骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架异位构建组织工程化软骨的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与软骨脱细胞基质多孔支架(cartilage ECM-derived porous scaffold,CEDPS)在裸鼠体内异位构建软骨的可行性,并建立利用PKH26荧光和分子荧光活体成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况的新方法.方法 PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs,接种入CEDPS支架,体外进行电镜、Desd/Live荧光染色观察,然后植入裸鼠背部,4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测,与荧光图像比较.结果 体外培养的BMSCs-CEDPS复合体电镜检查结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞基质分泌增加,Dead/Live染色表明BMSCs在支架内部活性良好.4周后活体荧光示踪显示BMSCs在支架内生长良好,无扩散趋势,BMSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织,番红"O"、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的BM-SCs.结论 利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织.PKH26标记与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归.     

脱细胞软骨基质来源的多孔支架复合山羊髓核细胞体内初步构建组织工程髓核的实验研究

[目的]探讨脱细胞软骨基质多孔支架复合PKH26标记的山羊髓核细胞体内异位构建组织工程髓核的可行性.[方法]制备脱细胞软骨基质来源的多孔支架,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察、天狼星红染色、HE染色观察、MTT毒性检测;分离山羊髓核细胞,通过倒置显微镜观察、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色进行鉴定;将PKH26标记的山羊髓核细胞接种支架上,体外培养3d后进行LIVE/DEAD活性染色,将细胞支架复合物置入裸鼠皮下,培养6周,病理切片,荧光显微镜下观察,进行番红O、Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫组化染色.[结果]扫描电镜观察支架孔隙相连通且分布均匀,天狼星红染色支架呈黄绿相间色,HE支架淡染,MTT检测细胞增殖曲线无统计学差异(P＞0.05);P1代髓核细胞呈软骨样细胞形态,番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色均阳性,PKH26标记后的细胞呈红色荧光;体外LIVE/DEAD染色细胞呈绿色荧光,体内培养6周后,带红色荧光的细胞填满支架孔隙,番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组化染色弱阳性.[结论]以脱细胞软骨基质多孔支架复合山羊髓核细胞在体内能够形成组织工程髓核样组织.     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

脱细胞软骨细胞外基质取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的实验研究北大核心CSCD

目的探讨脱细胞软骨细胞外基质(acellular cartilage extracellular matrix,ACECM)取向支架复合软骨细胞构建组织工程软骨的可行性。方法取市售猪关节软骨组织,分离培养关节软骨细胞并传代。取第3代软骨细胞行PKH26荧光标记,MTT检测标记对细胞增殖无影响后,分别取标记及未标记的软骨细胞复合ACECM取向支架并体外培养后,大体观察支架形态,倒置显微镜、荧光显微镜观察软骨细胞在支架中的黏附、生长和分布情况,扫描电镜观察支架中细胞形态,Ⅱ型胶原免疫荧光染色观察软骨细胞外基质分泌情况。将PKH26标记的软骨细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下腔隙,术后观察裸鼠一般情况,4周后分子荧光活体成像系统无创伤性评估细胞-支架复合物生长情况,取材行大体观察以及番红O、甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察,评价形成软骨组织的能力。结果细胞-支架复合物体外培养7 d,大体观察呈半透明并具有一定硬度;倒置显微镜和荧光显微镜观察软骨细胞在支架上能良好黏附生长,并沿支架管道方向生长,分泌Ⅱ型胶原。细胞-支架复合物植入裸鼠皮下后,分子荧光活体成像系统观察示细胞均存活;术后4周,大体观察见复合物呈类软骨样组织,组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示细胞周围软骨细胞外基质分泌,可见"陷窝"样结构形成。结论 ACECM取向支架有利于软骨细胞的黏附、增殖及取向性分布类似于正常软骨结构,并在裸鼠皮下成功异位构建组织工程软骨。     

人关节软骨脱细胞基质的制备

目的制备人关节软骨脱细胞基质。方法切取人关节软骨,对之冷冻干燥后,采取化学去污剂TritonX100及DNA酶和RNA酶等试剂制备脱细胞的人关节软骨。做HE、番红0及软骨蛋白聚糖(aggrecan)免疫组化染色等方法进行检测。结果HE染色、番红0染色均显示细胞陷窝内己无细胞结构番红花0染色阳性;软骨蛋白聚糖免疫组化染色阳性。结论人关节软骨冻干后,经去污剂酶等处理方法可脱去软骨的细胞成分,并且保留了软骨细胞外基质,成功制备了人关节软骨脱细胞基质。     

软骨脱细胞基质复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的实验研究

[目的] 探讨软骨脱细胞基质支架材料的制备,及其体外复合脂肪源性干细胞构建软骨组织的技术方法.[方法] 成年新西兰大白兔脂肪源性干细胞获得,培养,扩增.成年新西兰大白兔新鲜软骨,低温冻干12 h,后经曲拉通、DNA、RNA酶等处理制备成为软骨脱细胞基质支架材料,终浓度为2×107/L的脂肪干细胞种植于软骨脱细胞基质中于软骨细胞方向诱导培养基中培养2周,构建软骨组织.新鲜制备的软骨脱细胞基质及构建的软骨组织分别行组织学、免疫组织化学及透射电镜检测.[结果] 实验制备的软骨脱细胞基质支架材料内无细胞结构存在,仅残留空白软骨陷窝.具有合适的孔隙率和孔径大小;复合脂肪源性干细胞后细胞向材料内部迁移,粘附,生长良好.部分载体内细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性.[结论] 软骨脱细胞基质可作为支架材料应用于软骨组织工程,复合脂肪源性干细胞培养可成功构建软骨组织.     

软骨脱细胞基质修复兔膝关节软骨缺损的实验研究

目的观察软骨脱细胞基质对兔膝关节软骨缺损的修复作用。方法取兔膝关节软骨片进行脱细胞处理,并通过HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化染色、扫描电子显微镜评价软骨脱细胞的程度。对兔膝关节软骨面造成直径4 mm、深3 mm骨软骨全层缺损,根据是否在缺损处加入脱细胞软骨分为实验组和对照组,12周后通过HE染色、番红固绿染色来观察膝关节缺损的修复程度。结果 HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化染色、扫描电子显微镜结果验证了软骨几乎完全脱去细胞和DNA,并基本保留了糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型胶原的含量,为细胞的长入提供了良好的环境。手术12周后实验组缺损部位较对照组修复完整,HE染色、番红固绿染色可见骨与软骨分界明显,连接完整,且新生软骨有较高的GAG含量。结论软骨脱细胞基质对于兔膝关节软骨缺损有一定的修复作用。     

PKH26与BrdU体外双重标记兔BMSCs在心肌补片中的实验研究

目的观察PKH26与BrdU体外双重标记兔BMSCs的生物学特性,并体外构建组织工程心肌补片。方法取6月龄新西兰大白兔分离培养BMSCs,并用细胞膜荧光染料PKH26和细胞核标记物BrdU对BMSCs进行标记,通过倒置相差显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、MTT法观察细胞生长状态和荧光标记前后细胞生物学特性的变化;ALP、茜素红、油红O染色及骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白等免疫细胞化学技术检测,观察和评价标记前后BMSCs体外分化为成骨细胞和成脂细胞的能力。将标记细胞与小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)复合后共培养5～7d构建组织工程心肌补片,在倒置相差显微镜、荧光显微镜和扫描电镜下观察细胞在SIS上的生长情况,并做活体及石蜡包埋HE染色观察。结果标记后细胞生长状态良好,基本生长特性无明显改变;荧光显微镜下可见标记后细胞膜上红色荧光呈颗粒状分布;细胞表面干细胞标志性抗原表达与标记前无明显差异。标记后的BMSCs成骨诱导后,ALP、茜素红染色阳性,细胞表达骨钙素及Ⅰ型胶原蛋白;成脂诱导后,细胞胞浆内出现明显的脂滴。标记细胞与SIS共培养5～7d后,标记细胞生长状态良好,在材料上呈现出多层细胞结构。活体及石蜡包埋后HE染色可见细胞生长状态良好。结论兔BMSCs能被PKH26和BrdU稳定标记;标记的细胞在体外具有自我更新和多向分化的能力;标记的BMSCs与SIS体外复合培养可以构建组织工程心肌补片。     

基于细胞外基质来源的组织工程椎间盘双相支架裸鼠皮下异位构建椎间盘

[目的]探讨椎间盘细胞和细胞外基质来源的一体化纤维环-髓核双相支架在裸鼠体内异位构建组织工程一体化椎间盘的可行性,并采用PKH26荧光标记和小动物活体荧光成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况。[方法]纤维环细胞和髓核细胞分别标记PKH26荧光,分别接种入细胞外基质来源的一体化支架不同相中,扫描电镜、Dead/Live荧光染色观察细胞粘附及活性,植入裸鼠背部皮下,6周后利用分子小动物活体荧光成像系统评价组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行荧光显微镜下观察、组织学染色。[结果]扫描电镜观察细胞粘附在双相支架上且周围有基质分泌,Dead/Live染色示细胞在双相支架上活性良好;6周后,活体荧光成像显示椎间盘细胞在支架内生长良好,从髓核往纤维环荧光强度减弱,细胞支架复合体在裸鼠体内形成椎间盘样组织,HE、番红O染色、甲苯胺蓝染色阳性。[结论]天然骨基质明胶和软骨基质来源的一体化纤维环-髓核支架复合椎间盘细胞能够在裸鼠皮下异位构建椎间盘样组织。     

激光打孔脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞构建组织工程气管软骨

目的探索激光打孔脱细胞基质诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)于动物体内构建组织工程气管软骨的可行性。方法应用激光打孔联合脱细胞技术制备激光打孔脱细胞基质(LDTM)作为支架材料。抽取兔骨髓,分离培养BMSCs,接种于LDTM支架后植入兔皮下。体内培养12周后,行大体观察、组织学检测、生物力学及生物化学定量检测。结果细胞均匀分布在激光微孔和支架表面,并且该复合物能够较好地维持原始的管状结构,形成了富有弹性的瓷白色软骨样组织。HE染色可见典型的软骨陷窝出现,说明成熟软骨组织形成。Safranin-O染色证实有蛋白聚糖基质产生。生物力学和生物化学检测显示新生气管组织均接近正常气管组织。结论 LDTM可以促进软骨再生并在动物体内诱导BMSCs构建组织工程气管软骨。     

软骨脱细胞基质支架材料的软骨组织工程实验研究

目的应用软骨脱细胞基质作为支架材料，按照组织工程的原理再生软骨，为修复软骨缺损探索新的途径。方法取新西兰大耳白兔1只，体重2．4kg，按改良Courtman法对兔耳软骨行脱细胞处理后用于实验。选用纯种6月龄新西兰大耳白兔18只，雌雄不限，体重2．4～2．6kg。每只耳形成2处1cm×1cm软骨缺损，按修复方式不同随机分为3组，每组24处缺损。A组，软骨脱细胞基质加软骨膜；B组，软骨脱细胞基质；C组软骨膜，作为对照。术后每日观察兔耳修复区的大体变化，并分别于4、12周每组处死3只动物，于修复区切取标本，行HE染色、藏红花红一奥尔新蓝染色、II型胶原基因探针原位杂交实验。结果术后4周内A、B组大体形态无明显改变；术后12周可见修复区轻度增厚，触摸时质地较正常软骨稍硬。C组术后2周，2只2处修复区形成痂皮，术后5周痂皮脱落形成穿孔。术后4周，A、B组HE染色可见软骨脱细胞基质周边有轻度的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，未形成包囊，藏红花红．奥尔新蓝染色均阴性；C组软骨缺损处的软骨膜塌陷，无细胞增殖现象；各组修复区均未见II型胶原基因探针原位杂交显色。术后12周，A组HE染色示部分软骨脱细胞基质内有新生细胞，细胞排列不规律，ECM嗜碱性增强，藏红花红-奥尔新蓝染色呈阳性，II型胶原基因原位杂交显色示新生细胞内均有大片棕黄色阳性染色区域；B组HE染色示软骨脱细胞基质无吸收现象，周边无包囊，炎性细胞消失，藏红花红一奥尔新蓝染色呈阴性，未见II型胶原基因原位杂交显色；C组HE染色示近软骨断端处可见部分形成新生组织，藏红花红一奥尔新蓝染色呈阳性，II型胶原基因原位杂交显色可见棕黄色阳性染色细胞。结论脱细胞软骨可诱导软骨膜细胞向其中生长而重建软骨，软骨膜和脱细胞软骨复合移植是软骨组织工程的另一种选择。     

PKH26标记结合活体荧光成像技术在椎间盘组织工程研究中的应用

目的体外评估PKH26标记对山羊髓核细胞生物学功能的影响,并结合活体荧光成像系统评价种子细胞在裸鼠体内的生物学行为。方法取1岁龄山羊椎间盘分离髓核组织,通过酶消化法获取原代细胞,倒置相差显微镜下观察,传代获取第1代髓核细胞,行PKH26荧光标记,荧光显微镜下观察标记后的细胞荧光强度,并行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色观察,锥虫蓝染色比较标记前后细胞活性,MTT法检测标记前后细胞增殖特性,实时荧光定量PCR检测细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖基因表达。将标记后的髓核细胞接种至一体化纤维化-髓核支架的髓核部分,纤维环部分作为阴性对照,体外培养3 d后植入5只6周龄雄性裸鼠体内,培养6周后活体成像技术检测髓核细胞-支架复合物在体内的荧光强度及范围。结果倒置相差显微镜观察示原代髓核细胞簇状生长,呈卵圆形,第1代髓核细胞呈类软骨样细胞形态;标记后的第1代髓核细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性;标记后荧光强度均匀,标记前后细胞活性均在95%以上;标记前后细胞生长曲线比较差异无统计学意义(P>0.05);实时荧光定量PCR检测示标记前后细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。活体成像技术显示体内髓核支架有强烈荧光,纤维环支架未见荧光。结论 PKH26标记对髓核细胞的活性、增殖及细胞表型的表达无明显影响,结合体内活体荧光成像系统可以追踪细胞在体内的生物学行为。     

真皮脱细胞基质微载体构建可注射软骨的初步研究

目的探索真皮脱细胞基质微载体构建可注射软骨的可能性。方法将分离培养得到的软骨细胞与真皮脱细胞基质微载体混合培养24 h后分为两组,分别在三维动态系统(实验组)与静态系统(对照组)下培养。体外培养2周、4周分别进行扫描电镜观察,体外培养4周行活死细胞染色观察。体外培养4周后将软骨细胞微载体复合物植入裸鼠皮下,8周后取材进行大体观察、HE染色和番红固绿染色观察。结果体外培养2周、4周时电镜结果显示,实验组与对照组均发生细胞增殖与细胞外基质的分泌,实验组更明显。体外培养4周,活死细胞染色结果显示,实验组软骨细胞活力较好,与微载体结合更充分,细胞进入微载体内部,而对照组软骨细胞仅黏附于微载体表面。体内培养8周,两组组织块大体观无明显差异;组织学染色显示实验组形成连续软骨细胞陷窝,对照组软骨陷窝呈岛状,实验组形成软骨更成熟。结论真皮脱细胞基质微载体复合软骨细胞可以实现可注射软骨的构建,且动态培养效果优于静态培养。     

磁标记猪骨髓间充质干细胞自体肝内移植后MR活体示踪研究

目的探讨利用磁共振成像对移植肝脏的磁标记猪骨髓间充质干细胞进行活体示踪的可行性。方法获取猪自体骨髓间充质干细胞，分离、培养、扩增。应用菲立磁（Feridex）标记细胞，普鲁士蓝染色鉴定，标记细胞组（n=6）和未标记细胞组（n=4）行经门静脉行肝内移植，分别于移植前，移植后6h、3d、7d行磁共振T1WI，T2WI，GRE序列成像，7d后行组织切片普鲁士蓝染色。结果：普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达接近100％，磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T2＊WI序列呈明显低信号改变，并持续至细胞移植后7d，组织切片普鲁士蓝染色显示7d后肝内仍有移植的磁标记细胞存在于肝实质及肝窦中。结论利用SPIO可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞，磁共振成像可以对经门静脉移植到肝内的磁标记MSCs进行活体示踪。     

急性肝损伤后猪自体骨髓间充质干细胞肝内移植的MR活体示踪实验研究

目的 探讨应用临床型1.5T磁共振活体示踪磁标记猪骨髓间充质干细胞(MSCs)自体移植肝脏的可行性.方法 获取、分离、培养、扩增猪骨髓MSCs.应用菲立磁标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定,建立急性肝损伤模型,分为标记细胞组(n=6)和未标记细胞组(n=4)经门静脉行肝内移植,分别于移植前,移植后6 h、3 d、7 d、14 d行磁共振FFE(T_2WI)序列成像,14 d后行组织切片普鲁士蓝染色.结果 普鲁士蓝染色表明MSCs的标记率达100%,磁标记MSCs肝内移植后行磁共振T_2WI序列呈明显低信号改变,并持续至细胞移植后14 d,组织切片普鲁士蓝染色显示14 d后仍有磁标记细胞存在于肝实质及肝窦中.结论 利用菲立磁可以在体外成功标记猪骨髓间充质干细胞,磁共振成像可以对经门静脉移植到肝内的磁标记MSCs进行活体示踪.     

基于心脏全器官脱细胞基质的组织工程支架材料制备与生物学评价北大核心CSCD

目的探讨一种心脏全器官脱细胞方法,并对制备的心脏脱细胞基质支架进行检测与评价。方法通过联合使用胰蛋白酶、Triton X-100等洗涤剂,对成年SD大鼠离体心脏进行主动脉逆行灌流脱细胞处理。对制备的心脏脱细胞基质支架进行大体观察、甲苯胺蓝灌流染色、HE染色、扫描电镜观察、阿利新蓝染色、细胞外基质组分免疫组织化学染色等观察。结果成功制备心脏全器官脱细胞基质支架材料,其保留了原心脏的大体形态;HE染色、甲苯胺蓝染色及扫描电镜观察显示其保留了较好的脉管结构与超微空间构象;阿利新蓝染色及免疫组织化学染色结果显示,其主要的细胞外基质成分,包括Ⅰ型胶原、糖氨聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白保留良好。结论制备的大鼠心脏脱细胞基质支架保留了心脏原有的结构与细胞外基质成分,有望作为全器官心脏体外再造的良好组织工程支架材料。     

组织工程骨一软骨复合组织体内异位移植的研究

目的：本实验构建组织工程骨软骨复合组织并采用异体异位移植方式,探讨外来因素对移植物的影响,为进一步研究奠定基础。方法：制备明胶一硫酸软骨素一透明质酸及明胶一陶瓷化骨多孔复合支架,复合软骨细胞和骨髓间充质干细胞,将上述组织按照体外培养时间不同分为4纽,植入裸鼠皮下,观察复合组织形成情况。结果：各实验纽在观察期内裸鼠背部均无感染,复合组织表面完整薄层纤维层下可见类似透明样软骨组织,体积均出现不同程度的收缩。HE染色各实验组均可发现,在软骨层和骨层,分别可见成软骨细胞、软骨细胞、骨细胞及相应的细胞外基质,且可以观察到类似正常结构的潮线出现,交界区软骨组织出现骨化,在组织外围,出现了不同程度向纤维样组织转变的现象。结论：经过体外短时间的诱导使得细胞具有分化趋势后,早期植入体内有助于组织工程骨一软骨复合组织的形成。     

PKH26标记法在组织工程神经种子细胞体内示踪中的应用

目的 探讨PKH26标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)的效果及其应用于组织工程神经种子细胞体内示踪实验的可行性.方法 取Wistar大鼠股骨和胫骨的骨髓,用全骨髓贴壁的方法分离、培养BMSCs.用PKH26荧光染料进行标记,荧光显微镜下观察标记效果,流式细胞仪检测荧光标记率,MTT法测定细胞的活性,体外成脂和成骨诱导鉴定细胞的分化能力,并与未标记细胞进行比较;使用显微注射的方法将BMSCs植入去细胞神经支架内制备成组织工程神经,于体外培养3 d、5 d、7 d、14 d,行组织切片,观察BMSCs在支架内存活、迁移的情况.另外,将体外构建组织工程神经桥接Wistar大鼠坐骨神经15 mm的缺损,于术后1周、4周、6周、8周取出移植物,行组织切片观察植入的BMSCs在支架内的存活情况.结果 PKH26能有效地标记BMSCs,标记率达95%以上,标记后细胞活性及诱导成骨成脂分化能力与未标记细胞无明显差异.在体外培养的环境下,BMSCs能在去细胞神经支架里粘附生长,并沿着支架迁移;在体内外周围神经再生的微环境下,BMSCs可存活8周以上.结论 PKH26荧光染料标记法是一种有效的标记BMSCs的方法,可用于组织工程神经种子细胞体内示踪的研究.     

一种优化的猪骨骼肌来源无细胞基质支架材料制备方法及鉴定

目的探讨一种优化的猪骨骼肌脱细胞制备方法,以期制备理想的猪骨骼肌来源无细胞基质(decellularized porcine muscle tissue,DPMT)支架材料。方法取市售新鲜健康成年家猪腰部骨骼肌组织,采用匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方案制备DPMT。行组织学观察脱细胞、脱脂效果,天狼猩红染色分析胶原成分,扫描电镜观察材料内部微结构;测定材料中DNA含量及总蛋白质含量。取人脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)、小鼠成纤维细胞(NIH3T3)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),置于不同浓度DPMT浸提液中,培养后第1、3、5天采用细胞计数试剂盒8法测算细胞相对增殖率,评价材料细胞毒性;通过DPMT表面接种HUVECs体外共培养3 d后,行活死细胞染色评价其体外细胞相容性。采用SPF级雄性SD大鼠建立DPMT大鼠背部皮下植入模型,于植入3、7、14、28 d取材,大体观察材料降解情况,并测量其横径;行HE染色和CD31免疫组织化学染色观察其生物相容性和血管新生情况。结果匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方法操作简便,制备DPMT仅需1 d时间;检测显示DPMT脱细胞、脱脂完全,主要成分为Ⅰ型胶原及Ⅳ型胶原;DPMT中DNA含量为(15.902±1.392)ng/mg干重,总蛋白质含量占其干重的68.94%,显著低于新鲜猪骨骼肌组织[分别为(140.724±10.422)ng/mg干重及93.14%](P0.05);DPMT内部呈均质疏松网状结构。体外细胞相容性实验显示DPMT细胞毒性评级均为0~1级,HUVECs在DPMT表面能稳定生长。DPMT大鼠皮下植入后14 d内可保持大体结构的稳定性,至28 d时完全降解;炎性反应在3 d时最明显,7 d时明显减轻,两时间点炎性细胞数量比较差异有统计学意义(P0.05);植入后7 d即可见DPMT内部新生血管环结构形成,14 d时新生血管环数量显著增加,比较差异有统计学意义(P0.05)。结论匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方案省时高效、可重复性佳,所制备的DPMT脱细胞、脱脂完全,蛋白质成分保存良好,具有良好的体内外生物相容性,且可能具有一定诱导血管新生潜能。     

人脐血间充质干细胞(hUCMSCs)复合PHAs生物材料诱导软骨再生的研究

目的:研究人脐血间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)经基因诱导成软骨后复合支架材料,构建组织工程软骨,探究软骨再生过程中,移植物在宿主体内的营养代谢及宿主免疫反应。方法:从人脐带血中分离、扩增、培养人脐血间充质干细胞并鉴定;在倒置相差显微镜观察细胞的形态,成软骨诱导后复合支架载体,体外共培养1周,植入SD大鼠体内,分时段取材(7d,14d,28d)后,进行大体形态学观察,组织化学染色、软骨特异性基质成分蛋白多糖及Ⅱ型胶原纤维的表达变化检测;对照组SD大鼠移植同种异体胸骨剑突软骨;空白对照组SD大鼠不做任何处理。结果:HE染色结果显示:实验组和对照组炎症反应未见明显差异。大体形态学观察及组织学染色结果均显示,实验组28d左右可见成熟软骨形成。糖蛋白多糖检测结果显示新生软骨组织在实验组和对照组无显著差异。宿主表现为局部的纤维囊壁包裹弱炎症反应。结论:hUCMSCs构建的组织工程软骨,软骨再生情况良好,支架材料按时吸收,宿主弱免疫反应,在干细胞治疗软骨缺损方面显示出了一定的临床潜力。