肽核酸的细胞传递

肽核酸(PNA)是第三代反义和反基因药物的代表.它是具有类多肽骨架的DNA类似物,在生物环境中非常稳定,与互补RNA和DNA有高度亲和性.PNA的细胞传递较差,限制了其作为基因表达调控剂的发展.目前已发展多种PNA的细胞传递方法,包括微注射法、电致孔、与DNA共转染、与脂溶性基团结合、与肽结合等.PNA在DNA细胞传递中有协同作用.     

肽核酸在疾病诊疗和分子生物学研究中的应用

肽核酸是一种新型的以多肽为骨架，类似核苷酸且不带电荷的物质。肽核酸在疾病诊疗和分子生物学研究中的反义药物、反基因药物、探针、PCR技术等方面有广泛应用。     

第三代反义核酸技术——肽核酸

肽核酸是一种人工合成的DNA分子的类似物,被称之为第三代反义核酸,是目前反义核酸技术领域研究的前沿和热点.本文简要叙述了肽核酸的分子结构、理化性质和杂交特性以及肽核酸在基因表达调控、分子生物学实验研究和疾病基因治疗研究等方面的应用情况.     

抗病毒基因治疗

基因治疗是将治疗性基因导人到发生病变的细胞内，以替补突变基因的功能，或封闭异常基因表达的治疗方法。抗病毒基因治疗可以概括为两个方面：细胞内免疫和基因免疫技术。     

亨廷顿病基因治疗的进展与挑战

亨廷顿病是一种常染色体显性遗传病,基因治疗是控制病情进展甚至实现根治的有效手段。随着反义核苷酸疗法在亨廷顿病基因治疗中获得初步成功,针对基因组水平及mRNA水平的各项技术也正在积极开发、改良,在不久的将来相继开展临床试验。本文围绕亨廷顿病基因治疗的现状、发展方向及临床挑战,开展相关研究状况的综述。     

肽核酸相关技术在疾病诊断与治疗方面的应用

肽核酸(peptide nucleic acid;PNA)是一类不带电荷的类似于肽链的骨架结构,携带有碱基的新信息分子,该分子主链骨架是由单体N-(2-氨乙基)-甘氨酸间通过酰胺键反复连接而成的长链,侧链则是利用亚甲羰酰键将碱基与主链骨架相连而形成。PNA分子不含戊糖和磷酸基,故呈电中性,此电中性的存在赋予了其许多DNA或DNA类似物所不具有的性质,如高灵敏度、高特异性、非盐依赖性、高稳定性等,使PNA分子作为一种优良     

反义肽核酸对树突状细胞CD86表达的抑制作用

目的 探讨CD86mRNA反义肽核酸（peptide nucleic acid,PNA)阻断树突状细胞CD86表达和第二信号传递的可能作用。方法 采用激光共聚焦显微镜研究生物素化PNA的细胞内化；利用流式细胞术，荧光细胞组织化学以及RT-PCR研究CD86反义PNA对CD86分子表达的抑制作用，结果 （1）激光共聚焦显微镜光学细胞切片证明，培养的人未成熟树突状细胞能够有效内化生物素化PNA。（2）流式细胞术和荧光细胞组织化学证实CD86反义PNA在蛋白质水平上对CD86分子表达有抑制作用。（3）RT-PCR证明反义PNA能够抑制DCCD86mRNA水平。结论 CD86反义PNA能够抑制人树突状细胞CD86mRNA的表达，从而为进一步利用反义PNA阻断第二信号传递，诱导免疫耐受奠定了基础。     

人脑胶质瘤基因治疗现状

基因治疗为脑胶质瘤的治疗带来了新的希望。本文介绍基因治疗的载体、策略及现状，重点介绍反义核酸治疗状况。提供高效、特异的靶向性载体，研制更有效的基因治疗策略，成为今后基因治疗的发展方向。     

反义肽核酸对树突状细胞CD86表达的抑制作用

目的　探讨 CD86 m RNA反义肽核酸 (peptide nucleic acid,PNA)阻断树突状细胞 CD86表达和第二信号传递的可能作用。方法　采用激光共聚焦显微镜研究生物素化 PNA的细胞内化 ;利用流式细胞术、荧光细胞组织化学以及 RT- PCR研究 CD86反义 PNA对 CD86分子表达的抑制作用。结果　 1激光共聚焦显微镜光学细胞切片证明 ,培养的人未成熟树突状细胞能够有效内化生物素化 PNA。 2流式细胞术和荧光细胞组织化学证实 CD86反义 PNA在蛋白质水平上对 CD86分子表达有抑制作用。 3RT- PCR证明反义 PNA能够抑制 DC CD86m RNA水平。结论　 CD86反义 PNA能够抑制人树突状细胞 CD86 m RNA的表达 ,从而为进一步利用反义 PNA阻断第二信号传递 ,诱导免疫耐受奠定了基础     

亨廷顿病基因治疗的进展

亨廷顿病是一种常染色体显性遗传病,近年来多项针对mRNA水平的干预策略相继开展临床试验,同时随着聚集的规律性间隔短回文重复序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR关联基因（CRISPR associated gene,Cas）系统的日渐成熟,针对致病基因组的基因编辑策略也屡有报道。本文将围绕亨廷顿病基因治疗的临床现状、研究进展、临床评估的改进做简要综述。     

离子浓度对肽核酸压电基因传感器杂交效应的影响

目的　探索不同离子浓度的PBS缓冲液对肽核酸压电基因传感器阵列杂交效应的影响。方法　压电基因传感器阵列表面固定上 1 .5 μM的bis PNA探针后 ,分别观察在 1 0、2 0、5 0、1 0 0mM的PBS缓冲液环境中与相应的靶序列杂交 ,记录频率的下降值及反应所需的时间。结果　钠离子浓度从 1 0mM增加至 2 0mM时 ,杂交导致的频率下降值及平衡时间均增加 (P <0 .0 5 ) ;从 2 0mM增加至 5 0、1 0 0mM时 ,杂交导致的频率下降值各组间无显著差异 ,但杂交平衡时间却呈倍数增长。结论　离子浓度极大地影响了杂交反应的时间 ,低盐离子浓度更有利于提高bis PNA和dsDNA的杂交速率 ,高盐离子浓度则会大大降低bis PNA的结合速率。     

~(188)Re标记反基因肽核酸的方法学研究

目的研究^188Re标记反基因肽核酸（AGPNA）的方法及标记物与胰腺癌Patu8988细胞结合内化的特性。方法用^188Re直接标记经修饰的AGPNA,改变标记条件摸索标记方法,在不同时间点（15min-6h）测定标记率;测定标记物加入人血清和生理盐水后不同时间点（15min-24h）的放化纯度;进行胰腺癌Patu8988细胞摄取^188Re-AGPNA的内化实验。结果当标记条件为100μlSnCl2&#183;2H2O（20mg/ml）和20μlAGPNA（2mg/ml）时,^188Re-AGPNA的标记率最高可达（89.99&#177;0.15）%,放射性胶体含量为（9.40&#177;0.55）%。标记物加入血清24h后放化纯度为（89.14&#177;0.63）%。^188Re-AGPNA转染胰腺癌Patu8988细胞的最高细胞结合率为（38.16&#177;2.17）%,最高核内化率为（22.41&#177;0.86）%。结论^188Re直接标记经修饰的反基因肽核酸方法简便、标记率较高,能与胰腺癌细胞结合并转染入细胞核。     

大鼠骨髓增生异常综合征基因治疗及其机制研究

目的 应用反基因V-erbB寡核苷酸(ODN)产品对大鼠骨髓增生异常综合征(MDS)动物模型进行基因治疗,观察其疗效和可能的毒性反应. 方法 尾静脉注射或口服治疗.对42只动物应用不同给药方法和剂最进行治疗.(1)尾静脉注射给药,以常规剂量(D)0.56mg/kg和0.5×D两个剂量对17只大鼠MDS进行治疗.并以8只未经任何治疗的MDS为对照.在2～3个月的观察期,17只大鼠MDS均有骨髓原始和早幼粒细胞百分比(%)的下降,其中,94.1%(16/17)大鼠骨髓象恢复正常或接近正常;对照组8只MDS,3只从RA发展为RAEB.4只死于内脏出血,未见逆转为正常者.(2)口服用药14只动物,分别以1×D、0.5×D和0.25×D 3种不同剂量. 结果 仅1×D有效,其余2种剂量均无效.(3)将反基因V-erbB寡核苷酸与CpG寡核苷酸联合应用,对MDS、AEL和AML进行尾静脉注射治疗,发现此2种寡核甘酸治疗,显效时间明显缩短.但上述方案仅对MDS和AEL有效,而对AML则无效.(4)疗效原理研究证明,反基因V-erbB ODN能抑制大鼠MDS中白血病的发展,而中心错配的反基因V-erbB ODN和正基因V-erbB ODN则不能. 结论 在0.56mg/kg剂量下,此产品对大鼠MDS,不论静脉注射或口服用药均有明显的疗效,且毒性不显.治疗恢复期间大鼠平均体重增加98g且生育能力完好,说明此产品具有临床应用价值;反基因v-erbB ODN通过形成巩固三链DNA结构,抑制内源性V-erbB表达和扩增,从而显示疗效.     

慢性病毒性肝炎的基因治疗研究现状

基因治疗就是将有功能的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治疗方法.即将有功能的目的基因导入靶细胞后,与宿主细胞内的基因发生整合,成为宿主细胞遗传物质的一部分.目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用[1].慢性病毒性肝炎主要包括慢性乙型肝炎(HBV)和慢性丙型肝炎(HCV).既往以抗病毒、药物保护肝功能和防止病情恶化为主,但疗效欠佳.而基因治疗从根本上抑制病毒复制,彻底消除病毒,为慢性病毒性肝炎治疗提供了新的思路.     

反义肽核酸阻抑线粒体基因表达诱导肺癌SPC细胞凋亡的实验研究

目的:探讨以反义肽核酸(Anti-sense peptide nucleic acid,asPNA)封闭肺癌SPC-A1细胞线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)转录启动子后,对其生物学特性的影响.方法:合成针对mtDNA重链转录启动子区的asPNA,构建asPNA-三苯磷复合物并鉴定,以该复合物转染人肺腺癌SPC-A1细胞系.激光共聚焦显微镜确定该复合物的亚细胞定位,RT-PCR检测转染48h后对mtDNA编码基因转录的影响,流式细胞术评估细胞周期分布及凋亡/坏死情况,自发光荧光仪检测细胞内ATP浓度,以未转染asPNA-三苯磷复合物的肺腺癌SPC-A1细胞为对照.结果:成功获得asPNA-三苯磷复合物,激光共聚焦显微镜显示该复合物顺利进入SPC-A1细胞线粒体;同未转染组相比,转染组SPC-A1细胞mtDNA编码基因的转录水平有所下降,而细胞内ATP浓度明显降低(P＜0.01);同时,细胞周期分析显示,转染组出现明显的亚二倍体峰,而Annexin V-PI双标结果进一步证实,转染组肺癌细胞凋亡率明显增加.结论:asPNA在电子移位亲脂性阳离子-三苯磷的运载下,能够进入SPC-A1细胞线粒体并阻抑其mtDNA编码基因的转录,进而影响肺癌细胞的能量合成并诱导其凋亡.     

反义肽核酸抑制树突细胞趋化因子受体CCR7表达的实验研究

目的探讨靶向趋化因子受体CCR7的反义肽核酸(PNA)对树突细胞(DCs)CCR7的表达及趋化活性的影响。方法体外培养大鼠骨髓来源DCs,设计靶向CCR7mRNA翻译起始区的反义PNA,以随机PNA、空白组为对照处理体外培养7d的DCs,分别于24h,48h,72h后收集细胞,利用Western-blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测反义PNA对CCR7分子表达的影响,通过趋化实验检测DCs的趋化活性。结果DCs经PNA处理后24h,各组DCs其CCR7表达无明显差别,在48h,Western-blot检测显示反义PNA组CCR7蛋白表达明显低于对照组,而RT-PCR检测在mRNA水平却无明显差别。在72h,反义PNA组CCR7的表达在不同水平均明显低于对照组。经趋化实验证实,在48h以后反义PNA组DCs趋化活性受到明显抑制(P<0.05)。结论CCR7反义PNA能够有效抑制体外培养的大鼠树突细胞趋化因子受体CCR7的表达及其趋化活性,为进一步研究体内应用反义PNA抑制DCs的定向迁移和抗原递呈,调节免疫反应和诱导免疫耐受提供了新的策略。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肿瘤基因治疗中的应用

胸苷激酶基因在细菌和哺乳动物细胞中都存在，但只有病毒的胸苷激酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶才能使更昔洛伟(ganciclovir，GCV)等核苷类似物磷酸化，磷酸化的核苷类似物干扰DNA的合成而中止细胞的复制，尤其在肿瘤细胞中。在近10年，人们利用HSV—tk基因通过病毒载体转染多种肿瘤细胞，然后给予更昔洛伟(GCV)或阿昔洛伟(acyclovir，ACV)，在体外、体内试验对肿瘤细胞的杀伤作用都很明显。另外HSV—tk／GCV系统在抗肿瘤作用中有“旁观”效应，即转染有HSV-tk基因的靶细胞与未转染的HSV-tk基因的靶细胞同样可被GCV杀伤。由于HSV—tk／GCV系统的抗肿瘤作用效果明显，安全性好，越来越多的肿瘤患志愿接受实验，该系统已获准临床实验。本综述了近10年来HSV-tk／GCV系统在抗肿瘤治疗探索中的应用，大量资料显示HSV—tk基因用于抗肿瘤治疗将是本世纪的重要方法。