miR-129-5p靶向调节果蝇形态同系物2基因抑制喉鳞癌细胞增殖和诱导凋亡的体外研究

目的　探讨miR-129-5p对喉鳞癌细胞增殖、凋亡的调控机制。方法　运用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time f luorescence quantification polymerase chain reaction，qRT-PCR）法检测人支气管上皮细胞HBE、喉鳞状细胞癌细胞HN4、TU177中miR-129-5p、DIAPH2的表达；将miR-NC组（转染miR-NC）、miR-129-5p组 （转染miR-129-5p mimics）、anti-miR-NC组（转染antimiR-NC）、anti-miR-129-5p组（转染anti-miR-129-5p）、si-NC组（转染si-NC）、si-DIAPH2（果蝇形态同系物2，Drosophila Homologue of Diaphanous2，DIAPH2）组（转染si-DIAPH2）、miR-129-5p+pc DNA组（共转染miR-129-5p和pc DNA）、miR-129-5p+pc DNA-DIAPH2组（共转染miR-129-5p和pc DNA-DIAPH2），用脂质体法转染HN4、TU177细胞；Western blot检测细胞中DIAPH2、细胞周期蛋白依赖激酶1（cyclinD1）、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-caspase-3）、剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（cleaved-caspase-9）的蛋白表达；MTT法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡；双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-129-5p与DIAPH2的结合力。结果　与人支气管上皮HBE相比，喉鳞癌细胞HN4、TU177中miR-129-5p 表达均显著降低，DIAPH2表达显著升高（P <0.05）；过表达miR-129-5p、敲减DIAPH2均可显著抑制HN4、TU177细胞增殖、促进凋亡、下调cyclinD1、上调cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9；miR-129-5p可抑制野生型DIAPH2细胞的荧光活性，并负向调控DIAPH2的表达；过表达DIAPH2可逆转miR-129-5p对Hep-2细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。结论　miR-129-5p可抑制喉鳞状细胞癌的增殖，促进凋亡，其机制可能与靶向DIAPH2相关，将可为miR-129-5p靶向治疗喉鳞状细胞癌提供新的依据。     

猫白血病C亚类病毒受体1的反义RNA1靶向抑制微小RNA-515-5p表达对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响#br#

目的　探讨猫白血病C亚类病毒受体1的反义RNA1（feline leukemia virus subgroup C virus receptor 1 antisense RNA 1，FLVCR1-AS1）对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法　以人永生化鼻咽上皮细胞NP69（简称NP69细胞）为对照，实时荧光定量PCR（realtime fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）法检测鼻咽癌细胞系（5-8F、C666-1、6-10B）中FLVCR1-AS1 和微小RNA（microRNA，miR）-515-5p表达。将C666-1细胞分为si-NC组、si-FLVCR1-AS1组、miR-NC组、miR-515-5p组、si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC组和si-FLVCR1-AS1+anti-miR-515-5p组，CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖，划痕实验和Transwell检测分别检测细胞迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因实验验证FLVCR1-AS1和miR-515-5p调控关系。结果　鼻咽癌细胞系（5-8F、C666-1、6-10B）中FLVCR1-AS1表达高于NP69细胞（2.26±0.11、4.19±0.24、3.54±0.18 vs 1.00±0.00，P<0.05），而miR-515-5p表达低于NP69细胞（0.86±0.09、0.20±0.03、0.47±0.05 vs 1.00±0.00，P <0.05）。与si-NC组比较，si-FLVCR1-AS1组 C666-1细胞光密度（optical density，OD）值（0.59±0.03vs 1.34±0.08）、克隆数[（55.67±1.70）个vs（114.67±3.30）个]、迁移距离[（75.34±3.09）μm vs（186.29±9.29）μm]、侵袭数[（69.33±3.68）个vs（149.67±6.80）个]降低（P 均<0.05）。与miR-NC组比较，miR-515-5p组C666-1细胞OD值（0.51±0.04 vs 1.36±0.07）、克隆数[（46.67±1.25）个vs（115.67±4.11）个]、迁移距离[（65.89±1.96）μm vs（186.49±8.33）μ m]、侵袭数[（58.33±2.05）个vs（150.00±6.98）个]降低（P 均<0.05）。FLVCR1-AS1可靶向负调控miR-515-5p。与si-FLVCR1-AS1+anti-miR-NC组比较，si-FLVCR1-AS1+anti-miR-515-5p组C666-1细胞OD值（1.16±0.06 vs 0.59±0.04）、克隆数[（106.00±3.56）个vs（55.33±2.49）个]、迁移距离[（164.06±7.40）μm vs （75.48±2.62）μ m]、侵袭数[（134.67±5.31）个vs（69.00±2.94）个]升高（P均<0.05）。结论　FLVCR1-AS1可能靶向下调miR-515-5p促进鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

微小RNA-30a-5p调控喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖和凋亡的机制探讨

目的　探讨miR-30a-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖凋亡的影响及其机制。方法 用实时荧光定量PCR检测喉癌及癌旁组织中miR-30a-5p的表达;将Hep-2细胞分为NC组（转染miR-30a-5p mimics阴性对照）、miR-30a-5p组（转染miR-30a-5p mimics）、anti-NC组（转染miR-30a-5p inhibitor阴性对照）和anti-30a-5p组（转染miR-30a-5p inhibitor）,MTT实验、平板克隆形成实验和Annexin V-FITC/PI 双染实验分别检测细胞增殖、克隆形成和细胞凋亡情况。双荧光素酶报告基因实验检测miR-30a-5p和SOX9的靶向关系。结果　与癌旁组织表达量（1.00±0.10）相比,喉癌组织中miR-30a-5p的表达水平（0.37±0.03）显著降低（P <0.05）。与NC组相比,miR-30a-5p组细胞活性（48小时：0.42±0.03 vs 0.58±0.04）降低,细胞克隆数（75.36±6.85 vs 136.25±10.50）降低,细胞凋亡率[（23.86±2.21）% vs（9.95±1.16）%]升高（P <0.05）。双荧光素酶报告实验结果显示,转染SOX9-WT质粒的Hep-2细胞荧光素酶活性明显降低（P <0.05）,而转染SOX9-MUT质粒的Hep-2细胞荧光素酶活性无显著变化。anti-miR-30a-5p组对He p -2细胞的作用与miR-30 a -5p组相反。结论  miR-30a-5p可能通过靶向下调SOX9抑制喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖并促进细胞凋亡。     

TPA诱发Hep-2细胞株凋亡的研究

目的 :探讨 TPA诱发人喉鳞癌细胞凋亡的规律及基因调控机制。方法 :应用电镜及流式细胞仪分析技术进行观察和检测。结果 :1nmol/L TPA作用 12小时 ,可明显地诱发 Hep- 2细胞凋亡 (凋亡率为 11.18% ) ,2 4小时内 ,其诱导效率呈时间、剂量依赖性增强 ,最大凋亡率为 2 7.8% (10 0 nmol/L TPA诱发 2 4小时 )。细胞分裂阻滞于 G1期。 Bcl- 2的表达在 12小时出现明显的抑制 ,而 Fas在 6小时即出现较高的表达。 4 8小时内 ,两种基因的表达呈现出明显的负相关 (r=- 0 .92 80 ,P <0 .0 1)。结论 :TPA能够诱发人喉鳞癌细胞凋亡 ,Bcl- 2和 Fas在 TPA诱发的人喉鳞癌细胞凋亡过程中可能起着重要的作用     

MicroRNA-24对人喉鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨MicroRNA-24(miR-24)对喉鳞状细胞癌(LSCC)Hep-2、AMC-HN-8细胞增殖、侵袭及凋亡等生物学行为的影响。 方法 应用Lipofectamine^TM 2000转染上调Hep-2、AMC-HN-8细胞中miR-24的表达,通过荧光定量PCR验证转染效率;然后分别采用MTT法、克隆形成实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验流式细胞分析技术分析外源上调miR-24后Hep-2、AMC-HN-8细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。 结果 miR-24质粒稳定转染Hep-2、AMC-HN-8细胞后miR-24表达明显上调。与转染miR-NC组和空白对照组相比,转染miR-24能明显降低Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力;同时,转染miR-24能明显增加Hep-2、AMC-HN-8细胞的凋亡能力。 结论 miR-24异常表达与LSCC Hep-2、AMC-HN-8细胞的生物学行为密切相关,可能发挥抑癌作用。     

miR-218-5p靶向聚腺苷二磷酸核糖聚合酶9对喉鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡影响

目的　探讨miR-218-5p对喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）细胞的增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法  实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白质印记（Western blot）检测人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞和正常喉上皮细胞NPEC中miR-218-5p和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶9（Poly ADP-Ribose polymerase 9,PARP9）的表达水平。构建过表达miR-218-5p或敲减PARP9的Hep-2细胞株,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-218-5p和PARP9的靶向 调控关系。结果　与NPEC细胞相比,Hep-2细胞中miR-218-5p的表达水平显著降低（t =19.540,P <0.05）,PARP9的表达水平显著升高（t =25.381,P <0.05）。与miR-con组比较,miR-218-5p组Hep-2细胞存活率显著降低（F =37.167,P <0.05）,凋亡率显著升高（F =670.506,P <0.05）。与si-con组比较,si-PARP9组Hep-2细胞存活显著降低（F =61.813,P <0.05）,凋亡率显著升高（F =650.225,P <0.05）。miR-218-5p靶向负性调控PARP9表达。与miR-218-5p+pcDNA-con组比较,miR-218-5p+pcDNA-PARP9组Hep-2细胞存活显著升高（F =44.216,P <0.05）,凋亡率显著降低（F =329.517,P <0.05）。结论　miR-218-5p通过靶向PARP9抑制喉鳞癌 细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

RNAi沉默miRNA-224-5p对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响

目的通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术,来探讨沉默miRNA-224-5p对人喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）Hep-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响。方法针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体,将重组miRNA-224-5p-RNAi-LV3转染喉鳞癌Hep-2。设为干扰组（miRNA-224-5p-siRNA,SI组）、阴性对照组（NC组）和空白对照组（BC组）,分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-224-5p的表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况、Transwell侵袭实验检测细胞侵袭情况。结果 miRNA-224-5p-RNAi-LV3可显著降低miRNA-224-5p的表达,转染后Hep-2细胞增殖能力显著降低,细胞侵袭能力明显减弱,细胞周期及细胞凋亡均未见明显影响。结论 RNAi沉默miRNA-224-5p可以抑制Hep-2细胞增殖,并降低其侵袭能力。     

p16基因治疗喉鳞状细胞癌的实验研究

目的　探讨外源性p16基因对人喉鳞状细胞癌 (简称鳞癌 )的抑制作用。方法　应用携带p16基因的复制缺陷型腺病毒转染人喉鳞癌细胞株 ,用Western免疫印记法 (Westernblot法 )检测p16基因在喉鳞癌细胞中的表达情况 ,在体外、体内观察p16基因治疗喉癌细胞的生长抑制情况。结果　复制缺陷型腺病毒载体可有效地将外源性p16基因转染入人喉鳞癌细胞株中并使其表达p16蛋白 ;体外、体内抑瘤实验表明 :携带p16基因的重组腺病毒Ad p16治疗组肿瘤生长明显受抑制 ,其肿瘤体积均数为 (91 0 0± 6 3 2 )mm3,而携带LacZ基因的重组腺病毒Ad LacZ和磷酸盐缓冲液(phosphaticbufferedsaline ,PBS)组肿瘤体积均数则分别为 (13 7 0 0± 9 62 )mm3和 (144 0 0± 13 87)mm3,经统计学检验、实验组与对照组差异有显著性 (P <0 0 5 )。Ad LacZ与PBS组比较差异无显著性 (P>0 0 5 ) ,提示p16基因可抑制人喉鳞癌细胞生长 ,而腺病毒载体对肿瘤生长无影响。结论　用腺病毒载体可有效地介导肿瘤抑制基因p16的表达 ,并可抑制人喉鳞癌细胞生长 ,该项研究为今后应用p16基因治疗喉癌提供了重要的实验参考     

白花蛇舌草多糖提取物诱导Hep-2细胞凋亡与抑制侵袭机制

目的 研究白花蛇舌草多糖提取物(HDP)对人喉癌Hep-2细胞的抗瘤作用。 方法 采用MTT测量细胞活性,流式细胞仪进行凋亡分析。Transwell培养小室进行细胞侵袭实验,Western blotting测量多糖提取物诱导凋亡和抗侵袭活性的机制。 结果 HDP对喉癌细胞的抑制呈时间和浓度依赖性,浓度越高,时间越长抑制率越高。细胞周期分析发现HDP(400 μg/mL)使细胞滞留于G₀/G₁期,同时发现药物作用24 h后细胞凋亡率明显升高,Western blotting结果分析发现相关凋亡蛋白caspase-3, caspase-8和caspase-9表达升高,而Bcl-2表达下降。同时细胞侵袭实验还发现HDP抑制喉癌细胞的侵袭,抑制MMP-2和uPA相关蛋白的表达。 结论 研究发现 HDP 抑制喉癌细胞的凋亡和侵袭,对恶性肿瘤的治疗有潜在的应用价值。     

MiR-196b affects the progression and prognosis of human LSCC through targeting PCDH-17

ObjectiveTo explore the effect of miR-196bon the biological features of human laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) through targeting PCDH-17.MethodsmiR-196b and PCDH-17 expressions were determined in tissues, and the targeting relation of miR-196b and PCDH-17 was verified through dual-luciferase reporter system. In vitro, Hep-2 cells were divided into the Control, miR-196b inhibitors, miR-NC, PCDH-17, and miR-196b mimics + PCDH-17 groups. The miR-196b and PCDH-17 expressions were determined by qRT-PCR or/and Western blot, and the biological features by MTT, Annexin V-FITC/PI, wound-healing and Transwell assays.ResultsMiR-196b was found to be up-regulated, while PCDH-17 was down-regulated in a negative correlation in LSCC patients, which was related to histological grade and TNM stage. And low expression of miR-196b and high expression of PCDH-17 contributed to an increase in the 5-year-survival rate of LSCC patients. Besides, miR-196b directly targeted PCDH-17, while miR-196b inhibitors could up-regulate the PCDH-17 in Hep-2 cells. Moreover, miR-196b inhibitors and PCDH-17 curbed Hep-2 cell proliferation but facilitated the apoptosis, with decreases in cell invasion and migration. In addition, no statistical significance was found in cell proliferation, apoptosis, invasion and migration between Control group and miR-196b mimics + PCDH-17 group.ConclusionLSCC patients exhibited the up-regulated miR-196b and down-regulated PCDH-17, which are correlated with the major clinical features and prognosis. Inhibiting miR-196b may suppress proliferation, migration and invasion abilities, and promote apoptosis of Hep-2 cells via targeting PCDH-17.     

miR-181b-5P和EPB41L3蛋白在喉癌中的表达及临床意义

目的 miR-181b-5P和红细胞膜蛋白配体4.1样3(EPB41L3)目前在喉癌中表达关系及作用机制尚不明确。论文主要通过研究miR-181b-5P、EPB41L3蛋白在喉癌组织及癌旁正常组织中表达水平并进行相关性分析,探讨miR-181b-5P靶向调控EPB41L3对喉癌组织增殖、侵袭及转移的影响。 方法 通过生物信息学数据库预测miR-181b-5P在喉癌中的表达情况,采用实时荧光定量PCR技术测定喉癌及癌旁正常组织中miR-181b-5P的表达量。预测miR-181b-5p的靶基因并进行生物信息学分析,EPB41L3蛋白的相对表达由免疫组化SP法测定。 结果 喉癌组织中miR-181b-5P的表达明显较癌旁正常组织高(P<0.001),且在有无淋巴结转移间有显著差异(P=0.027 3)。EPB41L3蛋白在喉癌组织的表达明显较癌旁正常组织低(P<0.001)。EPB41L3蛋白在喉癌中的阳性表达率于不同病理分化程度、临床分期及有无淋巴结转移中差异具有统计学意义(P<0.05)。miR-181b-5p及EPB41L3蛋白在喉癌组织中的表达呈负相关(r=-0.420 8,P=0.002 3)。 结论 miR-181b-5P可能通过负性调控EPB41L3的表达,影响喉癌组织的增殖、侵袭、转移,研究可为喉癌的临床靶向治疗提供新的思路。     

外泌体介导的miR-577在幼儿复发性喉乳头状瘤中的表达及其对细胞增殖和侵袭的影响

目的 探讨miR-577在幼儿复发性喉乳头状瘤中的表达及其对细胞增殖、侵袭的影响和潜在分子机制.方法 收集2016年6月至2019年12月确诊的30例幼儿喉乳头状瘤组织样本及其相匹配且远离病灶经病理检查证实的正常喉组织样本,并选取人正常喉上皮细胞株和喉乳头状瘤细胞(分为miR-577过表达组、阴性对照组及空白对照组)进...     

长链非编码RNA核富集转录体1促进喉鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的机制研究

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)核富集转录体1(NEAT1)NEAT1对喉鳞状细胞癌(LSCC)细胞迁移和侵袭的影响,并进一步分析miR-429/锌指E-盒结合同源异形盒1(ZEB1)轴在其中发挥的作用。方法 慢病毒转染建立稳定敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞,通过RT-qPCR检测细胞lncRNA NEAT1表达以验证转染效率,通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,通过Western blot检测细胞上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达。通过生物信息学分析miR-429与lncRNA NEAT1和ZEB1 mRNA间的潜在结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-429与lncRNA NEAT1以及miR-429与ZEB1 mRNA结合。将miR-429抑制剂转染敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞,通过Western blot检测细胞ZEB1表达。进一步检查敲减ZEB1对抑制miR-429的敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞迁移、侵袭和EMT的影响。结果 敲减lncRNA NEAT1降低LSCC细胞lncRNA NEAT1表达,抑制细胞迁移和侵袭并下调细胞N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达。miR-429与lncRNA NEAT1和ZEB1 mRNA间存在潜在结合位点,且miR-429与lncRNA NEAT1以及miR-429与ZEB1 mRNA结合。抑制miR-429逆转了敲减lncRNA NEAT1对LSCC细胞ZEB1表达的抑制作用。此外,敲减ZEB1逆转了抑制miR-429对敲减lncRNA NEAT1的LSCC细胞迁移和侵袭的促进作用及EMT相关蛋白N-cadherin、Vimentin、Slug和Snail表达的上调作用。结论 lncRNA NEAT1促进LSCC细胞迁移和侵袭,其机制可能与海绵化miR-429上调ZEB1表达促进LSCC细胞EMT有关。     

脆性组氨酸三联体在喉癌中的表达

目的探讨脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)在喉鳞状细胞癌(简称喉癌)中的表达,并分析其与p53、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)以及临床病理学特征的关系。方法采用免疫组化SP法检测60例喉鳞癌、25例癌旁组织、25例喉角化症和20例声带息肉标本中FHIT表达,使用同样方法检测实验组60例喉癌中突变型p53和PCNA的表达水平,结合喉癌患者的临床病理学特征进行分析。结果①在喉癌、癌旁组织和喉角化症中均检测到不同程度FHIT缺失,低表达,在喉癌中最高,缺失,低表达率分别为61．7%(37/60)、36．0% (9/25)、32．0%(8/25);声带息肉中未见FHIT缺失/低表达(0/20);②喉癌中FHIT缺失/低表达率高于癌旁组织、喉角化症和声带息肉(x~2=4．682,P=0．030;x~2=6．243,P＜0．01 3：x~2=22．946,P=0．000);癌旁组织和喉角化症中FHIT缺失/低表达率均明显高于声带息肉(x~2=6．891,P=0．009;x~2=5．749,P=0．017);喉角化症中FHIT缺失/低表达率略低于癌旁组织,但差异无统计学意义(x~2=0．089,P=0．765);③FHIT表达与喉癌患者年龄、性别、肿瘤的原发部位、颈部淋巴结转移情况、临床分期及组织病理学分级均无明显相关性(P＞0．05);④FHIT与p53表达无明显相关性(g =0．103,P=0．434);FHIT与PCNA表达具有明显负相关性(g=-0．413,P=0．001)。结论FHIT缺失,低表达在喉癌的发生中可能起到重要作用,是喉癌发生的早期事件,可能与肿瘤的恶性增殖有关。     

Loss of FHIT expression in squamous cell carcinoma and premalignant lesions of the larynx

The tumor suppressor gene FHIT (fragile histidine triad) at chromosomal position 3p14.2 is altered by deletions in human tumors. The frequency and specificity of its inactivation vary among carcinomas, but few articles have referred to premalignant lesions such as dysplasia. We studied the expression of FHIT in a series of squamous cell carcinomas and premalignant lesions of the larynx. We observed 36 laryngeal carcinoma biopsy specimens and 70 dysplasia biopsy specimens. We studied FHIT expression in carcinoma and dysplasia with the immunohistochemical ABC (avidin-biotinylated peroxidase complex) method. Loss of FHIT protein was observed in 42% of the squamous cell carcinomas and 23% of the premalignant lesions. There was no significant difference among the three grades of dysplasia in FHIT expression. These findings of loss of FHIT protein expression, not only in squamous cell carcinoma, but also in premalignant lesions, indicate that FHIT alterations play an important role in the early events of carcinogenesis.     

c-Met和TIMP-2在喉癌中的表达及其意义

目的检测c-Met、TIMP-2蛋白在喉鳞状细胞癌（简称喉癌）及癌旁组织中的表达水平,研究两者表达与临床、病理参数的关系,探讨两者在喉癌侵袭、转移过程中的作用及其两者的相互关系。方法选取喉癌患者41例,另选癌旁组织15例作为对照,采用免疫组织化学方法（SP法）检测c-Met、TIMP-2的表达。结果c-Met、TIMP-2蛋白在喉癌组织中的阳性率分别为56．1％（23／41）及63．4％（26／41）。c-Met蛋白在癌旁组织中的阳性率为13．3％（2／15）,TIMP-2蛋白在癌旁组织为阴性。结论c-Met与喉癌颈淋巴结转移及病理分级有关;TIMP-2与喉癌的颈淋巴结转移有关;c-Met与TIMP-2在喉癌中的表达无相关性。