中性红摄入法检测幽门螺杆菌空泡毒素活性

空泡变性细胞毒素 (ＶａｃＡ)是幽门螺杆菌 (Ｈ .ｐｙｌｏｒｉ)分泌的一种重要毒素 ,其相对分子质量 (Ｍｒ)约为 (87～ 95 )×10 3 ,最初发现该毒素与哺乳动物细胞共同孵育后可导致细胞内产生大量的空泡。既往多采用光学显微镜下直接计数空泡形成细胞的比例来评价ＶａｃＡ活性 ,我们采用中性红摄入法 (Ｎｅｕｔｒａｌｒｅｄｕｐ ｔａｋｅａｓｓａｙ ,ＮＲＵ)对Ｈｐ菌株ＶａｃＡ进行定量检测 ,评价该方法检测ＶａｃＡ活性的应用价值。标准Ｈｐ菌株ＣＣＵＧ17874经固体平皿培养后 ,混悬于布氏肉汤液体培养基中 ,置 37℃微需氧环境振荡培养 72…     

幽门螺杆菌空泡毒素基因克隆、表达及其重组蛋白免疫学特性的鉴定

已发现幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ ,Ｈｐ)疫苗具有预防和治疗Ｈｐ感染的效果〔1〕。大多数Ｈｐ菌株均能产生空泡毒素 (ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ,ｖａｃＡ) ,其前体蛋白在分泌过程中只有相对分子质量 (Ｍｒ)约87× 10 3的ＶａｃＡ被转运到细胞外 ,Ｍｒ 为 4× 10 3氨基末端信号肽和 5 0× 10 3羧基末端多肽分别留于细菌内、外膜中〔2〕。Ｈｐ感染者血清中可出现ＶａｃＡ抗体 ,重组ＶａｃＡ在ＨｐＳＳ1株小鼠感染模型中有 80 %的保护率〔3〕。我们构建了ｖａｃＡ原核表达系统 ,所表达的重组ＶａｃＡ…     

产空泡毒素幽门螺杆菌感染的临床意义

幽门螺杆菌 (Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡和萎缩性胃炎的重要病因之一 ,并与胃癌、胃淋巴瘤的发生密切相关 ,其中人群中的感染率超过 50 % ,目前已被世界卫生组织列为一级致癌因子〔1〕。Ｈｐ的致癌因子包括 :尿素酶、脂多糖、热休克蛋白、磷脂酶和空泡毒素 (ｖａｃｕｏ ｌａｔｉｎｇｃｙｔｏｔｏｘｉｎ ,ＶａｃＡ)等。其中ＶａｃＡ蛋白仅有部分菌株产生 ,可引起上皮细胞出现空泡样变及胃粘膜病变。为了解重庆地区ＨｐＶａｃＡ 株的感染与不同消化道疾病的关系 ,我们采用ＥＬＩＳＡ法和细…     

CagA+幽门螺杆菌滤液对胃上皮细胞GES1的作用及其机制

幽门螺杆菌 (Ｈｐ)的细胞毒素相关蛋白 (ＣａｇＡ)在胃癌发生中具有重要的作用〔1〕,然而 ,其发病机制尚不清楚。由于在Ｈｐ致胃癌发病过程中有引起癌基因活化及抑癌基因失活、细胞ＤＮＡ损伤及胃粘膜细胞的恶性转化等可能性 ,推测在Ｈｐ致胃癌过程中存在相应的基因改变。为了探讨Ｈｐ感染与胃癌发生的分子机制 ,我们研究ＣａｇＡ阳性 (ＣａｇＡ+ )的Ｈｐ培养滤液在体外对胃粘膜上皮细胞的作用 ,并采用经ＣａｇＡ+ Ｈｐ培养滤液诱导恶性转化的胃粘膜细胞 ,与ＣａｇＡ阴性 (ＣａｇＡ-)Ｈｐ培养滤液处理的胃粘膜细胞进行ｍＲＮＡ差异显示 ,以…     

云芝多糖增强巨噬细胞M-CSF的表达与分泌

为揭示云芝多糖作用与巨噬细胞Ｍ－ＣＳＦ表达与分泌的关系,采用活性测定、斑点杂交等方法,将云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞Ｍ－ＣＳＦ表达及分泌的影响进行了探讨。结果显示,腹腔注射云芝多糖可以提高小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中的Ｍ－ＣＳＦ活性,并使巨噬细胞Ｍ－ＣＳＦｍ ＲＮＡ的含量增加;应用ｍ ＲＮＡ 合成抑制剂及蛋白合成抑制剂的研究发现,ａｃｔｉｎｏｍ ｙｃｉｎ Ｄ及ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍ ｉｄｅ均能阻断云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞Ｍ－ＣＳＦｍ ＲＮＡ的诱导     

云芝多糖增强巨噬细胞M—CSF的表达与分泌

为揭示云芝多糖作用与巨噬细胞Ｍ－ＣＳＦ表达与分泌的关系,采用活性测定,斑点杂交等方法,将云芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞Ｍ－ＣＳＦ表达及分泌的影响进行了探讨。结果显示,腹腔注射云芝多糖可以提高小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中的Ｍ－ＣＳＦ活性,并使巨噬细胞Ｍ－ＣＳＦ ｍＲＮＡ的含量增加;应用ｍＲＮＡ合成抑制剂及蛋白合成抑制剂的研究发现,ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ及ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅｆ均能阻断云芝多糖对小     

氧氟沙星、叠氮胸苷单独及与干扰素合用对黄病毒增殖的影响

选用氧氟沙星 (ＯＦＬＸ)和叠氮胸苷(ＡＺＴ)单独投入及与ＩＦＮ并用 ,观察其抗病毒活性结果如下 :1　材料和方法1 1　病毒和细胞　所用黄病毒为乙型脑炎病毒ＪＥＶ的ＪａＧＡｒ - 0 1株。细胞是人肝癌细胞株ＨｅｐＧ2。细胞培养所用培养液为ＤＭＥＭ加 10 %胎牛血清 (ＦＣＳ)。1 2　感染病毒　病毒感染剂量为 10ｍ .ｏ.ｉ(ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎ) ,37℃吸附 6 0ｍｉｎ ,在 5 %ＣＯ2 孵箱中培养。将各种浓度的药物添加至含病毒的细胞培养液中 ,2 4ｈ后采取培养上清液 ,测定病毒的含量。1 3　病毒滴定　用空斑形成…     

幽门螺杆菌抗菌肽对消化道致病菌的杀伤作用

幽门螺杆菌 (Ｈｐ)可产生杀菌肽样抗菌多肽 (ｃｅｃｒｏｐｉｎ ｌｉｋｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐ ｔｉｄｅ ,Ｈｐ ＣＡＢＰ)。这种来源于Ｈｐ核糖体蛋白Ｌ1(ｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＬ1,ｒｐＬ1)的Ｎ 端肽 ,在结构与功能的许多方面与杀菌肽 (Ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ)相似。我们通过研究Ｈｐ源杀菌肽样抗菌肽Ｈｐ( 2 2 0 )对消化道常见致病菌的杀伤作用 ,探讨Ｈｐ产生抗菌肽的临床及流行病学意义。Ｈｐ( 2 2 0 )按ＨｐＲｐＬ1Ｎ 端第 2至第2 0位多肽序列人工合成。采用琼脂扩散法检测Ｈｐ( 2 2 0 )对消化道常见致病菌的抗菌…     

黄芪总皂甙对CVB_3感染心肌细胞cTnI、SERCA活性及mRNA表达的影响

目的 :探讨黄芪提取物 -黄芪总皂甙对柯萨奇Ｂ3(ＣＶＢ3)感染的培养ＳＤ乳鼠心肌细胞损伤模型的保护作用 ,对病毒引起的肌浆网钙泵 (Ｓａｒｃｏ/ＥｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍＣａ2 ＡＴＰａｓｅ,ＳＥＲＣＡ)活力及其ｍＲＮＡ表达变化的影响。方法 :将培养ＳＤ乳鼠心肌细胞分为正常组、模型组及黄芪组 ,模型组及黄芪组以柯萨奇Ｂ3亲心肌病毒株 (ＣＶＢ3ｍ,ＴＣＩＤ50 为 1 0 5 .83)感染心肌细胞。 72～ 96ｈ后 ,观察各组细胞病变作用 (ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆ ｆｅｃｔ,ＣＰＥ) ,检测其培养上清心肌肌钙蛋白Ｉ(ｃＴｎＩ)含…     

幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的分离纯化

在对Ｈｐ毒力因子进行的研究中 ,发现ＣａｇＡ基因是Ｈｐ高毒力株的标志基因。其编码产物 细胞毒素相关蛋白Ａ(ＣａｇＡ)是引起人类严重胃部疾患的主要因素之一 ,ＣａｇＡ基因并不存在于所有的Ｈｐ菌株中 ,在中国人中约有 90 %感染者含有此基因。该基因已被克隆和测序 ,含有ＣａｇＡ基因与不含ＣａｇＡ基因的菌株在致病能力上存在显著的差异。目前一致认为含ＣａｇＡ基因的Ｈｐ菌株为高毒株 ,与消化性溃疡 ,萎缩性胃炎及胃癌的发生密切相关。ＣａｇＡ蛋白位于细胞表面 ,是一种亲水性免疫显性蛋白 ,可刺激患者机体产生相应的ＩｇＧ和ＩｇＡ抗…     

Bcr/abl嵌合基因表达与慢粒白血病细胞积累

目的和方法 :ｂｃｒ/ａｂｌ嵌合基因是定位于人 9号染色体 9ｑ34上的ｃ -ａｂｌ基因和 2 2号染色体 2 2ｑ1 1上的ｂｃｒ基因因ｔ( 9:2 2 )易位 ,使相应断裂的基因发生融合所形成。它是ｐｈ染色体的分子基础 ,在慢粒白血病 (ＣＭＬ)发病中起重要作用。Ｂｃｒ/ａｂｌ嵌合基因编码具酪氨酸激酶活性的蛋白 (Ｐ2 1 0 )。这种蛋白与细胞信号传导蛋白相互作用 ,扰乱细胞信息传递过程 ,使ＣＭＬ细胞增殖和分化失控。为了探讨ｂｃｒ/ａｂｌ嵌合基因表达致慢粒白血病细胞积累的发病机制 ,设计并合成针对ｂｃｒ/ａｂｌ嵌合基因的反义寡脱氧核苷酸 (ａ …     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链抗体可变区基因的筛选与鉴定

非结构蛋白ＮＳ5Ａ是丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)编码的一种蛋白分子。我们利用重组的ＨＣＶ非结构蛋白ＮＳ5Ａ为包被抗原 ,从噬菌体抗体库中筛选出了结合活性较强的ＨＣＶＮＳ5Ａ人源单链噬菌体抗体 ,并对其进行了ＤＮＡ序列测定。本研究所用的ＨＣＶＮＳ5Ａ抗原为大肠杆菌表达的重组纯化抗原蛋白 ,以聚丙烯酰胺凝胶电泳 (ＰＡＧＥ)证实纯度在95 %以上。人噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ) 3 连接的半合成抗体文库。Ｍ13Ｋ0 7购于Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ,ＤＮＡ质粒提取纯化试剂盒购于Ｗｉｚａｒｄ公司。其…     

IFN-αAd3病毒诱导抗病毒蛋白MxA表达的研究

ＭｘＡ蛋白是一种干扰素 (ＩＦＮ)诱导的新型蛋白。本研究拟以不同诱导物诱导、从不同浓度、不同时间来探讨ＭｘＡ蛋白的表达。1　材料和方法1 1　材料　人胚肺ＷＩ 38细胞为本院基因室保存 ;ＰＢＭＣ来自苏州市中心血站健康成年人外周血 ;腺病毒 3型(Ａｄ3)为我院基因室保存 ,ＴＣＩＤ50 为 10 -5/ｍｌ;ＩＦＮ α 2ｂ为安徽安科生物高技术公司生产的安达芬 (10 0万ＩＵ/ｍｌ) ,批号 :980 918;山羊抗人ＭｘＡ蛋白多抗由Ｄｒ ＭＡ Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ(ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｏｒｅＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ…     

表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒伴随病毒的产生

来源于维多利亚水母 (Ａｅｑｕｏｒｅａｖｉｃ ｔｏｒｉａ)的绿色荧光蛋白 (ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＦＰ)是近年来发现的一种新的报告基因 ,由于其具有产生荧光不需任何底物或辅助因子、可以活体观察等特点 ,因此在目前的基因转移、基因治疗研究中得到了广泛的应用[1 ] 。重组腺病毒伴随病毒 (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ,ｒＡＡＶ)具有安全性好、可介导外源基因长期稳定表达等特点 ,是目前比较理想的基因治疗载体。构建表达ＧＦＰ的ｒＡＡＶ载体 (ｒＡＡＶ ＧＦＰ)对于…     

甲型肝炎病毒经猴体传代后核苷酸变异的研究

本实验室曾观察到 ,新捕获的野生短尾猴 (ＭａｃａｃａＴｉｂｅｔａｎａ)甲肝病毒(ＨＡＶ)抗体一般阴性 ,而人工饲养的猴则多为ＨＡＶ抗体阳性 ,说明人与猴可交叉感染。国内科学家的研究也已表明 ,产于我国的短尾猴是ＨＡＶ良好的动物模型 ,且来源丰富 ,现已广泛应用于ＨＡＶ的研究及疫苗检定。为探讨ＨＡＶ株经短尾猴传代后基因型变化及遗传变异情况 ,我们从杭州近郊甲肝病人的粪便提取物中 ,分离病毒株Ｇｋｍ ,并以 10 6ＴＣＩＤ50 / 0 5ｍｌ接种短作者单位 :31 0 0 1 3 ,浙江省医学科学院通信作者 :陈勇 ,31 0 0 1 3杭州 (Ｅ ｍａｉｌ:…     

血管平滑肌细胞增殖与迁移的机制研究

目的 :血管平滑肌细胞 (ＶＳＭＣｓ)增殖与迁移在动脉粥样硬化 (ＡＳ)的早期、中期或ＡＳ进展期或血管事件的发病机制中起着关键性作用。方法 :采用改良的Ｂｏｙｄｅｎ小室法检测ＶＳＭＣｓ的迁移效应 ;以ＭＴＴ法、[3Ｈ]-Ｔｄｒ掺入法、[3Ｈ]-脯氨酸标记法和ＶＳＭＣｓ计数评价ＶＳＭＣｓ的增殖效应 ;将培养的ＶＳＭＣｓ分为 5组 ;2 %胎牛血清 ( 2 %ＦＣＳ)组、ＡｎｇⅡ组 (其浓度为 1 0 - 1 0 ～ 1 0 - 6ｍｏｌ/Ｌ)、Ｌｏｓａｒｔａｎ组 (其浓度为 1 0 - 7～ 1 0 - 5ｍｏｌ/Ｌ)、ＭＣＰ - 1ｍｃＡｂ组 (终浓度为 1 0 μｇ/ｍＬ)和阳性对照…     

人巨细胞病毒单克隆抗体的研制检定和应用

采用人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＡＤ１６９株作为免疫原，制备出１３株鼠－鼠杂交瘤细胞系。对其中的６株进行了检定．免疫印迹试验结果表明：单克隆抗体（ＭｃＡｂ）７Ｂ４、７Ｄ７、７Ｅ１１、８Ｅ８和８Ｄ６相对应的ＨＣＭＶ多肽分子量分别为４６、１５０、３８、５１７２和６５ｋＤ．ＨＣＭＶ感染人胚肺二倍体细胞（２ＢＳ）后不同时间制成抗原片，与ＭｃＡｂ作间接免疫荧光试验。结果表明：ＭｃＡｂ８Ｂ８相应的病毒多肽为即刻早期抗原，其它５株ＭｃＡｂ相应的病毒多肽均为晚期抗原，６株ＭｃＡｂ等量混合后，标上辣根过氧化物酶，用于ＩｇＭ抗体捕获法ＥＬＩＳＡ（ＭａｃＥＬＩＳＡ）中，并与间接ＥＬＩＳＡ（ＩＥＬＩＳＡ）同时检测ＨＣＭＶ－ＩｇＭ．在未经选择的１００份脐带血中，两法均为阳性的３份，两法均为阴性的９４份；ＭａｃＥＬＩＳＡ阳性而ＩＥＬＩＳＡ阴性的２份血清的特异性试验证明，ＨＣＭＶ－ＩｇＭ确为阳性．ＩＥＬＩＳＡ阳性而ＭａｃＥＬＩＳＡ阴性的１份血清的特异性试验证明，它是由ＲＦ引起的假阳性。     

健康人外周血中CD8~+颗粒酶B~+T细胞亚群含有活化的和易于凋亡的细胞

有关健康人外周血淋巴细胞上颗粒酶存在的问题有一些争论的报道,此文的研究是应用针对人类天然ＧｒＢ的单克隆抗体分析了健康人Ｔ细胞中ＧｒＢ的表达,并分析了ＣＤ８＋ＧｒＢ＋Ｔ细胞亚群的表型及对自发凋亡和Ｆａｓ介导的凋亡的易感性。方法：从人类ＮＫＣ系ＹＴＩＮＤＹ中纯化的天然ＧｒＢ免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠制备ＩｇＧ１ＭｃＡｂＧｒＢ１１。经放免及ＥＬＩＳＡ分析此ＭｃＡｂ仅与ＧｒＢ特异性结合,以免疫细胞化学方法用此单克隆抗体检测健康人ＰＢＭＣ中的ＧｒＢ＋细胞。ＧｒＢ＋细胞表型的分析采用ＦＩＴＣ标记的针对不同淋巴…     

幽门螺杆菌诱导大鼠胃粘膜细胞分泌胃蛋白酶原

为研究幽门螺杆菌 (Ｈｐ)超声提取物对大鼠胃粘膜细胞系合成与分泌胃蛋白酶原的影响 ,大鼠胃粘膜细胞ＯＵＭＳ 37(34代 )在ＤＭＥＭ培养基中培养 3ｄ后细胞生长到紧密状态时 ,换以新鲜的培养基 ,加入Ｈｐ超声提取物或试剂后 ,采用酸变性法 ,按指定时间取培养上清及细胞裂解液测定胃蛋白酶原活力。结果显示 ,不同浓度的Ｈｐ超声提取物(10 0ｍｇ/Ｌ ,2 0 0ｍｇ/Ｌ ,40 0ｍｇ/Ｌ)对细胞存活无影响。Ｈｐ超声提取物可在 30ｍｉｎ～ 180ｍｉｎ内呈剂量依赖性地诱导大鼠胃细胞分泌胃蛋白酶原。ＤｉｂｕｔｙｒｙｌｃＡＭＰ显著诱导胃粘膜细胞分泌胃…     

preS2反义寡核苷酸降低端粒酶活性及诱导肝癌细胞凋亡的作用

反义核酸技术从分子水平破坏靶基因 ,已用于多种抗病毒的试验。我们以人工合成的硫代反义寡核苷酸研究针对ＨＢＶ不同区段反义寡核苷酸ＨＢＶ的抑制作用 ,从中筛选了效果最好的针对ＨＢＶｐｒｅＳ2的反义序列 (ａｓ ｐｒｅＳ2 )。为进一步探讨ａｓ ｐｒｅＳ2在肝癌治疗中的应用价值 ,以ＨＢＶＤＮＡ整合的肝母细胞瘤细胞ＨｅｐＧ2 .2 .15为研究对象 ,采用ＦＡＣ ＳＣＡＮ流式仪检测细胞凋亡率 ,ＴＲＡＰ银染测定细胞端粒酶活性 ,同时以ＲＩＡ法检测培养上清中的血清铁蛋白浓度。设计合成针对ｐｒｅ Ｓ2基因 (ｐｅｒ Ｓ2 )翻译起始区 (32 0 3…