蛋白脂酶(LPL)释放活性，并采用大鼠动静脉旁路血栓模型考察其口服给药对血栓形成的抑制作用。结果：类肝素样品抗Xa因子活性70.4IU／mg，APTT活性33.8IU／mg，FXa／FIIa为2．1，促HL和LPL释放及抑制大鼠动静脉旁路血栓作用显著。结论：类肝素样品具有显著的促HL和LPL释放及口服抑制血栓形成作用。     

叶下珠有效部位对凝血系统的影响

目的 探讨叶下珠含corilagin(1-酰-3．6-六羟基联苯二甲酰基葡萄糖)有效部位的水溶性部分(简称PUW)对凝血系统的影响。方法 采用Kowalski、黄正良及顾月芳等方法观察PUW iv对家兔优球蛋白溶解时间(euglobulin lysis time ，ELT)、全血凝血时间、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、白陶土部分凝血活酶时间(kaolin panial thromboplastin time,KPTT)及犬鼠昆犬出血时间的影响。结果 PUW iv明显缩短ELT，在体内外均延长KPTT。对PT无明显影响；PUW对家兔全血凝血时间亦无影响，PUW虽延长大鼠尾尖出血时间，但与尿激酶或阿司匹林比较，PUW组的出血时间显著缩短。结论 PUW缩短ELT和延长KPTT是其具有明显的纤溶作用的原因之一；作为一种有苗头的抗栓药，PUW有引起出血的倾向，但不会造成严重的出血不良反应。     

Annexin32的酵母表达及免疫原性分析

目的：在毕赤酵母中表达Annexin32并研究其功能。方法：用G418法快速筛选出的9个高拷贝转化子，经平板培养法（MD和MM）及PCR鉴定表型后，分别在BMMY、BMM、MM3种培养基中以甲醇诱导表达，培养上清行SDS－PAGE和Western印迹鉴定，用（NH4）2SO4＋PI法沉淀，过FPLC－Superdex75分子筛纯化蛋白并以此免疫小鼠。结果：有两个表型为Mut^a的高拷贝转化菌表达量较高，以BMMY为优，表达产物有两条带，相对分子质量分别约为3.8万和4万，占分泌总蛋白的80％以上，产物浓度为200－350mg/L。Western印迹证实两条表达产物均具有天然Annexin32分子的免疫原性。动物实验证明，酵母表达的Annexin32的免疫原性明显高于原核表达者。结论：在毕赤酵母中成功表达了Annexin32，为进一步研究打下了基础。     

人重组白细胞介素11在毕氏酵母系统中的表达及纯化

目的在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达人白细胞介素-11(rhIL-11),便于进一步开发。方法以人工设计合成的rhIL-11基因,构建表达载体pPICZαA-IL-11,经线性化后电转化导入毕氏酵母菌株KM71,甲醇诱导表达,用ELISA和SDS-PAGE检测发酵上清中IL-11的抗原性和表达量,用IL-11依赖的B9-11细胞株分析其生物学活性,采用疏水层析、离子交换和凝胶过滤纯化发酵上清中的IL-11。结果序列分析表明,克隆载体中IL-11人工基因序列与设计相符;基因工程菌株KM71-2424在摇瓶培养上清中IL-11的表达量超过60mg/L,生物学活性测定显示其比活性为5.5×10     

结核分枝杆菌Ag85A在毕赤酵母中的表达、纯化及酶联免疫斑点试验研究

目的利用毕赤酵母表达和纯化结核分枝杆菌AgS5A蛋白,以期得到高效刺激T淋巴记忆细胞产生1．干扰素的特异性抗原。方法用PCR扩增得到Ag85a基因,构建出重组质粒pPic9k085a,通过电转化进入毕赤酵母,经遗传霉素G418抗性筛选、硫酸铵沉淀浓缩及离子交换层析纯化得到目的蛋白。最后以大肠杆菌和毕赤酵母表达的A邸5A分别为抗原刺激物进行酶联免疫斑点（Elispot）试验,分析其刺激BCG免疫小鼠T淋巴细胞产生Υ-干扰素（IFN-Υ）的能力。结果在毕赤酵母中成功克隆并稳定表达了Ag85A蛋白,Elispot检测结果表明,毕赤酵母比大肠杆菌产生的Ag85A蛋白,对小鼠T淋巴细胞的刺激效果更加明显（P〈0．05）,能产生更多的免疫斑点。结论毕赤酵母表达的Ag85A蛋白可以更高效的刺激T淋巴细胞,可用于检测结核杆菌感染诱导的细胞免疫应答。     

重组人可溶性凋亡素-2配体在Pichia系统中的表达

目的：在甲醇营养型酵母（Pichia)表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL,凋亡素－2配体）分子。方法：人可溶性TRAIL编码基因片段插入pIC3.5酵母表达载体,氯化锂转化酵母GS115株,甲醇诱导表达5d,SDS－PAGE和Western-blotting确认表达,L929细胞鉴定活性,结果：发现在酵母细胞中重组表达的TRAIL在SDS－PAGE上占总蛋白的50％以上,用抗人TRAIL多抗可以确认表达了TRAIL重组分子,杀伤肿瘤细胞的比活性较原核表达后复性的TRAIL有明显提高,并能诱导几株肿瘤细胞DNA片段化,说明TRAIL可能已正确折叠并形成活性必需的高级结构。结论：在Pichia系统中正确表达了可溶性TRAIL分子。     

恶性疟疾多价疫苗的构建及表达

目的 构建恶性疟原虫多表位融合抗原基因(PfCP2E9),并在毕氏酵母中进行高效分泌表达.方法 选取本实验室前期构建的融合蛋白PfCP-2.9与疟原虫红内期疫苗候选抗原EBA175IIF2,按一定的次序拼接成该融合基因,并克隆至酵母表达载体,用电转化方法将拼接基因导入毕氏酵母中进行分泌表达.结果 拼接的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达.结论 构建的恶性疟原虫多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达,为探讨其免疫学功能及作为多价联合疫苗的成分提供了基础.     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

肿瘤相关抗原17-1A在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的利用Pichia pastoris酵母表达系统表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A,为进一步设计肿瘤蛋白疫苗提供研究基础。方法通过RT-PCR从小鼠肾组织中扩增17-1A的cDNA,将其定向克隆到pPICZαA质粒上,获得重组质粒pPICZαA-17-1A,测序正确后,重组质粒电转化到Pichia pastoris酵母菌株GS115中,在甲醇诱导下,利用其AOX I基因的α信号肽,分泌表达17-1A抗原糖蛋白,并对获得的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果构建了pPICZαA-17-1A重组质粒,通过电转化将目的基因整合人酵母基因组中,重组毕赤酵母表达能够表达17-1A抗原并检测到抗原发生了糖基化。结论能够通过毕赤酵母表达系统稳定表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A。     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.