靶向沉默Wip1基因表达对胶质瘤细胞增殖及放疗敏感性的作用

目的 探讨靶向沉默Wip1基因表达对脑胶质瘤细胞增殖及放疗敏感性的影响。方法 体外培养人胶质瘤细胞株U251,用携带Wip1基因RNA干扰载体的慢病毒感染U251细胞沉默Wip1基因表达,然后对U251胶质瘤细胞进行放疗干预。根据对U251细胞处理方法分为4组:Wip1基因沉默后放疗组（IR+Wip1组）、单纯Wip1基因沉默组（Wip1组）、单纯放疗组（IR组）和NC组（空载体病毒感染U251细胞）。CCK-8法检测细胞的增殖,实时定量PCR检测细胞Chk1、Chk2 mRNA表达,免疫印迹检测细胞Chk1、Chk2蛋白表达。结果 U251细胞慢病毒感染后3~4 d,采用荧光显微镜观察,根据绿色荧光蛋白阳性表达判定感染效率,结果显示感染效率均90％以上。放疗后24、48、72、96、120 h,IR组和Wip1组增殖率均显著低于NC组（P<0.05）,而IR+Wip1组细胞增殖率明显低于IR组和Wip1组（P<0.05）。放疗后24 h,IR+Wip1组Chk1 mRNA表达明显低于Wip1组（P<0.05）,明显高于IR组和NC组（P<0.05）;IR+Wip1组Chk2 mRNA表达明显低于其他3组（P<0.05）。IR+Wip1组Chk1蛋白表达明显低于IR组和NC组（P<0.05）,Chk2蛋白表达低于其他3组（P<0.05）。结论 靶向沉默 Wip1 基因表达可抑制胶质瘤细胞的增殖,并可能通过抑制 Chk1 、 Chk2 的蛋白表达增加胶质瘤细胞对放疗的敏感性。     

靶向沉默Wip1基因协同替莫唑胺抑制脑胶质瘤细胞增殖的作用

目的研究靶向沉默Wip1基因对增敏替莫唑胺(TMZ)抑制脑胶质瘤细胞增殖作用的影响。方法体外培养人胶质瘤细胞株U-87MG,将携带Wip1基因RNA干扰载体的慢病毒感染U87-MG细胞。使用TMZ干预胶质瘤细胞,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞术Annexin-V(APC染色)检测细胞的凋亡情况,流式细胞术PI染色法检测细胞周期。实验数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。结果 Wip1基因沉默的胶质瘤细胞与空载体慢病毒对照组细胞对TMZ的作用对比,3d后细胞增殖率较对照组下降57.7%;Wip1基因沉默组TMZ处理5d后细胞凋亡率为15.3%,空载体对照组为5.65%;Wip1基因沉默组细胞凋亡率明显要高(P<0.05);细胞周期结果显示Wip1基因沉默组G2细胞为63.0%,而空载体对照组为23.8%,Wip1基因沉默组表现为G2/M期细胞明显增多(P<0.05)。结论靶向沉默Wip1基因可以显著增加TMZ对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。     

Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及其机制

目的研究Wip1基因在人脑胶质瘤细胞增殖的作用及机制。方法构建人Wip1基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默胶质瘤细胞U251及U87-MG细胞的Wip1基因表达,检测细胞增殖能力。流式细胞术PI单染法检测Wip1基因沉默后细胞周期分布。实时定量PCR法及Western blotting分别检测差异性基因m RNA及蛋白表达。结果胶质瘤细胞Wip1基因表达被有效沉默。Wip1基因沉默的胶质瘤细胞增殖变慢,在U87-MG细胞更加明显。细胞周期分析显示:Wip1基因沉默对U251细胞周期无明显影响,而U87-MG细胞则在10 d时出现明显S期增多和G1、G2期细胞减少。Wip1基因沉默后,U251细胞中CDKN2A和p14ARF基因表达下调,而在U87-MG细胞中表达均上调。Western blotting结果显示:在U251与U87-MG胶质瘤细胞中p38MAPK表达均上调。在U87-MG细胞中p53及p-p53(Ser 15)表达均上调,但在U251细胞中无明显变化。结论 Wip1对胶质瘤细胞增殖具有重要作用。在U87-MG细胞增殖作用主要与其调节p53功能有关。     

胶质瘤干细胞的结肠癌转移相关基因1表达与替莫唑胺耐药的相关性

目的探讨结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达与胶质瘤干细胞对替莫唑胺(TMZ)耐药的相关性。方法采用实时定量荧光PCR和Western blot方法测定U87胶质瘤细胞来源的干细胞(GSCsU87)、U251胶质瘤细胞来源的干细胞(GSCs-U251)及U87和U251细胞的MACC1 mRNA、蛋白表达水平。通过实时定量荧光PCR和Western blot检测RNA干扰对MACC1的沉默效应。用流式细胞术和CCK-8方法测定MACC1沉默对TMZ诱导的细胞毒性和细胞凋亡的影响。结果胶质瘤干细胞GSCs-U87和GSCsU251中MACC1 mRNA和蛋白表达水平显著增高(均P 0.05)。shRNA-MACC1可以显着抑制MACC1表达(均P 0.05)。用不同浓度的TMZ处理后,与对照组GSCs-U87和GSCs-U251相比,TMZ对MACC1沉默的GSCs-U87和GSCs-U251细胞毒性显著增加,且MACC1沉默的胶质瘤干细胞的凋亡数增高。结论 MACC1基因的沉默可增强TMZ对胶质瘤细胞的凋亡和生长抑制作用,从而增加其对TMZ化疗的敏感性。     

恶性胶质瘤耐药细胞通过Beclin1上调自噬抵抗替莫唑胺化疗

目的 分析Beclin 1与临床胶质瘤病理等级和胶质瘤复发间的关系,探讨其在胶质瘤耐药中的作用和机制. 方法 收集南方医科大学珠江医院和南方医院神经外科自2012年4月至2013年4月手术切除的胶质瘤标本53例(WHO分级Ⅰ级7例,复发2例;Ⅱ级9例,复发4例;Ⅲ级11例,复发6例;Ⅳ级9例,复发5例),免疫组化和Western blotting检测胶质瘤标本中Beclin1的表达;体外培养胶质瘤耐药细胞系U251AR和非耐药U251细胞,Western blotting检测细胞中Beclin 1和耐药蛋白P-gP的表达;Western blotting检测双链小分子Beclin 1干扰RNA(siBeclin l)转染U251AR细胞48h后Beclin 1蛋白的表达;CCK8法检测不同浓度替莫唑胺(TMZ)作用U251、U251AR和U251AR-siBeclin 1后细胞活性;Western blotting检测200μmol/L TMZ作用U251、U251AR和U251AR-siBeclin 1 48 h后Capase-3的表达;吖啶橙染色和Western blotting分别检测干扰Beclin 1表达和HCQ对U251AR细胞自噬小体数量和Capase-3表达的影响. 结果 免疫组化染色结果显示Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中Beclin 1阳性细胞数明显高于Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤.Western blotting结果显示Ⅳ级、Ⅱ和Ⅲ级、Ⅰ级中Beclin 1的表达依次降低,Ⅲ、Ⅳ级复发肿瘤Beclin 1的表达量明显高于原发肿瘤,差异有统计学意义(P＜0.05); U251AR中Beclin 1和耐药蛋白P-gP的表达量均高于U251细胞.与干扰对照组和空白对照组比较,转染siBeclin 1 48 h后干扰组Beclin 1蛋白的水平明显下降;在含TMZ(50,100,500和1000 μmol/L)培养基中培养24 h后,U251AR细胞存活率明显高于U251和si-Bec1-U251AR细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).200 μmol/L TMZ作用48 h后,U251细胞凋亡蛋白Caspase-3的表达量明显高于U251AR和si-Bec l-U251AR细胞.吖啶橙染色显示在TMZ培养U251AR 48 h后,HCQ和Beclin 1干扰都导致自噬小体形成明显减少,Caspase-3的表达增高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 Beclin 1与胶质瘤恶性程度、复发和耐药相关,可能用于胶质瘤恶性诊断和预后评估.Beclin 1在胶质瘤中的耐药功能可能是通过自噬实现的,联合运用TMZ和自噬抑制剂或Beclin 1干扰剂有助于胶质瘤的治疗.     

垂体瘤转化基因RNA干扰对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响

目的 观察垂体瘤转化基因(PTTG)RNA干扰对胶质瘤细胞对化疗药物敏感性的影响.方法 实验分4组:对照组:对胶质瘤U251细胞不进行任何处理;替莫唑胺(TMZ)组:胶质瘤U251细胞培养基中加入TMZ;PTTG shRNA转染组:PTTG shRNA片段转染胶质瘤U251细胞;PTTG shRNA联合TMZ组:TMZ作用于转染PTTG shRNA片段的胶质瘤U251细胞.MTT法检测细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 MTT结果显示吸光度值在对照组、TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组分别为0.85±0.07、0.58±0.06、0.55±0.07、0.41±0.05,TMZ组、PTTG shRNA转染组、PTTG shRNA联合TMZ组细胞增殖抑制率分别为(31.56±5.51)%、(35.53±4.60)%、(51.49±6.74)%;PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组抑制细胞增殖更明显,与PTTG shRNA组及TMZ组比较差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞仪检测结果显示,48 h时对照组凋亡率为(6.29±0.78)%,TMZ组为(33.61±4.88)%,PTTG shRNA组为(39.61±4.95)%,PTTG shRNA联合TMZ组为(66.23±7.60)%,PTTG shRNA组及TMZ组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而PTTG shRNA联合TMZ组的凋亡率较PTTG shRNA组及TMZ组明显增高,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PTTGRNA干扰可以增强胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高化疗效果.     

RNA干扰PDGF-B基因对胶质瘤U251细胞凋亡和增殖的影响

目的利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特定沉默胶质瘤U251细胞株的血小板源生长因子-B(PDGF-B)基因,观察其对U251细胞株细胞凋亡和增殖的影响。方法利用脂质体将针对PDGF-B基因的siRNA转染进入U251细胞,利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RTPCR)检测PDGF-B基因表达;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达,采用MTT法检测胶质瘤U251细胞的增殖,应用流式细胞计数观察抑制PDGF-B基因后胶质瘤U251细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR检测PDGF-B基因表达明显下降;Western blot检测显示siRNA转染组PDGF-B蛋白表达明显抑制(抑制率60%),MTT结果显示siRNA转染组U251细胞增殖较对照组明显降低;流式细胞学检测提示降低PDGF-B在胶质瘤细胞的表达能抑制胶质瘤细胞的有丝分裂,促进细胞的凋亡。结论构建针对胶质瘤细胞PDGF-B的RNA干扰质粒并转染人胶质瘤U251细胞株后,可明显抑制U251细胞株PDGF的表达,对人胶质瘤U251细胞株有明显的生长抑制和促进凋亡作用。     

柯里拉京对神经胶质瘤U251细胞及其干细胞增殖的影响

目的探讨柯里拉京对神经胶质瘤U251细胞及其干细胞增殖影响。方法使用免疫磁珠法从胶质瘤U251细胞系中分离、培养U251干细胞,不同浓度(0、25、50、100μg/ml)柯里拉京对U251细胞及其干细胞干预不同时间(24 h、48 h、72 h),观察其形态学变化。CCK-8法检测柯里拉京干预前后细胞增殖变化,实时荧光定量RT-PCR技术测定柯里拉京干预前后Livin、Caspase-3及Caspase-7 m RNA表达的变化规律。结果 U251细胞及其干细胞存活率随培养液中柯里拉京浓度升高和干预时间延长而降低(P0.05);同等条件下U251干细胞存活率低于U251细胞(P0.05)。柯里拉京抑制了Livin基因表达并能诱导Caspase-3、Caspase-7基因表达,且对U251干细胞基因抑制(或诱导)作用强于U251细胞(P0.05)。结论柯里拉京能抑制胶质瘤细胞及其干细胞增殖,降低Livin基因表达并诱导Caspase-3、Caspase-7基因表达,启动凋亡信号通路,且对胶质瘤干细胞增殖抑制程度及基因抑制(或诱导)作用强于胶质瘤细胞,但其具体抗肿瘤机制还未明确,还需深入研究。     

替莫唑胺对胶质瘤干细胞抗凋亡与多重耐药基因及细胞周期的影响

目的 分析替莫唑胺(TMZ)对胶质瘤U251细胞及其干细胞livin、MRP基因表达及细胞周期的影响.方法 分离培养U251细胞及其干细胞后,不同浓度的TMZ(0、25、50、100、200、400 μmol/L)干预72 h,CCK-8检测细胞增殖变化趋势,流式细胞术(FCM)检测细胞周期变化,RTPCR技术检测livin、MRP1、MRP3 mRNA表达.结果 本研究成功从U251细胞中分离出U251干细胞;与未干预组相比,25 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后其增殖率分别为0.952±0.011(t=-8.219,P=0.001)、0.937±0.029(t=-3.822,P=0.019)和100 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后其增殖率分别为0.750±0.018、0.887±0.039(t=5.480,P=0.005);正常情况下,livin基因在U251细胞及其干细胞中的表达量分别为(0.411 ±0.025)×10-3、(0.571 ±0.040)×10-3(t=-3.348,P=0.004),MRP1基因的表达量分别为(0.295 ±0.018)×-3、(0.481 ±0.034)×10-3(t=-8.439,P=0.001),MRP3基因的表达量分别为(1.128±0.117)×10-3、(0.963±0.059)×10-3(=2.176,P=0.095);200 μmol/L的TMZ干预U251细胞及其干细胞后livin mRNA表达量在分别为(0.020±0.002)×10-3(t=27.123,P =0)、(0.066 ±0.007)×10-3(￡=21.345,P =0);200 μmol/L干预后MRP1 mRNA表达量为(0.556±0.041)×10-3 (t=-10.214,P=0.001)、(0.609 ±0.044)×10-3(t=-3.98,P=0.016);200 μmol/L干预MRP3 mRNA表达量为(1.397±0.192)×10-3(t=-2.073,P=0.107)、(1.496 ±0.302)×10-3(t=-2.993,P=0.040);100 μmol/L干预后细胞周期U251细胞G2/M期百分比为11.353 ±0.516、39.1±1.2(t=-37.1,P=0)和U251干细胞S期百分比为21.1±1.0、30.2±1.7(t=-8.07,P=0.001).结论 替莫唑胺能有效降低U251及其干细胞中livin基因的表达,并使细胞分裂周期停滞,降低细胞增殖率,促进细胞凋亡.MRP1和MRP3可能分别是原发胶质瘤与复发胶质瘤耐药的主要原因之一.     

Evi1基因对胶质瘤细胞株U87/U251增殖、侵袭的影响

目的探讨Evi1基因在不同级别胶质瘤组织中的表达,以及调控该基因对胶质瘤细胞株U87和U251细胞增殖、细胞周期和侵袭影响,为靶向癌基因治疗胶质瘤提供客观依据。方法首先通过实时定量PCR(qRT-PCR)分别检测人脑不同级别胶质瘤组织以及U87和U251细胞株中Evil基因的表达水平。用合成的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)干扰下调U87和U251细胞Evi1基因表达作为干扰组,同时设空白和阴性对照组。qRT-PCR检测转染前后Evi1基因在U87和U251细胞中的表达和转染效率。CCK-8法检测实验组细胞的增殖能力,流式细胞仪分析Flow Cytometer(FCM)其细胞周期。Transwell以及划痕试验检测各组U87和U251的侵袭和迁移能力。以及用qRT-PCR分析下调Evi1基因后U87和U251细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达水平。结果 Evi1基因在胶质瘤组织中呈现高表达,且随着胶质瘤级别程度增加其表达水平亦上升,其中Ⅲ和Ⅳ级的胶质瘤组织以及U87、U251细胞Evi1基因表达明显高于非瘤脑组织(均P0.05)。通过siRNA下调Evi1基因后,胶质瘤细胞株U87和U251的增殖减缓(均P0.05),其侵袭和迁移能力明显下降(均P0.01),并能阻滞其细胞周期G1期(P0.05)。干扰组U87和U251细胞MMP2表达水平明显降低(均P0.01)。结论 Evi1基因在胶质瘤中呈高表达,干扰U87和U251细胞Evi1基因可抑制胶质瘤的增殖和侵袭。     

RNAi沉默Gli1基因对人胶质瘤细胞U251增殖与凋亡的影响

目的 研究RNA干扰技术(RNAi)沉默Hedgehog(Hh)信号转导途径中核心转录因子Gli1基因表达后对U251细胞增殖与凋亡以及下游因子Bcl-2、Bax、cycin D1表达的影响。 方法 合成、转染4对针对Gli1 mRNA不同位点序列的siRNA (58、59、60、61)至人胶质瘤U251细胞,RT-PCR检测细胞Gli1 mRNA的表达,筛选最有效抑制Gli1 mRNA表达的siRNA干扰片段(siRNA-Gli1);RT-PCR、Western blotting分别检测转染SiRNA-Gli后不同时间U251细胞Gli1mRNA和蛋白的表达,确定转染干扰的时间规律;实验分为3组：siRNA-Gli1组（转染筛选后siRNA-Gli1片断）、siRNA-NC组（转染阴性对照siRNA片断）、siRNA-N组（空白对照）。RT-PCR、Western blotting分别检测各组转染48 h后U251细胞cyclin D1、Bcl-2及Bax mRN和蛋白的表达,MTT、流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化。 结果 干扰片断58、59、60、61、NC的转染效率均达69.2％;RT-PCR检测显示转染后48 h U251-60细胞无明显Gli1 mRNA表达,选择60作为最佳干扰片段siRNA-Gli1转染U251细胞,48h时无明显Gli1 mRNA和蛋白表达,确定48 h为转染干扰的最佳时间;转染48 h后与siRNA-N和siRNA-NC组相比,siRNA-Gli1组U251细胞Bcl-2、cyclin D1 mRNA和蛋白表达下调、Bax mRNA和蛋白上调,差异均有统计学意义(P＜0.05)。MTT检测显示24、48和72 h时siRNA-Gli1组细胞增殖抑制率均明显高于siRNA-NC和siRNA-N组,差异均有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术结果显示siRNA-Gli1组细胞凋亡率高于siRNA-NC和siRNA-N组,差异有统计学意义(P＜0.05),且siRNA-Gli1组G1/G0期细胞比例增加,S期细胞明显减少。 结论 针对Gli1基因设计合成的siRNA-Gli1能明显抑制人胶质瘤U251细胞生长并能诱导其凋亡,其机制可能与下调cyclin D1、Bcl-2的表达,上调Bax的表达有关。     

替莫唑胺对人胶质瘤细胞系U251细胞miR125b的影响

目的探讨替莫唑胺(TMZ)对人胶质瘤细胞系U251细胞的miRNA125b的表达影响。方法将人胶质瘤细胞系U251细胞分成空白对照组、TMZ组,TMZ组设10、25、50、100、200、400、600μmol/L组。各组分别作用于24、48、72 h后进行实时定量PCR(Real-time PCR)检测miRNA-125b的表达水平;用MTT比色法检测细胞活力;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率。结果荧光定量PCR检测结果显示:替莫唑胺作用24 h后,miRNA125b表达变化不明显;48 h后对miR-125b表现出抑制作用,miR-125b对U251细胞的抑制率呈良好的时间-剂量效应关系,其Ic50为76μmol,初始抑制浓度为50μmol;流式细胞仪检测显示,U251细胞经TMZ作用后出现G2/M期阻滞,但促凋亡作用并不显著。结论在TMZ对胶质瘤细胞治疗过程中,hsa-miR-125b的表达随着治疗剂量而被抑制,miR-125b可以作为TMZ在用药过程中效果的检测以及抗药性反应的参考依据。     

长链非编码RNA SNORD3A在脑胶质瘤中的表达变化及功能研究

目的探讨长链非编码(lncRNA)SNORD3A在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中的表达变化,以及对胶质瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。方法采用生物信息学方法分析美国国家生物技术信息中心(NCBI)GEO数据库收录的GSE58276中差异表达的lncRNA,采集2017年6月至2019年8月手术切除的胶质瘤组织标本30例,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测lncRNA SNORD3A表达水平;小干扰RNA转染胶质瘤细胞系T98G和U251,CCK-8细胞增殖实验检测胶质瘤细胞增殖能力、Transwell细胞侵袭实验检测胶质瘤细胞侵袭能力、Western blotting法检测胶质瘤细胞c-Myc mRNA和蛋白表达变化。结果与对照组相比,胶质瘤组织lncRNA SNORD3A表达水平升高(P=0.000);与HEB细胞相比,胶质瘤细胞系T98G、U87、U251和U373 lncRNA SNORD3A表达升高(均P 0.05)。si-SNORD3A-1组和si-SNORD3A-2组T98G细胞(P=0.001,0.007)和U251细胞(P=0.002,0.009)lncRNA SNORD3A表达水平低于对照组;转染后24、48和72 h,si-SNORD3A-1组和si-SNORD3A-2组T98G细胞(均P=0.000)和U251细胞(均P=0.000)增殖能力低于对照组;转染后48 h,si-SNORD3A-1组和si-SNORD3A-2组穿过小室的T98G和U251细胞数目少于对照组(均P=0.000)、c-Myc mRNA和蛋白表达水平低于对照组(均P 0.01)。结论 lncRNA SNORD3A可能通过靶向c-Myc蛋白促进T98G和U251细胞的增殖和侵袭。     

lncRNA SNHG16对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的 探讨沉默长链非编码RNA核内小RNA宿主基因16（SNHG16）对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法 实时荧光定量PCR检测正常胶质细胞HEB、NHA和胶质瘤细胞A172、U251、U87、SHG-4中SNHG16的表达。用siRNA沉默U251细胞SNHG16的表达,分为NC-siRNA组和SNHG16-siRNA组,CCK-8法检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞侵袭,划痕实验检测细胞迁移。结果 与正常胶质细胞HEB和NHA比较,胶质瘤细胞A172、U251、U87和SHG-4的SNHG16表达水平明显升高（P<0.05）。与NC-siRNA组比较,SNHG16-siRNA组细胞增殖能力、细胞侵袭能力和细胞迁移能力均明显降低（P<0.05）。结论 SNHG16在胶质瘤细胞中高表达,特异性沉默SNHG16基因可以抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

TMZ对胶质瘤U251细胞及其干细胞TNF-α影响的体内研究

目的利用胶质瘤细胞及其干细胞制作裸鼠脑内种植瘤模型,动物水平研究替莫唑胺对胶质瘤细胞及其干细胞裸鼠脑内种植瘤肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响。方法免疫磁珠法分选CDl33+干细胞,脑立体定向制作裸鼠脑内种植瘤模型,不同浓度替莫唑胺干预,观察裸鼠生长行为学变化、肿瘤的病理学特征,荧光实时定量逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测TNF-α表达。结果肿瘤组织的病理学观察发现干细胞较U251细胞具有更高的侵袭性。RT-PCR检测发现,干细胞中TNF-αmRNA表达量显著高于U251细胞(P0.01)。替莫唑胺(TMZ)对U251细胞及其干细胞TNF-αmRNA的表达产生抑制作用。60μmol/L TMZ干预时,干细胞TNF-αmRNA表达量显著低于U251细胞(P0.01)。结论胶质瘤干细胞较U251细胞具有更强的化疗耐药性,这可能是胶质瘤化疗耐药的机制。     

miRNA-145在脑胶质瘤中的作用

目的探讨微小RNA(miRNA)-145在脑胶质瘤组织及胶质瘤细胞系中表达变化及对胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测检测10例胶质瘤组织和瘤周组织以及4种细胞系(人脑胶质细胞株HEB以及胶质瘤细胞系U251、T98和U87)miRNA-145的表达水平。将miRNA-145模拟物、阴性对照序列转染胶质瘤细胞系U251细胞,采用PCR检测U251细胞miRNA-145表达水平,采用MTT法检测U251细胞增殖能力,采用流式细胞仪检测U251细胞凋亡。结果与瘤周组织相比,胶质瘤组织miRNA-145表达水平明显降低(P0.05)。与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系U251、U87、T98细胞miRNA-145表达水平均明显降低(P0.05)。与阴性对照组相比,miRNA模拟物组U251细胞miRNA-145表达水平明显增高(P0.01),U251细胞增殖能力明显降低(P0.05),U251细胞凋亡水平明显增高(P0.05)。结论胶质瘤组织miRNA-145呈低表达,上调miRNA-145表达能够抑制胶质瘤细胞系U251细胞增殖能力并诱导U251细胞凋亡。这提示miRNA-145有可能成为胶质瘤治疗的靶点。     

靶向沉默c-fos基因表达对胶质瘤U87MG细胞增殖与侵袭的影响

目的探讨靶向沉默c-fos基因表达对胶质瘤U87MG细胞体外增殖与侵袭的影响。方法构建慢病毒载体c-fos-sh RNA,将其转染人脑胶质瘤U87MG细胞,同时将空载体转染细胞作为空载对照,未转染细胞作为空白对照;观察U87MG细胞形态、c-fos m RNA和蛋白表达变化、细胞侵袭和迁移能力、细胞生存率和细胞凋亡率。结果 c-fos-sh RNA慢病毒转染U87MG细胞48 h后,荧光显微镜下观察发现空白对照组U87MG细胞无绿色荧光,而空载体组和转染组U87MG细胞可见绿色强荧光和清晰的细胞轮廓。与空白对照组、空载体组相比,转染组U87MG细胞c-fos m RNA和c-fos蛋白表达显著降低(P0.05);慢病毒转染U87MG细胞24 h后,转染组U87MG细胞存活率显著降低(P0.05),细胞活力显著减弱(P0.05);细胞迁移和侵袭能力明显减弱(P0.05);慢病毒转染72 h后,转染组U87MG细胞凋亡数量显著上升(P0.05)。结论沉默c-fos基因表达可显著抑制脑胶质瘤U87MG细胞增殖和侵袭能力。     

RNA干扰胰岛素样生长因子结合蛋白2基因治疗胶质瘤的体外实验研究

目的 研究与胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGF-BP2)对胶质瘤的抑制作用.方法 化学合成3条针对IGF-BP2的siRNA和1条阴性对照siRNA,采用小分子干扰RNA技术使胶质瘤U251细胞的IGF-Bit2基因沉默.通过逆转录PCR和免疫组化的方法检测IGF-BP2的表达,用MTT法检测干扰后U251细胞的增殖活性变化.结果 逆转录PCR检测表明转染后24 h IGF-BP2的mRNA表达明显降低,空白对照、阴性对照、脂质体、siRNA1、siRNA2、siRNA3组中IGF-BP2 mRNA水平分别为:0.88±0.02,0.87±0.03,0.84±0.02,0.65±0.03,0.55±0.04和0.64±0.02.48 h分别为0.93±0.04.0.90±0.04,0.93±0.03,0.76±0.04,0.58±0.03和0.75±0.02,72 h为0.95±0.04,0.95±0.03,0.94±0.02,0.78±0.05,0.60±0.02和0.76±0.03.3条siRNA中siRNA2作用最显著.免疫组织化学方法检测表明IGF-BP2的蛋白表达阳性率也由92.3%明显降低至24 h的15%,至48 h为52.5%,仍低于正常胶质瘤细胞.RNA干扰后胶质瘤细胞的MTT值虽在缓慢升高,于24 h相对于对照组差异无统计学意义,但至48 h和72 h均低于对照组(P＜0.05).结论 理想的IGF-BP2小分子干扰RNA序列能够抑制该基因的mRNA和蛋白的表达并能抑制胶质瘤细胞的增殖活性.     

siRNA沉默USP22基因对胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的探讨小干扰RNA(si RNA)沉默泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific protease 22,USP22)对胶质瘤细胞增殖的影响和作用机制。方法合成USP22 si RNA及阴性对照si RNA(control si RNA),用脂质体Lipofectamine 2000转染至人胶质瘤U87和U251细胞,分别设为实验组和阴性对照组。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测两组胶质瘤细胞USP22 mRNA和蛋白表达水平的变化。采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测USP22 si RNA对两组胶质瘤细胞的增殖抑制率。流式细胞术定量检测USP22 si RNA对胶质瘤细胞凋亡及细胞周期分布的影响。Western blot检测胶质瘤细胞凋亡蛋白和周期调控蛋白的表达。结果与阴性对照组比较,实验组胶质瘤细胞中USP22 mRNA和蛋白表达显著下降(P0.05),细胞增殖明显受到抑制(P0.05),凋亡率明显上升(P0.05),细胞周期中G2/M期的细胞比例明显增高(P0.05)。Western blot结果显示:细胞凋亡蛋白Procaspase-3、Procaspase-8、Procaspase-9表达明显下降(P0.05);细胞周期蛋白CDK1、CDK2、Cyclin B1表达水平明显下降(P0.05),Cyclin D1表达水平无明显变化(P0.05)。结论 USP22基因在胶质瘤细胞的增殖中发挥重要作用,其机制可能为调节细胞凋亡和细胞周期。     

STAT3反义寡聚核苷酸对人脑胶质瘤细胞系U251细胞侵袭和凋亡的影响

目的 探讨敲低信号转导及转录活化因子3(STAT3)表达对人胶质瘤细胞系U251细胞功能的影响及相关作用机制. 方法 脂质体介导STAT3反义寡聚核苷酸转染人胶质瘤细胞系U251细胞,同时设无义序列组和空白对照组,48 h后MTT检测STAT3反义核苷酸对U251细胞增殖的影响,流式细胞仪检测各组细胞周期、细胞凋亡的变化,Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力,Western blotting检测STAT3和磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达水平. 结果 与空白对照组、无义序列组比较,STAT3反义核苷酸组细胞的相对存活率降低,G1/G0期细胞比例、细胞凋亡增加,Transwell实验显示滤膜细胞数明显减少,STAT3、pSTAT3、uPAR和Bcl-2蛋白的表达降低、Bax蛋白表达增加,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 反义STAT3可能通过调节相关基因表达抑制U251细胞侵袭能力并诱导其调亡,STAT3可作为胶质瘤基因治疗的有效靶点.