Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性影响的研究

目的：观察Smac基因过表达对胃癌细胞株化疗敏感性的影响。方法：采用脂质体lipofec-tamine2000介导的方法,将Smac基因转入胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR和Western-blot法检测未转染对照组、空载体pcDNA3．1转染对照组、pcDNA3．1-Smac转染组胃癌细胞中Smac基因的表达。选用紫杉醇（1、5、10ug／mL）处理转染前后的胃癌细胞,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖活性,倒置显微镜下观察细胞形态变化并摄片。结果：同未转染对照组和空载体pcDNA31转染对照组比较,pcDNA31-Smac转染组SGC-7901细胞SmacmRNA和蛋白表达水平显著增高（F）〈O01）;紫杉醣处理24、48h后,pcDNA3．1-Smac转染组细胞生长抑制率增加（P〈O01）;使用化疗药物后,细胞明显变圆、折光增强、漂浮细胞增多,pcDNA3．1-Smac转染组细胞形态变化最为显著。结论：转染外源性Smac基因并使其在胃癌细胞中过表达,能提高SGC-7901细胞对化疗药物的敏感性。     

RECK基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建RECK(reversion-induc ing-cyste ine-rich prote in w ith Kazal motifs)基因的真核表达载体,通过脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2并获得高表达RECK蛋白的细胞克隆。方法用RT-PCR方法扩增出人RECK基因,构建真核表达载体pcDNA3-RECK,采用脂质体介导法将重组质粒导入体外培养的HepG2细胞,RT-PCR和W estern b lot检测转染细胞和未转染细胞中RECK基因mRNA及蛋白质的表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pcDNA3-RECK,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达RECK的细胞克隆;W estern b lot显示转染前的细胞未检测到RECK基因mRNA及蛋白质表达,但转染后表达量明显增高。结论重组质粒pcDNA3-RECK经转染能在HepG2细胞中高效表达,为进一步研究RECK对肝癌细胞的生物学影响奠定了基础。     

人血栓调节蛋白基因编码片段的克隆及在真核细胞中的表达

目的 构建人血栓调节蛋白（hTM）基因真核表达质粒，并导人两种真核细胞[非洲绿猴肾母细胞（COS-7细胞）和脐静脉内皮细胞（HUVECs）]中表达，为临床血栓病的基因治疗提供实验依据和物质基础。方法采用PCR法扩增hTM基因的表达片段，HindⅢ＋EcoR Ⅰ酶切后与pcDNA3．1（＋）／neo质粒连接成pcDNA3．1／hTM。经鉴定确认后，由阳离子脂质体包裹转染COS-7细胞及HUVECs，RT-PCR和免疫组化法分别检测转染后细胞hTM的mRNA及蛋白的表达。结果双酶切及测序鉴定均证实hTM基因表达片段被成功克隆，pcDNA3．1／hTM经脂质体介导能有效地转染COS-7细胞和HUVECVs。结论成功构建pcDNA3．1／hTM重组质粒，并且能在两种真核细胞中高效表达，为进一步的基因治疗和对TM抗凝机理研究提供了物质基础。     

大鼠葡萄糖转运体3真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建大鼠葡萄糖转运体3（GLUT3）的真核表达载体，为进一步研究葡萄糖转运体3对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定基础。方法以逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）的方法从大鼠脑组织中获取GLUT3全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3，随后用Lipofectamine^TM2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR的方法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组织化学的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。结果克隆的大鼠GLUT3全长cDNA大小约1．5kb且无碱基突变，以构建的重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-Glut3转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体3的表达。结论成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体3的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-Glut3，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因。     

真核表达载体pcDNA3.1-β淀粉样前体蛋白裂解酶的构建及其在COS-7细胞中瞬时表达

目的 构建β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE）基因的真核表达载体，为修复阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）损伤神经元奠定基础。方法采用RT-PCR方法，从人的成神经细胞瘤的总cDNA中，扩增出1．5kb的BACE cDNA片段，再用BamHI和XhoI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；以免疫细胞化学法检测BACE基因的表达情况。结果人BACE基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1质粒中；经脂质体转染COS-7细胞后，并由潮霉素进行筛选，可见转染细胞胞浆中和胞膜上有较高量的BACE蛋白表达。结论成功构建了pcDNA3．1-BACE的真核表达载体，为研究BACE基因在AD发病机制中的作用及抑制BACE，为治疗AD奠定一定的实验基础。     

真核表达载体pcDNA3.1(-)-转化生长因子β3的构建

目的为研究成纤维细胞基因转染的可行性创造条件，从而为转化生长因子（TGF）83转基因治疗创面与病理性瘢痕的研究奠定基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体，经脂质体Lipofectamlne^TM 2000介导质粒转染NIH3T3细胞后应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测hTGFβ3 mRNA在真核细胞中的表达。结果重组真核表达载体pcDNA3，1（-）-hTGFβ3经限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切，电泳后显示1253hp的hTGFβ3目的片段和5．40kb的pcDNA3．1（-）载体片段，测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同，证实pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体构建成功，经RT-PCR检测了hTGFβ3在转录水平mRNA的表达情况，表明质粒转染NIH3T3细胞后hTGFβ3 mRNA的表达明显增强。结论重组真核表达载体构建正确，并能在NIH3T3成纤维细胞中表达hTGFβ3 mRNA，为其在创面与病理性瘢痕的转基因治疗奠定了基础。     

RNAi表达载体对膀胱癌细胞Livin基因表达的抑制作用

目的观察RNA干扰（RNAi）表达载体对膀胱癌BIU-87细胞Livin基因的抑制作用。方法构建针对Livin基因的RNAi质粒表达载体，脂质体法转染膀胱癌BIU-87细胞株，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot检测其对Livin mRNA及蛋白表达的影响。结果构建的表达质粒在膀胱癌BIU-87细胞株中均抑制了Livin mRNA及蛋白表达。与空白载体组细胞作对照，前者产生的小干扰RNA（siRNA）在对Livin mRNA的抑制率24、48h分别为（81．28±9．21）％、（55．88±6．27）％，蛋白抑制率24h为（64．75±7．55）％。结论RNAi表达载体可以有效地抑制膀胱癌细胞Livin基因的表达。     

神经生长因子对人胆管癌细胞增殖作用的影响

目的探讨神经生长因子（NGF）对人胆管癌细胞株QBC939增殖能力的影响。方法构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF，经酶切鉴定后，采用脂质体lipofectamine转染人胆管埔细胞株QBC939。Western Blot检测蛋白的表达情况。MTT法检测转染前后细胞的增殖情况。结果成功构建β—NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF：转染QBC939细胞后，能稳定表达β-NGF蛋白，且表达强度随转染质粒浓度的增加而增强，与对照组相比，差异有显著性（P〈0.0001）。MTT检测转染后的细胞增殖能力增强，与空白对照组和转染空质粒组相比，差异有显著性（P〈0．01）．且表现出量效依赖关系。结论NGF具有促进胆管癌细胞株QBC939增殖的作用。     

DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒转染对人膀胱癌细胞DNMTs表达的影响及其生物学效应

目的：探讨DNMT1、DNMT3b基因在膀胱癌发生发展中的作用。方法：①将DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒分别单独和共同转入人膀胱癌细胞系Nu87;②半定量RT—PCR和WesternBlot分别检测DNMT1和DNMT3b基因mRNA和蛋白水平的变化;③用MTT法观察各组细胞生长曲线,流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果：单独和共同转染DNMT1（或DNMT3b）mRNA、蛋白表达量明显下降,能影响BIU一87的生长曲线,使细胞增殖减慢,并使细胞周期阻滞于G1期,明显提高细胞调亡率;转染空质粒和单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。结论：联合转染DNMT1、DNMT3bsiRNA重组质粒,可同时下调DNMT1和DNMT3b在BIU87细胞中的表达,并能在体外抑制BIU-87细胞生长,促进细胞凋亡发生,其效果优于单独转染的重组质粒。单独转染DNMT3bsiRNA重组质粒对BIU-87细胞的生长和增殖无明显影响。     

PTEN基因转染对人膀胱癌细胞BIU-87中P13K—Akt信号通路的影响

目的研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞BIU-87中P13K—Akt信号通路的作用。方法将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5=并扩增，抽提纯化质粒并进行酶切鉴定，pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞（pBp-PTEN—BIU87），筛选稳定转染的细胞并扩增培养，以转染了空质粒pBp的BIU-87细胞（pBp—BIU87）和正常BIU-87细胞为对照，用RT—PCR检测PTEN的表达情况。将PTEN基因的真核表达质粒转染膀胱癌细胞BIU一87（pBp—PTEN—BIU87），以BIU87细胞和pBp-BIU87细胞为对照，应用Wester blot方法检测三组细胞P110（P13K的催化亚单位）、磷酸化P110、Akt和磷酸化Akt表达的情况。结果3种细胞P110和Akt蛋白总水平没有变化，但磷酸化P110和磷酸化Akt在PTEN转染细胞中的表达明显弱于对照组。结论PTEN是通过对PI3K—Akt信号传导途径的负调控而抑制肿瘤的形成。PTEN—PI3K—Akt途径可能是PTEN抑癌作用的重要机制。     

转染NK4基因对膀胱癌移行上皮细胞HGF基因表达的影响

目的观察转染NK4基因对膀胱癌上皮细胞HGF基因表达的影响。方法利用脂质体Lipofectin-2000将质粒pcDNA3（＋）／NK4导入BIU-87膀胱癌细胞，用pcDNA3（＋）作为阴性对照。G418稳定筛选阳性细胞克隆后，逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染细胞和对照组细胞NK4基因mRNA水平表达，Western blot检测转染后细胞培养上清液NK4和细胞胞质HGF蛋白的表达含量。结果转染阳性细胞NK4 mRNA恒定表达，RT-PCR和Western blot分别显示在mRNA转录水平和蛋白表达水平，稳定转染的膀胱癌细胞NK4含量明显高于对照组。转染了NK4基因的肿瘤细胞HGF蛋白表达水平明显降低，而转染空载体则无作用。结论脂质体将外源NK4基因导入肿瘤细胞后能稳定表达NK4蛋白，而且可以有效降低肿瘤细胞HGF表达的水平。     

神经生长因子对人胆管癌细胞体外侵袭力影响的研究

目的 探讨神经生长因子对人胆管癌细胞株QBC939体外侵袭力的影响。方法 构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF,经酶切鉴定后,采用脂质体Lipofectamine转染人胆管癌细胞株QBC939,Western blot检测蛋白的表达情况,Transwell小室检测转染前后细胞侵袭力的变化情况。结果 成功构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF,转染QBC939细胞后,能够稳定表达β-NGF蛋白,且表达强度随转染质粒浓度增强而增强,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）,Transwell小室检测转染后胆管癌细胞侵袭力增强,与空白对照组和转染空质粒组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 NGF具有增强胆管癌细胞株QBC939体外侵袭力的作用,可能导致胆管癌的神经浸润与转移。     

人血管生成素1真核表达载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的 探索构建人血管生成素1(human angiopoietin 1，hAng-1)真核表达载体，转染体外培养兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stemcells，MSCs)修复骨缺损的可能性。方法 基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hAng 1，经脂质体DOTAP介导质粒转染兔MSCs，G418筛选阳性克隆，RTPCR及免疫印迹杂交检测hAng-1 mRNA及蛋白表达。结果 重组真核表达载体pcDNA3-hAng-1经限制性内切酶Xho-I和BamH-I酶切后，电泳显示1．4kb hAng-1目的片段和5．4kb pcDNA3载体片段，转染兔MSCs后，RT-PCR检测出目的基因mRNA，免疫印迹杂交检出hAng-1的蛋白表达。结论 构建的真核表达载体pcDNA3-hAng-1能在转染的兔MSCs中表达，可以为组织工程骨修复奠定基础。     

人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。     

重组人BMP-7真核表达质粒的构建及转染软骨细胞后的表达

[目的]构建重组人骨形成蛋白-7（rhBMP-7）基因真核表达质粒，转染兔关节软骨细胞，探讨外源性人rhBMP-7基因在转染软骨细胞中的表达情况及对细胞生物学性状的影响。[方法]采用PCR技术扩增rhBMP-7基因，将其插入真核表达载体pcDNA3．1中，体外分离培养兔关节软骨细胞，然后用构建的rhBMP-7质粒转染软骨细胞，经G418筛选、免疫组化染色和逆转录PCR检测其表达，同时检测表达产物对维持软骨细胞表型的作用。[结果]经过PCR及酶切鉴定证实获得了BMP-7真核表达质粒pcDNA3．1-rhBMP-7，通过免疫组化染色和逆转录PCR鉴定证实rhBMP-7在转染后的软骨细胞中得到了表达，其表达产物促进软骨细胞表型的维持。[结论]外源性rhBMP-7基因转染软骨细胞可以获得高效表达，并具有一定的维持软骨细胞表型的作用，为软骨组织工程的研究提供了改良的种子细胞。     

人RhoC基因正、反义真核表达载体的构建及对肿瘤增殖的影响

目的构建人RhoC基因正、反义真核表达载体，研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株增殖的影响。方法应用分子克隆技术，用KpnⅠ和BamHⅠ双限制性内切酶从RhoC基因切下所需目的片段，然后将该片段正、反向定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1／Hyg（＋）上，构建正、反义RhoC cDNA真核表达载体，以脂质体转染人胆管癌QBC939细胞，检测细胞生长曲线。结果经测序鉴定，将正、反义目的片段成功的连接到pcDNA3.1／Hyg（＋）载体上。结果序列测定证实RhoC基因正、反义.真核表达载体成功构建，反义RhoC基因抑制QBC939细胞增殖，正义RhoC基因促进QBC939细胞增殖。结论成功地将RhoC目的片段正、反向插入到pcDNA3．1／Hyg（＋）中，构建了人RhoC正、反义表达真核载体，RhoC基因调控QBC939细胞增殖。     

人肿瘤MUC1/Y基因真核表达载体的构建及在BIU-87细胞中的表达

目的：克隆人肿瘤MUC1／Y全长基因及构建真核表达载体EGFP—MUC1／Y，并观察EGFP—MUC1／Y在BIU-87细胞中的表达，以进一步用于生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究。方法：取新鲜膀胱肿瘤组织，提取总RNA，采用随机引物进行逆转录，将特异引物扩增的MUC1／Y全长PCR产物克隆至真核表达载体pEGFP-C1，测序鉴定后命名为EGFP-MUC1／Y，用脂质体转染膀胱肿瘤细胞BIU87，以Western Blot检测其表达情况。结果：酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含人MUC1／Y全长cDNA编码序列，Western Blot检测和转染实验表明，构建的pEGFP-MUC1/Y基因在BIU-87真核细胞中表达，其绿色荧光蛋白瞬时表达率为20％。结论：人肿瘤MUC1／Y全长cDNA基因克隆及其真核表达载体pEGFP—MUC1／Y构建成功，可用于肿瘤生物学治疗的研究。     

胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗的构建和体外转染

目的 探索胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗的构建，以进一步研究对胰腺癌的治疗作用。方法 首先对VNTR编码基因进行了重组设计，氨基端插入人单核细胞趋化蛋白Ⅰ信号肽基因序列，起始码前插入KOZAK促真核翻译序列。将人工合成的重组人VNTR基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3，1／Myc-his（＋）A质粒的MCS中。将通过测序鉴定的含有准确插入序列的pcDNA3．1-VNTR／Myc-his（十）A重组质粒转染C087细胞，进行体外转染实验和Westernblot检测VNTR在细胞内外的表达。结果自转化平板筛选的阳性克隆通过测序鉴定，pcDNA3．1-VNTR／Myc-his（＋）A重组质粒含有完整的阅读框架和目的基因。重组质粒可在C087细胞内外表达VNTR，以胞内为主。所表达的VNTR分子量比人工合成的VNTR多肽大。结论 自行构建的胰腺癌MUC1-VNTR核酸疫苗序列准确，可在哺乳动物细胞中表达VNTR。     

DcR3反义RNA表达载体的构建及表达

目的：构建DcR3反义RNA表达载体PVAXI-as-DeR3，并研究其对肝癌细胞中DcR3蛋白表达的影响。方法：从肝癌组织中提取总RNA，RT-PCR法克隆出DcR3基因片段，将其与PMD18-T载体连接，经BamHⅠ、XholⅠ双酶切TA—DeR3及PVAXⅠ（-）真核表达载体后，使用T4DNA连接酶连接，构建反义DcR3表达载体。转染肝癌细胞株SMMC7721。Western blot法检测DeR3蛋白表达。结果：用RT-PCR方法从肝癌组织中扩增出DcR3片段，并经测序证实。重组质粒经酶切鉴定正确，转染肝癌细胞株SMMC7721后，经Western blot证实DcR3蛋白表达较对照组下降。结论：成功构建反义RNA表达载体PVAXⅠ-as-DcR3，构建的反义表达载体PVAXⅠ—as—DcR3具有阻断DcR3基因表达的效应。     

Smac基因诱导前列腺癌细胞凋亡的实验研究

目的：观察Smac基因对前列腺癌细胞凋亡的影响。方法：前列腺癌细胞株（PC-3）在含小牛血清的DMEM-F12培养基中培养、传代。通过脂质体介导将Smac基因导入前列腺癌细胞株，通过RT-PCR法检测SmacmRNA的表达，同时用SABC免疫组化法分析Smac的表达。采用细胞计数法检测细胞生长抑制率，流式细胞仪观察细胞凋亡情况。结果：转染Smac基因后，RT-PCR可检测出Smac的特异条带，SABC结果转染组Smae蛋白表达显著性增强，前列腺癌细胞的生长明显受抑制（P〈0．05）。细胞周期分析可见凋亡峰，凋亡率35．2％。结论：转入Smac基因可显著促进前列腺癌细胞细胞的凋亡。