丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒 X蛋白协同反式激活作用的研究

构建丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）的重组表达质粒pcDNA3.1(－）-NS3和表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(－）-X，分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，用免疫印记（Western blotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT 3-promoter共转染HepG2细胞，检测报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达水平，酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子功能的影响。结果显示，两个重组表达载体pcDNA3.1(－）-NS3及pcDNA3.1（－）-X在HepG2细胞均以瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白；单独共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3.1(－）-X组的CAT的表达分别是对照的3．6倍和4．4倍，两种质粒共同转染时酶的表达是对照的8．5倍；表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明，HepG2细胞中表达的HCV NS3蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子的功能，并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染，尤其是共同感染的致病（癌）机制。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增HBV X基因,克隆至真核表达载体pVR1012中,构建HBV X基因重组表达载体pVR102-X;以该质粒转染HepG2细胞,酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞X蛋白的瞬时表达,与报告质粒pSV-lacZ共转染H G2爱细胞,用试剂盒法检测β-半乳糖苷酶表达活性。结果质粒pVR102-X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白,共转染实验中pVR102-X组β-半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的3．2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表,并能够反式激活SV40病毒早期启动子。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCV NSSA表达质粒pcDNA3．1(-)-NSSA转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中有新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为1572nt,编码产物由524aa组成,并测序证实,命名为NS5ATP3,在GentBank中注册,注册号为AF529364。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HCV NSSA反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因

应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa I酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到233个白色克隆,进行菌落PCR分析,其中213个均得到100～1000bp插入片段。挑取63个插入片段测序分析,其中6个cDNA片段为未知序列,通过生物信息学分析获得其全长序列,已被GenBank收录。提示6个新的cDNA全长序列,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。     

丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)反式激活的新型靶基因。方法 以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。分析筛选出来的基因,其中之一与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索比对及电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染pcDNA3．1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以RT-PCR技术扩增获得该新基因的全长序列,并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果该新基因的编码序列全长为2001nt,编码产物由667aa组成,并测序证实,命名为TAHCCP1,在GenBank中注册,注册号为AY038359。结论 发现并鉴定、克隆了HCV核心蛋白反式激活作用的新型靶基因TAHCCP1,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5B结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

目前认为丙型肝炎病毒 (HCV)的非结构蛋白 5B(NS5B)是病毒复制酶 ,但是对其生物学特性还不十分清楚 ,我们应用酵母双杂交系统 3,构建NS5B诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合 ,于涂有X α gal营养缺陷型培养基(SD/ Trp Leu His Ade)上筛选生长。挑选蓝色克隆 ,筛选出 33个与NS5B特异性相互作用的克隆 ,其中有 31个已知功能基因及 2个未知功能基因。所克隆到的基因对以后研究NS5B的功能有一定的提示作用 ,并为研究这些能与NS5B相互作用的基因在肝细胞中的生理功能奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选克隆丙型肝炎病毒NS3结合蛋白基因

为克隆与丙型肝炎病毒（HCV）NS3蛋白结合的肝细胞中的蛋白基因，采用酵母双杂交系统Ⅲ技术进行筛选。构建HCV NS3蛋白诱饵酵母质粒，转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。选择既能在4重营养缺陷培养基（SD／－Trp-Leu-Ade-His)上生长，又能在涂有X－α－半乳糖（X－α－gal）的四缺培养平皿上生长的蓝色菌落，提取此酵母克隆的质粒，转化大肠杆菌后进行测序，并进行生物信息学分析。分析的结果显示，筛选出19个阳性克隆，包括已知功能基因17个，还有1个克隆的测序结果与GenBank中的1个未知功能序列有44％的同源性，初步证明了此基因与HCV NS3有结合活性。说明成功克隆了HCV NS3蛋白结合蛋白基因，为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索。     

肝炎病毒蛋白反式激活作用的研究策略

具有反式激活作用的肝炎病毒蛋白有多种,目前研究主要集中在HBV的羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)、HBx-Ag,以及HCV的核心蛋白、非结构蛋白3(NS3)、非结构蛋白5A(NSSA)等。研究肝炎病毒蛋白反式激活作用的分子生物学技术包括抑制性消减杂交(SSH)、基因表达谱芯片技术等。肝炎病毒蛋白在极少数情况下通过与启动子DNA结合影响肝细胞的基因表达谱,但更主要的是通过影响细胞信号转导的途径,包括NF-κB、STAT3、MAPK、Nur77、P13K等。关于肝炎病毒蛋白对肝细胞基因表达谱的影响及其机制的研究,对于阐明肝炎病毒感染引起的慢性肝病的分子生物学机制具有重要意义。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究

目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中之一为新型基因片段,与GenBank(中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为348个核苷酸(nt),编码产物由116个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为XTP4,在Gen-Bank中注册,注册号为AF490253。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

丙型肝炎病毒NS5B基因的克隆及在大肠杆菌的分泌表达

由于全长丙型肝炎病毒NS5B的疏水性，其表达和纯化非常困难。为了分泌表达NS5B，作者对NS5B进行截短，缺失其疏水部分从而在大肠杆菌细胞中分泌表达HCV NS5B基因，并测定其活性。用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）的方法，设计截去NS5B疏水部分，PCR引物以HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板，克隆到pGEM-Teasy载体中，双酶切后回收连接到pET-21b中表达。大肠杆菌培养上清过柱纯化，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹显示NS5B蛋白在大肠杆菌细胞中表达。表达产物在大肠杆菌培养上清中存在，分子量68kD左右，而且[^3H]总掺入率达6900cpm。NS5B蛋白在大肠杆菌上清中表达成功，经过活性测定，所表达的NS5B具有活性功能。     

乙型肝炎病毒核心启动子区基因异质性及对其转录活性的影响

从慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者外周血中扩增核心启动子（CP) 基因序列，克隆入pGEM-Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示，HBV长期携带者体内有准种共存，CP区内存在热点缺失突变及散在点突变。为了进一步探讨CP区基因异质性对其转录活性的影响，将野生株及不同缺失突变的CP基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点，筛选反向克隆，经KpnI和XhoI双酶切后克隆入氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因表达载体pCAT3-basic上，构建重组报告质粒。以Lipo-fectamine PLUS转染试剂转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，用ELISA方法检测CAT表达量，反映了CAT基因上游启动子的转录活性。结果显示，成功构建了重组报告质粒，与野生株比较，HBV CP区准种群的存在不同程度地降低了CP基因的转录活性。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37基因的克隆化研究

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合，涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因，命名为NS5ABP37，根据GenBank数据库推定蛋白编码序列的信息，应用反转录聚合酶链反应(PCR)扩增出该基因序列。连接人酵母和真核细胞表达载体表达成功，并经回交实验证实NS5A与NS5ABP37的结合作用，为进一步研究奠定基础。     

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白－蛋白的结合是丙型肝炎病毒（HCV）与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白5A（NS5A）被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子，参与HCV的复制、转录和信号传导等过程，但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系，作者采用酵母双杂交系统3，在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选，得到35个与NS5A特异性结合的阳性克隆，包括载脂蛋白、线粒体单体型基因，磷脂酸酸性磷酸酶等11种已知功能蛋白质基因和3个未知功能基因。本研究结果为阐明NS5A在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。     

HCV NS3丝氨酸蛋白酶与野生型P53相互作用的研究

目的：探讨HCV NS3丝氨酸蛋白酶与P53蛋白之间的关系。为研究NS3丝氨酸蛋白酶在HCV所致肝癌发生发展机制中的作用奠定基础。方法：构建HCV NS3丝氨酸蛋白酶基因及其N端缺失突变体的重组质粒,通过酵母双杂交系统定性及定量检测P53与NS3及共突变体的相互作用。结果：HCV NS3丝氨酸蛋白酶、N端缺失15个氨基酸及缺失30个氨基酸的NS3丝氨酸蛋白酶与P53均有相互作用,且相互作用的强度无显著差异,结论：HCV NS3丝氨酸蛋白酶与P53之间确定存在相互作用,但NS3参与相互作用的区段不在N2S3的N端,而在其C端。