SOCS3基因转染对低氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的　探讨SOCS3基因对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMCs)增殖的影响。方法　以脂质体为载体将pEFSOCS3和pSV2neo共转染至体外培养的PASMCs ,应用RT PCR和免疫细胞化学法测定转染前后细胞中SOCS3mRNA和蛋白表达。低氧处理PASMCs ,采用Westernblot法检测转染前后常氧 (N)、低氧 6h(H6)、低氧 12h(H12 )PASMCs中STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平变化 ;流式细胞仪、3 H TdR掺入法检测转染前后各时相点细胞增殖情况。结果　RT PCR和免疫细胞化学证实转染后细胞中有SOCS3mRNA和蛋白稳定表达 ;与同时相对照组 (包括未转染组和转染空载体组 )相比 ,SOCS3基因转染组细胞中STAT3蛋白酪氨酸磷酸化水平显著下降 (P <0 0 1) ;流式细胞仪分析显示SOCS3基因转染组细胞各时相点G0 /G1期细胞比例显著增多 (P <0 0 1) ,S G2 /M期细胞比例显著减少 (P <0 0 1) ;SOCS3基因转染组细胞在常氧和低氧条件下 3 H TdR掺入量显著低于同时相点对照组细胞 (P <0 0 1)。结论　SOCS3蛋白可能通过降低STAT3酪氨酸磷酸化水平抑制PASMCs增殖。     

canstatin基因在体外培养血管内皮细胞中的表达及其意义

目的 探讨canstatin基因通过电穿孔法在体外培养人脐静脉内皮细胞中的表达及对其生长与凋亡的影响.方法 将canstatin基因通过电穿孔法转染人脐静脉内皮细胞HUV-ECC,行G418筛选获得转基因细胞克隆.用RT-PCR检测canstatin在转基因细胞mRNA中的表达,以流式细胞仪分析细胞周期,并比较转基因和未转基因细胞的生长特性.结果 检测到canstatin在转染人脐静脉内皮细胞中的表达,canstatin基因转染内皮细胞组的凋亡率(16.90%)高于空载体组(1.47%)和亲代细胞组(2.85%)(P＜0.01),转染细胞生长明显受抑.结论 canstatin能特异地抑制血管内皮细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

糖原分支酶基因体外增强淡色库蚊抗药性的研究

目的构建淡色库蚊糖原分支酶基因(GBE)的昆虫表达载体,通过细胞转染法鉴定其与蚊虫抗药性相关的关系。方法用基因重组方法构建GBE的昆虫表达载体;通过脂质体转染法将昆虫表达载体转入伊蚊C6/36细胞,继而通过观察细胞形态及3H TdR掺入法检测稳定表达GBE基因的细胞对溴氰菊酯杀虫剂的敏感性。结果成功构建GBE基因的昆虫表达载体同时通过筛选获得稳定表达该基因的细胞株。3H TdR掺入法结果显示转染GBE基因能够提高细胞的存活率,并与对照组差异有显著性(P<0.05)。结论 GBE基因在与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关,且其在细胞对抗溴氰菊酯的毒性作用中有保护作用。     

人血管生成抑制因子canstatin原核表达载体的构建及表达

目的：构建国人血管生成抑制因子canstatin的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中表达canstatin重组蛋白。方法：用Trizol试剂提取人肝脏组织总RNA,通过RT—PCR扩增canstatin的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将canstatin cDNA定向克隆于原核表达载体pET30a( )中,而后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达。结果：canstatin cDNA克隆人质粒pET30a( )获得了重组表达载体pET30a( )／Cans,canstatin的cDNA长度为684bp．编码227个氨基酸。IPTG诱导原核表达载体pET30a( )／Cans在大肠杆菌BL21中的表达量约占菌体总蛋白量的35％。结论：原核表达载体pET30a( )／hCans存大肠杆菌BL21中高效表达canstatin重组蛋白。     

重组凋亡素真核表达载体诱导人卵巢癌细胞凋亡

目的 观察凋亡素基因（VP3）在卵巢癌细胞株CoCl中诱导凋亡的情况。方法 用Kpn Ⅰ、Xba Ⅰ分别双酶切pMD18-CAVP3和pcDNA3．1（＋），分别回收365bp和5．0kb大小的片断，然后常规行连接反应，构建重组凋亡素真核表达栽体pcDNA3．1-VP3。采用Lipofectamine^TM 2000介导的基因转染法，在体外将pcDNA3．1-VP3转染入卵巢癌细胞株CoCl中，RT—PCR检测凋亡素在细胞中的表达，用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 酶切鉴定及测序结果表明重组凋亡素真核表达载体pcDNA3．1-VP3构建成功。RT—PCR证实VP3基因在COCl中存在并在转录水平表达。转染pcDNA3．1-VP3细胞凋亡率明显高于转染空质粒组（P〈0．01）。结论 凋亡素可有效诱导卵巢癌细胞COCl凋亡。     

核糖体蛋白L39-L在肺癌1549细胞耐药机制中的作用

目的探讨核糖体蛋白L39-L在肺癌A549细胞对阿霉素类药物耐药机制中的作用。方法以体外培养的阿霉素耐药和敏感人肺癌A549细胞株，啊z01法提取总RNA，LightCyclerRNA扩增法进行荧光定量RT-PCR，检测阿霉素耐药A549细胞株、敏感细胞株之间的RPL39--L基因表达差异。经对人肺癌A549敏感细胞株体外培养、稳定转染RPL39-L基因后，3H—TdR掺人法进行生存率检测分析核糖体蛋白L39-L转染A549细胞、载体转染A549细胞和空细胞株对阿霉素的耐药性差异。结果荧光定量RT-PCR结果显示，耐药性人肺癌A549细胞株比敏感的A549细胞核糖体蛋白L39-L转录水平高7．3倍。1H1TdR掺入测定生存率显示，与质粒载体转染细胞或空细胞相比，转染核糖体蛋白L39-L的细胞表现出增强的阿霉素耐药性。结论核糖体蛋白L39-L基因可育旨在肺癌A549细胞的耐药机制形成机制中有作用。     

PTTG1基因上调表达对A549细胞增殖和凋亡的影响

目的研究人垂体瘤转化基因1(human pituitary tumor transforming gene 1,PTTG1)上调表达对肺腺癌细胞株(A549)增殖和凋亡的影响.方法构建含PTTG1基因的真核表达载体,脂质体法转染A549细胞并用G418筛选出高表达的阳性克隆株,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitation PCR)和免疫细胞化学(immunocytochemical assay,ICA)分别检测PTTG1 mRNA及蛋白表达的改变,3H胸腺嘧啶核甙(3H-TdR)掺入法检测细胞增殖活性,AnnexinⅤ异硫氢酸荧光素(FITC)试剂盒检测凋亡情况.结果成功构建含PTTG1基因的真核表达载体,获得上调表达PTTG1的A549细胞,转染含PTTG1基因重组质粒的A549细胞增殖活性较未转染组细胞及转染空白质粒组细胞均显著增强(P＜0.05);3组细胞间的凋亡率无显著差异.结论PTTG1基因能显著促进A549细胞的增殖,而对细胞凋亡没有影响.     

核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性及细胞增殖的作用

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ ’交换器-1表达和活性、pHi的影响，及其与细胞增殖的关系.方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达、PHi、pHi恢复速率、^22Na摄取量和^3H—TdR掺入量变化.结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE—1 mRNA表达、^22Na摄取量减少，同时伴有pHi降低、pHi恢复速率下降和^3H—TdR掺入量减少。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE—1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。     

人金属硫蛋白1H基因对肺腺癌细胞A549耐药性的影响

目的：探讨金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因对人肺腺癌A549细胞耐药性的影响．方法：构建真核表达载体pcDNA3．1（-）-MT1H,利用脂质体介导将其转染肺腺癌A549细胞,G418筛选阳性克隆．分别以RT—PCR和Western方法检测MTIH mRNA和蛋白表达情况,MTT法检测细胞对顺铂的药物敏感性;流式细胞仪（FCM）检测顺铂诱导细胞凋亡率．结果：转染pcDNA3．1（-）-MT1H的细胞,其MT1H mRNA和蛋白表达水平显著高于亲本细胞及转染空载体细胞,细胞对顺铂药物敏感性明显下降,顺铂诱导的凋亡率明显降低．结论：MT1H能促进A549细胞耐药,可能和降低顺铂诱导细胞凋亡有关．     

双特异性磷酸酶-1过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭的影响

目的：构建携带人双特异性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1,DUSP-1)基因的过表达慢病毒载体并包装病毒,感染人肾癌细胞株A498后观察DUSP-1的过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭能力的影响。方法从pCMV6-XL5-DUSP-1质粒上获得目的基因片段,采用DNA重组技术将DUSP-1基因插入到慢病毒表达载体质粒Plv-EGFP(2A)Puro中,获得重组plv-EGFP(2A)Puro-DUSP-1载体。重组慢病毒表达质粒及辅助包装质粒pH1、pH2共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒上清并感染肾癌细胞株A498,利用Western blot检测细胞DUSP-1蛋白的表达情况。用MTS法检测细胞增殖能力的变化,Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果成功构建携带DUSP-1过表达载体。包装病毒后成功感染A498细胞株,DUSP-1蛋白表达较对照A498细胞株显著上调。重组质粒组细胞在490 nm吸光值明显上升(P＜0.05);细胞侵袭试验中,重组质粒组的穿膜细胞数明显高于空载体组(P＜0.05)。结论成功构建了人DUSP-1基因的重组慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1,进行病毒包装后成功培养稳定高表达DUSP-1基因的肾癌细胞株;DUSP-1基因的过表达具有促进肾癌细胞株A498增殖和侵袭的作用。     

辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL的构建及其对肿瘤细胞的体外诱导凋亡作用

目的：构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（hTRAIL）基因的辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL,并研究其在人肺腺癌细胞株A549中的表达及促凋亡作用。 方法：采用常规分子生物学方法构建表达质粒pEgr-hTRAIL,体外通过脂质体转染A549细胞,经G418筛选稳定转染细胞A549-shTRAIL,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测目的基因的表达,采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡。 结果：经限制性内切酶酶切鉴定pEgr-hTRAIL表达质粒构建正确;稳定转染细胞A549-shTRAIL的hTRAIL mRNA表达量明显增加;稳定转染细胞A549-shTRAIL的凋亡细胞百分数明显增加,是A549细胞的1.8倍（P<0.05）。 结论：成功构建pEgr-hTRAIL表达质粒,体外稳定转染细胞A549-shTRAIL具有明显诱导凋亡作用。     

人canstatin基因的克隆、表达、纯化及其生物活性测定

目的:克隆人Canstatin cDNA,在E.coli中融合表达和纯化,并测定表达产物抑制新生血管生成活性.方法:从中国人胎盘组织提取总RNA,RT-PCR扩增出Canstatin cDNA,克隆入pTYB1载体中并测序,构建原核表达载体pTYB1-hCAN,IPTG诱导表达,几丁质亲和纯化,鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验进行活性测定.结果:RT-PCR产物约为700bp,测序结果与文献报道序列一致.构建了人Canstatin原核表达载体vTYB1-hCAN,在大肠杆菌中表达.纯化的融合蛋白在CAM实验中能明显抑制血管生成.结论:克隆、表达了具有生物学活性的人canstatin蛋白.     

中国人Canstatin基因的克隆

目的Canstatin是新近发现的血管生成抑制剂,具有很强的抑制肿瘤血管生成的功能,本研究拟克隆和鉴定中国人的Canstatin基因,为进一步研究Canstatm基因的功能奠定基础.方法用RT-PCT法从中国人肝组织中获得Canstatin的cD-NA,克隆到pCMV-Script载体中测序,并在GenBank中进行同源性分析.结果成功克隆了Canstatin基因cDNA编码序列并获得测序证实.结论中国人Canstatin基因编码序列,经同源性分析与国外文献报道序列一致,初步证明该基因可能属于人类基因中序列保守的基因.     

靶向IGF-1R的siRNA增强肺癌细胞对Trail诱导凋亡敏感性的研究

目的 研究IGF-1R特异RNA干扰后肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的改变以及其对Trail的敏感性。 方法 化学合成IGF-1R特异siRNA转录模板,与表达载体连接,转染大肠杆菌扩增后提取质粒,酶切鉴定和DNA测序分析。转染A549细胞后筛选稳定表达IGF-1R-siRNA细胞株,FQ RT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测IGF-1R基因表达。MTT法和流式细胞仪测定Trail作用前后转染和非转染A549细胞增殖活性和凋亡率。 结果 成功构建IGF-1R-siRNA表达载体并筛选出稳定表达IGF-1R-siRNA单克隆细胞。和空白对照相比IGF-1R蛋白和IGF-1RmRNA表达分别下降79.01%(0.17±0.06 vs.0.81±0.15)(P＜0.01)和76.05%(1.36±0.26 vs.5.68±0.45)(P＜0.01)。免疫组织化学显示IGF-1R表达降低。Trail作用于IGF-1R-siRNA的A549,细胞增殖速度降低(P＜0.05);凋亡率明显增加(P＜0.01)。 结论 IGF-1R-siRNA表达载体具有RNA干扰作用。IGF-1R表达下降后A549细胞增殖速度减慢,对Trail诱导的细胞凋亡敏感性增加。      

转染血管紧张素Ⅱ受体反义核苷酸对心肌细胞生长的作用

目的：评价转染AT1反义核苷酸（AT1A）对心肌细胞血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）受体亚型mRNA表达,及蛋白质和核酸合成的作用。方法：RT-PCR克隆AT1 cDNA序列（476bp),将克隆的AT1 cDNA反向插入PcDNA3.1(5.4kb),构建一完整的含AT1A的质粒（PAT1A）,并转染入培养的心肌细胞,RT-PCR和免疫印迹鉴定其转染后AT1 mRNA和蛋白表达。比较AngⅡ10^-7 mol/L刺激24h后的转染及非转染的心肌细胞AT1及AT2 mRNA表达（RT-PCR）、蛋白质和核酸合成（^3H-Leu及^3H-TdR掺入量）。结果：成功构建PAT1A。转染心肌细胞AT1mRNA和蛋白表达量显著减少,与正常对照心肌细胞相比差异有非常显著性（P＜0.01)。AngⅡ10^-7mol/L刺激24h后,与非转梁心肌细胞相比,转染组AT1 mRNA表达明显减少,AT2 mRNA表达明显增加（P＜0.01),但两组间^3H-Leu及^3H-TdR掺入量差异均无显著性（P＞0.05)。结论：经AT1A封闭后,心肌细胞AT1mRNA表达显著抑制,同时AT2 mRNA上调。单纯封闭AT1mRNA并不能有效阻断AngⅡ介导的心肌细胞生长。     

反义寡核苷酸抑制MMP7基因表达对肺腺癌A549细胞凋亡敏感性影响的研究

目的观察基质溶解素(matrilysin,MMP7)反义寡核苷酸(antisense ligodeoxynucleotide,ASODN)对肺腺癌A549细胞凋亡敏感性的影响。方法采用硫代磷酸修饰的MMP7ASODN,通过脂质体导入A549细胞后,RT-PCR检测MMP7 ASODN对MMP7 mRNA表达的影响;流式细胞仪检测其对细胞膜Fas抗原表达率的影响;加入重组FasL,诱导凋亡,流式细胞仪检测凋亡率。结果RT-PCR结果表明,MMP7 ASODN转染能显著抑制A549细胞MMP7 mRNA表达。流式细胞仪检测表明,MMP7ASODN转染A549细胞后,与未转染组和错义寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide,SCODN)组比较,细胞膜Fas蛋白表达率增高,有显著性差异(P<0.01)。加入重组FasL,诱导细胞凋亡,细胞凋亡率明显增高,与未转染组和SCODN组有显著性差异(P<0.01)。结论MMP7ASODN可以抑制肺腺癌A549细胞株MMP7基因的表达,上调细胞膜Fas抗原表达,增强A549细胞凋亡敏感性。     

靶向siRNA沉默Akt1基因表达及其对肺癌培养基促内皮细胞迁移的抑制作用

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对血管内皮细胞Akt1基因表达的沉默作用及其对肺癌A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的影响。方法:以人脐静脉内皮细胞为靶细胞,设计针对Akt1基因mRNA的siRNA(siAkt1),利用阳离子脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞,采用半定量PCR技术(RT-PCR)检测Akt1mRNA的表达,用Western blotting技术检测Akt总蛋白表达。同时用体外"伤口愈合"实验观察细胞迁移。结果:筛选出的siAkt1能显著抑制内皮细胞Akt1mRNA(P<0.01)和Akt总蛋白的表达(P<0.05),A549细胞条件培养基显著促进人脐静脉内皮细胞迁移(P<0.05),但对转染siAkt1的人脐静脉内皮细胞迁移没有促进作用(P>0.05)。结论:特异性siRNA通过有效抑制Akt1基因的表达而抑制A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的作用,这为肺癌血管生成干预治疗提供了新的理论基础。