抗汉滩病毒双链抗体重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达

目的应用Bac—to-Bac杆状病毒表达系统构建具有抗汉滩病毒(HTNV)G2糖蛋白(GP)鼠源性mAb 3G1与抗HTNV核蛋白(NP)鼠源性mAb 1A8嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中表达抗HTNV双链抗体并对表达产物进行初步鉴定。方法构建含有嵌合基因的杆状病毒表达载体ScFv-pFBD-ScFv‘,转化DH10Bac致敏菌,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上,快速筛选出含有抗HTNV双链抗体嵌合基因的重组杆状病毒,在昆虫细胞中进行表达,并利用间接免疫荧光试验检测表达产物。结果构建了含抗HTNV双链抗体嵌合基因之重组杆状病毒,并在昆虫细胞中表达出特异性抗体,该抗体能被兔抗人Q抗体所识别并可与HTNV NP和GP特异性结合。结论成功地在昆虫细胞中表达出抗HTNV双链抗体,且该抗体具有与HTNV NP抗原和GP抗原结合的活性。     

重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的：构建新型的马传染性贫血病毒(EIAV)的候选疫苗：方法：利用BAC—To—BAC杆状病毒表达系统，将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗(EIAV DLV)及其亲本株(EIAV LN)env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后，得到的重组病毒用SDS—PAGE和Western blot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAV env基因的重组痘苗病毒，单独或与重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白联合免疫小鼠。结果：构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比，联合免疫组免疫应答显著增强，其中中和抗体的滴度提高5～9倍。结论：含有EIAV env基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫，能够诱导高滴度的中和抗体。     

重组杆状病毒表达HEV ORF2抗原片段

目的：用重组杆状病毒表达戊型肝炎病毒（hepatitis E virus,HEV)ORF2基因片段,并对其免疫学特性进行研究。方法：与中间转染载体pVL1393相连构建重组质粒,在Lipofectin介导下将其与杆状病毒线性DNA（BaculoGold^TM)共转染Sf9昆虫细胞得到重组病毒,用免疫荧光,Western blot等方法对表达产物进行免疫学特性初步研究,并进行动物免疫试验。结果：含ORF2结构基因片段的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中获得了高效表达,经免疫荧光,Western blot,动物免疫试验证实该重组蛋白为HEV特异性蛋白,可刺激机体产生相应抗体。结论：重组杆状病毒能有效表达HEV抗原基因,所表达的ORF2重组蛋白具有HEV抗体识别的抗原表位,具有较好的抗原性和免疫原性。     

KIF18A杆状病毒表达系统的构建与鉴定

目的 KIF18A蛋白是调节有丝分裂和影响肿瘤发生发展的重要蛋白,本研究旨在建立KIF18A蛋白昆虫杆状病毒表达系统,从而可在体外高效合成KIF18A蛋白.方法 先用分子克隆方法构建转移载体,然后通过基因转座作用得到重组杆状病毒,最后将重组杆状病毒转入昆虫细胞Sf-9以高效合成KIF18A蛋白.结果 经过DNA测序、倒置显微镜下细胞观测和Western Blot检测验证分析,证实已成功建立了KIF18A蛋白昆虫杆状病毒表达系统.结论 明确了KIF18A杆状病毒表达系统中转移载体构建和重组病毒转染等条件,建立了高效表达KIF18A的杆状病毒表达系统.     

人乳头瘤病毒16型结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的 在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒16型（HPV16）结构蛋白,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研究以及诊断试剂的研制遵基础。方法 将目的基因克隆至杆状病毒转移载体,该重组质粒DNA与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,通过同源重组获得重组杆状病毒,用SDS－PAGE凝胶电泳和Western blot法检测重组子在昆虫细胞中表达的目的蛋白。结果 获得了稳定高效表达HPV16结构蛋白的重组杆状病毒,L1和L2蛋白的相对分子质量分别为57000和97000,L1蛋白的表达产量约占昆虫细胞总体蛋白的25％－30％。结论 人乳头瘤病毒16型结构蛋白可在昆虫细胞内高效表达。     

在昆虫细胞表达汉坦病毒的核蛋白及其在血清检测中的初步应用

杆状病毒是应用广泛的真核表达系统 ,利用杆状病毒核多角体启动子 ,可以在昆虫细胞高效表达外源基因。由于在昆虫细胞中表达的蛋白可以进行翻译后修饰 ,是表达汉坦病毒结构的理想系统。我们用昆虫细胞分别表达了姬鼠型和家鼠型汉坦病毒的糖蛋白和核蛋白 ,并进行了检测抗体的研究。使用PCR分别扩增姬鼠型汉坦病毒A9株、家鼠型汉坦病毒L99株的M和S片段编码区序列 ,克隆到昆虫细胞表达穿梭质粒pAcUW5 1,在杆状病毒核多角体启动子控制下。将质粒转Sf9细胞 ,通过 3轮空斑筛选重组病毒 ,用Western blot和免疫荧光证实了这些基因在昆虫细胞得…     

人脂联素基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统探讨人脂联素(ADPN)基因在Sf9昆虫细胞中的高效表达。方法利用PCR方法扩增人脂联素基因,与pFastBac1质粒连接,转化入含有穿梭载体bacmid的大肠杆菌DH10Bac中,筛选发生转座作用的重组穿梭载体Bacmid-ADPN并转染Sf 9昆虫细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物。结果重组杆状病毒感染的Sf 9细胞形态变化明显,能够表达出与脂联素多克隆抗体相结合的蛋白,蛋白分子质量约为30 ku。结论人脂联素基因在真核细胞中成功得到表达,为进一步研究其生物学活性和作用机制奠定基础。     

狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白基因的克隆及其重组蛋白在昆虫细胞中的表达

目的从国内狂犬病疫苗ａＧ株中克隆狂犬病病毒糖蛋白（ＧＰ）基因和核蛋白（ＮＰ）基因，应用杆状病毒－昆虫细胞表达系统使其在昆虫细胞中表达。方法从狂犬病病毒感染细胞上清液中提取病毒ＲＮＡ，应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＧＰ基因和ＮＰ基因。扩增的基因与转移质粒连接并转化大肠杆菌，得到重组转移质粒。将其与野生杆状病毒（ＡｃＭＮＰＶ）线性ＤＮＡ共转染Ｓｆ９昆虫细胞，通过有限稀释法筛选含有ＧＰ基因和ＮＰ基因重组病毒。初步检测了重组蛋白的抗原性。结果用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到ＧＰ基因和ＮＰ基因，通过重组转移后重组病毒感染的细胞经免疫印染实验表明可分别表达ＧＰ和ＮＰ重组蛋白。重组蛋白的分子量分别为５８×１０３和５３×１０３。用重组病毒感染的细胞免疫小鼠后可诱导动物产生特异性抗体。结论可以应用杆状病毒－昆虫细胞表达系统表达狂犬病病毒ＧＰ和ＮＰ重组蛋白，为开发基因工程化狂犬病疫苗提供有意义的资料     

汉滩病毒囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端在昆虫细胞中的融合表达

目的：在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中，融合表达汉滩病毒的囊膜糖蛋白G2与核蛋白氨基端。方法：构建含有汉滩病毒G2S0．7嵌合基因的表达载体pFBDHTa—G2S0．7，并转化DH10Bac感受态菌。利用其含有的细菌Tn7转座系统，将嵌台基因重组至杆状病毒穿梭质粒hacmid中，并筛选含有G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，在昆虫细胞中表达该融合蛋白。对表达产物用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹进行检测。结果：构建了的含G2S0．7嵌合基因的重组杆状病毒，感染昆虫细胞后，可表达相应大小的融合蛋白。该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别。结论：利用杆状病毒表达系统，成功地表达同时具有核蛋白及糖蛋白G2生物学活性的融合蛋白G2S0．7，为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型致瘤基因E6在昆虫细胞中表达及其 …

目的 研究人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）相关肿瘤患者的ＨＰＶ１６ Ｅ６抗体水平及其流行病学意义；探讨用杆状病毒－昆虫细胞表达载体系统表达的ＨＰＶ１６ Ｅ６蛋白的抗原性；方法 用ＰＣＲ从ＨＰＶ１６基因组中扩增出ＨＰＶ１６ Ｅ６完整基因，克隆至转移载体ｐＶＬ１３９３中，重组质粒ＤＮＡ与线性杆状病毒ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ－９，经噬斑筛选获得带有编码Ｅ６基因的重组杆状病毒株，并在昆虫细胞中表达。结果 Ｗｅｓｔｅ     

Immune responses induced by a BacMam virus expressing the E2 protein of classical swine fever virus in mice

Non-replicating baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells has been developed as a vaccine strategy against a number of diseases in several animal models. In the present study, the BacMam vector, a baculovirus pseudotyped with the glycoprotein from vesicular stomatitis virus, was used as a recombinant vector to express classical swine fever virus (CSFV) E2 protein under the control of the immediate early 1 (ie1) promoter from shrimp white spot syndrome virus. The E2 gene was efficiently expressed in both insect and mammalian cells. Intramuscular injection of mice with the recombinant baculovirus resulted in the production of high-titers of CSFV-specific neutralizing antibodies. Specific lymphoproliferative responses to CSFV stimulation were detected in the splenocytes of the immunized mice as demonstrated by CFSE staining assay and WST-8 assay. This study demonstrates that the BacMam virus vector can efficiently express the E2 protein and effectively induce immune responses against CSFV. This is a first step in the demonstration that the pseudotyped baculovirus-delivered CSFV E2 gene can be a potential non-replicating vaccine against CSFV infections.     

新疆出血热病毒S基因在真核系统的克隆和表达

目的　在真核系统表达XHFVS基因片段 ,制备安全、特异、便于操作的S蛋白。方法设计引物 ,扩增得到S基因编码片段 ,用杆状病毒表达载体pFastBacHTb克隆S基因 ,并在昆虫细胞中表达S基因。结果　地高辛探针杂交和PCR扩增结果表明成功地构建了含XHFVS基因片段的pBac Sxhf质粒。SDS PAGE分析表达产物在相对分子质量 (Mr)为 6 6× 10 3 下方出现 1条明显的蛋白条带 ,Westernblot发现该蛋白带可以与抗XHF病毒核蛋白单克隆抗体发生反应。结论　构建的含XHFVS基因的重组杆状病毒可以在昆虫细胞表达S蛋白 ,该蛋白可与特异性抗体相结合     

新疆出血热病毒核蛋白基因的高效表达及其在诊断中的初步应用

目的　克隆并测定了克里米亚 刚果出血热病毒 (CCHFV)中国分离株 (新疆出血热病毒 ,XHFV)BA8816 6株核蛋白 (NP)基因的序列并实现其在细菌中的高效表达与临床诊断的应用。方法　病毒RNA经RT PCR扩增出完整的NP基因。将扩增产物进行序列分析并克隆至融合表达载体pET32a ,使重组质粒在大肠杆菌BL 2 1中高效表达。将融合蛋白经初步纯化后包被ELISA板用于抗体检测。结果　XHFVBA8816 6株NP基因序列以及推导的氨基酸序列与其它XHFV的NP基因和蛋白序列同源性较高 ,在进化树上形成独立的分支。BA8816 6株NP基因编码 4 82个氨基酸的核蛋白 ,推测的相对分子质量 (Mr)约为 5 4× 10 3。在细菌中表达的融合蛋白经印迹试验证明具有良好的抗原性。以所建立的ELISA方法检测疫区人和动物血清的结果与IFA一致 ,并与临床诊断有很好的符合率。结论　BA8816 6株与其它XHFVBA6 6 0 19、BA84 0 2的NP基因在进化上关系密切 ,综合M基因的序列分析结果 ,人源分离株BA8816 6可能是来自蜱的BA84 0 2变异株。表达于细菌中的核蛋白可作为安全的诊断性抗原用于临床检测及流行病学调查 ,所建立的方法准确、特异、简便、快速     

人乳头瘤病毒6b L1/16E7嵌合蛋白的基因克隆和表达

目的 研究HPV6bL1/16E7嵌合蛋白的基因克隆及其在昆虫细胞的表达,为防治尖锐湿疣和宫颈癌的基因工程疫苗研究作准备。方法 用PCR扩增出HPV6bL1/16E7嵌合蛋白基因,将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达HPV6bL1/16E7嵌合蛋白。结果 HPV6bL1/16E7嵌合蛋白基因在昆虫细胞中得到了表达,并可自组装形成病毒样颗粒。结果 昆虫细胞表达的HPV6bL1/16E7嵌合病毒样颗粒可进一步用于HPV感染的免疫机理及基因工程疫苗研究。     

Immunoselection of recombinant baculoviruses expressing high levels of biologically active herpes simplex virus type 1 glycoprotein D

Summary The DNA sequence encoding the complete herpes simplex virus type 1 (HSV-1) glycoprotein D (gD) was inserted into a baculovirus transfer vector under control of the polyhedrin gene promoter of the baculovirusAutographa california nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). After co-transfection ofSpodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with wild-type AcNPV DNA and the recombinant transfer vector DNA, polyhedrin-negative recombinants that expressed high levels of HSV-1 gD were isolated using immunoaffinity selection with antibody coated magnetic particles followed by plaque purification. These recombinant baculoviruses expressed a protein that was slightly smaller than virion HSV-1 gD made in Vero cells. This recombinant protein was expressed at high levels. The expressed protein was glycosylated, was found on the membrane of Sf9 cells, and reacted with gD specific antibodies. Antibodies raised in mice to the recombinant gD neutralized HSV-1 as measured by plaque reduction assays. Mice inoculated with the recombinant baculovirus were completely protected from lethal challenge with HSV-1.     

用细菌／杆状病毒系统在昆虫细胞中表达HIV—2外膜糖蛋白gp105和跨膜糖蛋白g

目的 用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统在昆虫细胞Ｓｆ９中表达ＨＩＶ－２外膜糖蛋白ｇｐ１０５跨膜糖蛋白ｇｐ３６,为研制艾滋病疫苗和诊断试剂奠定基础。方法 分别将ＨＩＶ－２外膜蛋白ｇｐ１０５和跨膜蛋白ｇｐ３６全基因序列克隆到杆状病毒转座载体ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＴＨａ和ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＴＨｂ中我角体启动子下游,构建成重组转座载体ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＨＴａ－ｐｇ１０５和ｐＦａｓｔ Ｂａｃ ＨＴｂ－ｇｐ３６,利用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ）表达系统筛选重组杆状病毒,并在昆虫细胞Ｓｆ９中表达ＨＩＶ－２的ｇｐ１０５和ｇｐ３６。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果表明,ｐｇ１０５基因表达产物为－６６０００ｕ糖蛋白,ｐｇ３６基因则表达－４１０００ｕ糖蛋白,与天然产物一致。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示：     

Characterisation of an avian influenza virus nucleoprotein expressed inE. coli and in insect cells

The nucleoprotein (NP) gene from influenza virus A/Shearwater/Australia/72 has been expressed intracellularly in both E. coli and insect cells. E. coli-derived NP was identified by Western blot analysis as a 56 kDa protein which co-migrates with virion-derived NP. This protein was purified by immunoaffinity chromatography and a nitrocellulose binding assay showed that NP formed complexes with positive- and negative-sense influenza neuraminidase RNA transcribed in vitro. ELISA and Western blot analysis revealed that recombinant NP of 56 kDa was produced in high yields in insect cells using a baculovirus vector. Immunofluorescence microscopy revealed that NP was localised to the nucleus of infected insect cells.