Annexin32的酵母表达及免疫原性分析

目的：在毕赤酵母中表达Annexin32并研究其功能。方法：用G418法快速筛选出的9个高拷贝转化子，经平板培养法（MD和MM）及PCR鉴定表型后，分别在BMMY、BMM、MM3种培养基中以甲醇诱导表达，培养上清行SDS－PAGE和Western印迹鉴定，用（NH4）2SO4＋PI法沉淀，过FPLC－Superdex75分子筛纯化蛋白并以此免疫小鼠。结果：有两个表型为Mut^a的高拷贝转化菌表达量较高，以BMMY为优，表达产物有两条带，相对分子质量分别约为3.8万和4万，占分泌总蛋白的80％以上，产物浓度为200－350mg/L。Western印迹证实两条表达产物均具有天然Annexin32分子的免疫原性。动物实验证明，酵母表达的Annexin32的免疫原性明显高于原核表达者。结论：在毕赤酵母中成功表达了Annexin32，为进一步研究打下了基础。     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)是一种广泛使用的外源基因表达系统，该系统不仅具有高效表达、高稳定、高分泌、高密度生长等特点，而且可以对表达产物进行类似真核细胞的翻译后修饰和加工等显著优点。该研究对巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作了简要的综述。     

NDRG2蛋白的毕赤酵母可溶表达与纯化

目的：酵母表达并纯化可溶性NDRG2蛋白。方法：从pRSET-A-ndrg2重组质粒中扩增出6his-ndrg2融合基因，克隆入酵母表达载体pPIC3.5K；酵母重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2电转化入毕赤酵母GS115，并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选；对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达，可溶性表达产物经Ni-NTA亲合层析纯化。结果：构建得到酵母融合重组表达载体pPIC3.5K-6his-ndrg2；经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体以上的重组酵母表达菌株；诱导后表达得到6his-NDRG2融合蛋白，并成功纯化得到可溶性表达产物。结论：表达并纯化得到可溶性NDRG2蛋白，为进一步研究NDRG2的结构与功能打下了必要的基础。     

纳豆激酶基因重组质粒在大肠杆菌与毕赤酵母中的稳定性

利用PCR方法以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因片段,分别克隆到原核表达载体pBV220与真核表达截体pPICZaA上,转化大肠杆菌HB101与毕赤酵母GS115,筛选重组子,通过限制性内切酶,PCR分析及序列测定,测定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因,对重组大肠杆菌与毕赤酵母中外源基因的稳定性进行研究比较,结果表明外源基因的插入对宿主菌的生长没有太大影响,重组质粒在E.coli HB101中具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差,而外源基因在毕赤酵母（GS115中很稳定。     

人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的：利用巴斯德华赤（Pichia pastoris）酵母真核表达系统,构建真核表达载体pPIC9K与人溶菌酶基因（humanlysozyme,hLY）的重组质粒pPIC9K-hLY,表达出具有活性的人溶菌酶。方法：此项研究在本实验室构建的人溶菌酶（hLY）基因与pUC19的重组质粒pUC19-hLY的基础上,通过设计一对引物,用多聚酶链式反应（PCR）扩增出人溶菌酶全基因片段后,将其克隆到巴斯德毕赤酶母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重建质粒pPIC9K-hLY,经Bg1Ⅱ酶切线性化后,用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内。通过G418筛选,选到的高拷贝转化子经PCR检测人溶菌基因与毕赤酵母染色体是否稳定整合,阳性克隆经甲醇诱导进行表达。结果：序列测定,经PCR扩增后的人溶菌酶基因与献发表的序列相比,缺失4个碱基。我们决定采用重组PCR法予以纠正,经序列测定结果正确。用PCR检测,人溶菌酶基因与毕赤酵母染色体稳定整合。用甲醇诱导表达并以SDS－PAGE分析,在Mr为15000左右出现一条蛋白带,表达量约占上清总蛋白的0．47。Western Blot证实表达产物具有天然人溶菌酶的抗原性。用黄色小球菌平板溶圈法鉴定表态产物具有人溶菌酶的活性。结论：成功的构建了重组质粒pPIC9K-hLY并在毕赤醇母中表达了人溶酶基因。     

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母表达系统是一种新的，极具潜力的真核表达系统，具有其他系统不可比拟的优点，在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。     

Neuritin在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的：构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探讨Neuritin的生物学功能及作用机制奠定基础。方法和结果：在巳克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF与载体pPIC9k重组,然后利用电击转化将重组质粒pPIC9k—Neuritin导入GSll5酵母菌株。筛选出阳性克隆经PCR及测序正确后,用甲醇诱导Neuritin分泌表达;表达产物经SDS—PAGE及Western—blot鉴定。结论：成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。     

IL-18在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:探索人IL-18成熟蛋白(mhIL-18)在毕赤酵母中的高效表达. 方法:采用SOEing及不对称PCR方法扩增出mhIL-18基因并构建融合型表达载体pPIC9-IL-18-Intein,转化入毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,运用SDS-PAGE和Western Blot分析重组蛋白的表达,并经亲和层析后用MTT法检测表达的mhIL-18生物活性. 结果:成功构建载体并转化入毕赤酵母,经甲醇诱导,重组的GS115可分泌mhIL-18,其表达在96 h时达高峰,分泌量可达100 mg/L. 亲和层析后的mhIL-18纯度可达95%,并具有显著的IL-18的生物学活性. 结论:在毕赤酵母中成功表达具有显著生物学活性的mhIL-18.     

毕赤酵母分泌表达系统的研究进展

毕赤酵母表达系统是一种新的,极具潜力的真核表达系统,具有其他系统不可比拟的优点,在生物医药领域正在得到越来越广泛的应用。本文综述了该蛋白表达系统的一些特征及影响其表达的相关因素。     

膜联蛋白A5 cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:克隆人膜联蛋白A5 cDNA并在大肠杆菌系统内作表达.方法:利用RT-PCR技术从人胎盘组织的总RNA扩增膜联蛋白A5的cDNA序列,将该基因插入GST融合表达载体pGEX-5T,在tac 启动子控制下,IPTG诱导表达GST融合蛋白.以亲合层析法纯化表达的融合蛋白,用KPTT法验证抗凝血活性.结果:凝胶电泳显示PCR扩增产物的长度为978 bp,重组质粒测序结果表明,插入片段与人膜联蛋白A5的序列完全一致.在IPTG诱导下,K802重组菌高效表达出相对分子质量为58 000的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26%.纯化蛋白具有很强的抗凝血活性.结论:成功克隆人膜联蛋白A5基因并在大肠杆菌中高效表达.     

新型重组膜联蛋白B1的特征及其抗血液凝固活性的比较

目的 研究毕赤酵母重组膜联蛋白B1的特征变化．比较其和原核表达产物对血细胞凝集与血栓形成过程的影响。方法 对毕赤酵母重组膜联蛋白B1行SDS-PAGE．等电聚焦．脱磷酸反应．蛋白质N端氨基酸测序．白陶土部分凝血活酶时间(KPTT)测定及大鼠下腔静脉血栓形成观察。结果 毕赤酵母重组膜联蛋白B1显示两条电泳带．其中一条带的相对分子质量比原核表达产物大．已被磷酸化．等电点较理论值低．两条带的N端均携带了来自载体的4个氯基酸．毕赤酵母重组膜联蛋白B1和大肠杆菌谷胱甘肽转移酶融合膜联蛋白B1具有明显的抗凝及抑制血栓形成作用。结论 虽然毕赤酵母重组膜联蛋白B1的分子特征较原核产物有了明显变化．但其抗凝及抑制血栓功能基本未受影响。     

猪囊尾蚴Annexin32的组织定位

目的：用免疫组化方法对猪囊尾蚴抗原Annexin32进行组织定位。方法：首先将Annexin32在大肠杆菌中进行表达，表达的Annexin32蛋白经亲和层析、凝血酶切割纯化，以囊虫病病猪血清检测表达蛋白的抗原性；然后将纯化蛋白免疫新西兰白兔，获得抗Annexin32的多克隆抗体；最后将新鲜剥离的囊尾蚴进行冰冻切片，用免疫组化方法进行定位研究。结果：表达的Annexin32蛋白可以被囊虫病病猪血清特异地识别。制备的多克隆抗体的效价为1：40万。免疫组化定位结果显示，Annexin32主要在囊壁中表达，头节部表达较少；囊尾蚴周边肌肉组织也有表达。结论：Annexin32主要分布于囊尾蚴的囊壁，而且它可能是一种分泌性蛋白，可以分泌到周围的肌肉组织中。     

人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化

 目的 制备具有凝血活性的重组人组织因子（recombinant tissue factor, r-TF） 用于构建 PT 试剂盒。 方法 将人组织因子胞外区编码基因与酵母表达载体重组，构建酵母表达质粒 pPIC9K-TF，利用电穿孔法转化宿主菌 Pichia pastoris GS115，转化子经 G418 抗性筛选后，获得高表达克隆。工程菌在摇瓶中经甲醇诱导，表达 r-TF，表达产物经纯化后，鉴定生物活性。 结果 SDS-PAGE 证实表达产物的分子量为 37000-45000,Western-Blot证明其为人组织因子衍生物，纯化后，r-TF 经脂化后，具有促凝血活性，为研制凝血活酶时间测定试剂盒及研究 TF 的构效关系创造条件。 结论 用毕赤酵母高效表达具有活性的rTF，表达量达到182mg/L。纯化工艺简便易行，蛋白回收率高，纯化后的rTF可用于组装PT测定试剂盒。     

HIV-1 HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达及免疫原性分析

目的研究对人类免疫缺陷病毒Ⅰ型HXB2株调控蛋白Tat原核表达产生影响的区域和Tat蛋白重要的抗原表位。方法用PCR方法获得Tat(1-48aa)、Tat(22-72aa)和Tat(38-101aa)DNA片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa),并转入E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达及纯化,SDS-PAGE鉴定表达及纯化产物。采用间接ELISA方法用兔抗pET32a-Tat抗血清对三种肽段进行免疫原性分析。结果成功构建了pET32a-Tat(1-48aa)、pET32a-Tat(22-72aa)和pET32a-Tat(38-101aa)质粒,分别表达出相对分子质量(Mr)为23×103、23×103和25×103的融合肽段,其浓度分别为4.26、3.35和5.11mg/ml。间接ELISA结果表明三种融合肽段与兔抗pET32a-Tat抗血清均呈特异性结合反应,其抗体滴度分别为1:128000、1:32000、1:64000,而抗血清与pET32a蛋白仅有较弱结合。结论半胱氨酸富集区(22-37位氨基酸)对Tat蛋白的原核表达有较显著影响;Tat蛋白的N端区、碱性区和C端区是其重要的抗原表位,其中N端区的免疫原性最强。     

可溶性GPC3基因的克隆及酵母表达

目的克隆可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（soluble glypican-3,sGPC3）基因,并分泌表达重组蛋白。方法通过RT-PCR克隆sGPC3 cDNA,利用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点,将sGPC3基因插入酵母表达载体pPICZαA中,构建真核表达质粒pPICZαA-sGPC3,以该表达质粒转染酵母菌株X-33,在含有Zeozin的YPD平板上进行筛选,然后对PCR鉴定为阳性的酵母重组子进行甲醇诱导表达,表达上清经SDSPAGE和Western blot检测。结果使用特异性引物进行RT-PCR,获得约1 600 bp左右与目的基因大小相符的条带,构建的真核表达质粒pPICZαA-sGPC3表达框正确无误,阳性酵母重组子x-33/pPICZαAsGPC3诱导表达上清在60 000处有与预期大小相符的蛋白条带,且该蛋白条带与抗6×His单克隆抗体孵育后呈现特异性反应。结论成功克隆了可溶性GPC3基因,并在毕赤酵母中获得分泌表达,为进一步研究sGPC3对肝细胞癌的作用及作用机制、开发一种生物治疗肝癌的新型药物奠定了基础。     

重组人α8干扰素在大肠杆菌中的克隆与高表达

利用基因重组技术构建了人干扰素α８（ＩＦＮ－α８）高表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉＸＬｌ－Ｂｌｕｅ／ｐＢｍ，经酶切鉴定、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及生物活性测定等分析，表明能特异性地表达具有生物活性的ＩＦＮ－α８，表达量达到总菌体蛋白的２３％，经复性后比活为４．８×１０７ＩＵ／ｍｇ，具有良好的应用前景。     

水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.