秦皇岛市海产品贝类中诺如病毒监测分析

目的了解秦皇岛市海产品中血蚶、牡蛎、海虹受诺如病毒污染情况,检测3种贝类带毒率,对检测出的诺如病毒进行GⅠ和GⅡ分型。建立Mengo病毒作为阳性质控检测病毒回收率方法。方法蛋白酶水解法富集病毒,全自动核酸提取仪提取病毒RNA,实时荧光定量PCR方法对诺如病毒进行检测和分型,用Mengo病毒做标准曲线,检测诺如病毒回收率。结果 Mengo病毒回收率均1%符合富集要求,检测牡蛎、海虹、血蚶各20份,检出诺如病毒阳性样本11份,其中GⅠ型1株,GⅡ型10株,总检出率为18.33%。牡蛎、血蚶均检出GⅡ型毒株,检出率分别为30.00%、5.00%,海虹检出GⅠ型和GⅡ型毒株,检出率分别为5.00%和15.00%。结论 3种贝类产品均受到诺如病毒不同程度的污染,GⅡ毒株含量较多,牡蚶和海虹受到污染较为严重。     

实时逆转录环介导等温扩增检测GⅡ.4型诺如病毒的研究

目的建立快速检测诺如病毒GⅡ.4型的实时逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。方法选取GⅡ.4型诺如病毒的ORF1与ORF2接头处较为保守的基因序列设计RT-LAMP引物并进行筛选,优化反应条件,分析方法的灵敏度、分析特异性和稳定性,采用优化的方法检测40例临床病毒性腹泻样本,结果与实时荧光逆转录PCR(RT-PCR)比较。结果该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP的最佳反应温度为65℃;该方法检测GⅠ型和GⅡ非诺如病毒4型、轮状病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒、CA16、EV71、CA6和CA10等常见10种其他腹泻病毒的结果为阴性;该方法对诺如病毒GⅡ.4型的检测能力与实时荧光RT-PCR相当;与实时荧光RT-PCR相比,该研究建立的RT-LAMP法检测诺如病毒GⅡ.4型阳性样本和诺如病毒阴性样本的符合率为100%。结论该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP快速检测方法灵敏度高,特异性好,为建立诺如病毒其他基因型的RT-LAMP检测方法奠定了基础。     

实时荧光定量PCR联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法建立与应用

目的建立实时荧光定量PCR法联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒和副溶血性弧菌tlh基因设计特异性引物。通过调整引物浓度和优化反应条件,建立多重荧光定量PCR检测体系,对方法的灵敏度和特异性进行验证。结果多重荧光定量PCR检测方法对诺如病毒、副溶血性弧菌、轮状病毒、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌O157等样本进行检测,未发生交叉反应。结论本研究建立的实时荧光定量PCR法同时检测诺如病毒和副溶血性弧菌灵敏度高、特异性好,能用于食品携带病原微生物和感染性腹泻暴发中诺如病毒和副溶血性弧菌的检测。     

GⅠ和GⅡ型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测

目的 建立应用Allglo探针同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重荧光反转录\聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法 设计针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒开放阅读框架ORF1及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系;对该方法的特异性、抗干扰性、灵敏度进行评估,对96份临床粪便标本进行检测、测序分析.结果 该方法特异性强,与轮状病毒、扎如病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应;同一体系下GⅠ或GⅢ型诺如病毒相互之间没有干扰;最低检测限均为10 copies/μL;对96份临床粪便标本进行检测,结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100％,且测序结果显示目标序列正确.结论 本研究建立的Allglo探针法检测GⅠ和G Ⅱ型诺如病毒技术特异性好,灵敏度高,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查.     

单管多重荧光定量RT-PCR方法鉴别A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型

目的建立能同时检测A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法。方法分别选用轮状病毒NSP3基因、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型orf1与orf2基因中的64 bp、90 bp和185 bp片段作为荧光定量PCR检测的靶标,设计引物和Taq Man探针,构建标准品,绘制标准曲线,评价检测方法的重复性、特异度和灵敏度,并对138份粪便标本进行检测及测序验证。结果 3种病毒对应的标准曲线分别为:轮状病毒:y=-3.9lgx+41.204;诺如病毒GⅠ型:y=-3.06lgx+40.716;诺如病毒GⅡ型:y=-3.29lgx+41.538,质粒标准曲线的方差系数为0.997,灵敏度达到每个反应102copy/μl,特异度强。138份样本中检出A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的检出率分别为32.6%、5.8%和26.1%,与基因测序比对结果相符。结论构建可用于A组轮状病毒及诺如病毒GⅠ型和GⅡ型的多重荧光定量RT-PCR方法快速、特异且灵敏,可用于临床病原诊断和流行病学调查。     

广东省市售牡蛎中诺如病毒污染调查

目的 调查广东省地区市售牡蛎中诺如病毒污染状况并对阳性株进行鉴定、分型,为控制和预防因食用牡蛎而引起诺如病毒胃肠炎提供基础数据。方法 应用实时荧光定量RT-PCR,对2016年1月 - 2017年12月期间在广东省8个城市收集的290份牡蛎样品进行诺如病毒定性和定量检测,并对不同季节、城市及采样点诺如病毒的污染情况及基因分型情况进行比较。结果 290份牡蛎样品的诺如病毒总检出率为为17.20%(50/290),不同季节的诺如病毒污染率分别为春12.50%、夏6.90%、秋18.30%和冬30.70%;从病毒污染的不同基因型分析,GⅠ诺如病毒检出率为6.20%,GⅡ型诺如病毒检出率为11.00%。结论 广东省市售牡蛎存在诺如病毒污染,且污染具有季节特点,以冬季污染较严重,具有较高引起食源性胃肠炎疾病感染的风险,其基因型以GⅡ型为主。     

宁波市食源性腹泻患者诺如病毒感染情况调查

目的了解宁波市食源性腹泻患者诺如病毒感染情况,为预防控制工作提供依据。方法于2013—2015年采集宁波市10家医院门诊接诊的食源性腹泻患者发病3d内的粪便标本2 129份,采用实时荧光定量PCR法检测诺如病毒核酸并进行分型,分析不同时间、不同年龄和性别腹泻患者粪便标本的诺如病毒检出率。结果共检出诺如病毒核酸阳性113份,检出率为5.31%;GⅠ型、GⅡ型和GⅠ+GⅡ混合型3种感染模式的检出率分别为0.33%、4.88%和0.09%。2013—2015年各年检出率分别为4.58%、6.16%和4.90%,检出率未见随时间变化趋势(P0.05)。0岁~、3岁~、5岁~和18岁~组患者诺如病毒检出率分别为11.48%、17.24%、12.22%和4.16%,差异有统计学意义(P0.05)。冬春季(10月—次年3月)检出率为14.75%,高于夏秋季(4—9月)的2.89%(P0.05)。结论宁波市诺如病毒引起的食源性腹泻在冬春季高发,以GⅡ型诺如病毒为主,主要感染对象为婴儿和低年龄儿童。     

2014年厦门地区市售牡蛎诺如病毒污染状况调查分析

目的调查2014年厦门地区市售牡蛎中GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的污染状况,为食用诺如病毒污染的牡蛎引起的胃肠炎提供预警信息和防控建议。方法 2014年1月-2014年11月对厦门地区市售牡蛎进行连续采样,利用实时荧光定量RT-PCR法对样品中诺如病毒进行检测,确定牡蛎中诺如病毒污染状况及基因型分布状况。结果 198份牡蛎样品中诺如病毒总检出率为22.7%,GⅠ型No Vs检出率为6.1%,GⅡ型No Vs检出率为9.1%,GⅠ型和GⅡ型No Vs同时检出率为7.1%;消化腺中诺如病毒RNA载量水平为400 copy/g~485 000 copy/g,均值为9 500 copy/g。结论 2014年厦门地区市售牡蛎的诺如病毒污染情况较严重,GⅠ型和GⅡ型No Vs均有污染,建议相关部门采取措施,降低人群感染诺如病毒的风险。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan-MGB探针,调整引物、探针浓度,优化最佳反应条件,建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系,进行灵敏度、特异性、稳定性试验,以评价反应体系,并与引物P289/P290常规RT-PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测时限短,仅1h就出结果;最低检出下限为100拷贝/mL,比引物P289/P290常规RT-PCR灵敏度高100倍;与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应;4份核酸含量不同的标本重复检测5次,平均Ct值变异系数范围0.96%～2.27%。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好,可应用于突发公共卫生应急检测,提高快速检测能力。     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒

目的建立基因Ⅱ型诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并应用于临床标本的检测。方法二氧化硅法提取粪便中的病毒RNA,使用针对基因Ⅱ型诺如病毒N/S结构域的引物和探针建立荧光定量PCR方法,对罗城县急性胃肠炎疫情的34份标本进行检测,并与常规RT-PCR和ELISA检测结果比较;还用该法对2006年2月至2007年1月广西急性胃肠炎暴发及散发病例粪便样本305份做了临床检测。结果用实时荧光定量RT-PCR法成功地从罗城疫情样本中检测出基因Ⅱ型诺如病毒,实时荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和ELISA的检出率分别为为85.3%、76.5%和26.5%。而实时荧光定量RT-PCR对114份对急性胃肠炎暴发疫情及191份散发病例样本的基因Ⅱ型诺如病毒检出率分别为56.1%和23.6%。结论诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有快速、灵敏和特异的优点,不但能对标本中病毒浓度进行定量检测,还能鉴别诺如病毒基因型别。同时也发现基因Ⅱ型诺如病毒感染在广西急性胃肠炎暴发疫情和散发病例中较常见。     

荧光定量RT-PCR定量检测诺如病毒方法的建立及其评价

目的:建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒GⅠ、GⅡ的方法,以用于患者标本的检测、分型及绝对定量。方法:经过优化筛选出最佳反应体系及反应条件,建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的方法;制作两种不同型号的荧光定量PCR仪的绝对定量标准曲线,并从灵敏度、特异性、重复性、对患者标本检测能力等方面对建立的方法进行综合评价。结果:该方法在两种不同型号的仪器上对108~101copy/μl范围内的病毒,具有良好的线性关系,最低灵敏度为101copy/μl。与容易引起腹泻症状的轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒均无交叉反应;诺如病毒GⅠ、GⅡ两种常见感染人类的亚型之间无交叉反应。批内及批间重复性实验的标准差在0.10~0.59、变异系数在0.43%~2.84%之间,显示该方法重复性较好。用该方法共检测腹泻患者粪便标本181份,其中33份诺如病毒阳性,随机抽取10份阳性标本测序分析,结果证实均为诺如病毒。结论:本研究建立的诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法,灵敏度、特异性、重复性、对患者标本的检测能力等均显示较好的结果,且能快速区分GⅠ、GⅡ两种感染人类的重要亚型,在诺如病毒的快速检测中有着实际推广意义。     

一起急性胃肠炎暴发疫情中诺如病毒的分子流行病学分析

目的研究导致本次急性胃肠炎暴发疫情的诺如病毒的分子流行病学特征。方法对2015年2月7日北京市某旅行团急性胃肠炎暴发疫情病例标本进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测,并对感染病例的诺如病毒进行RNA依赖性RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)和VP1区基因序列的检测和分析。结果 18份便标本经Real-time PCR检出12份GⅡ型诺如病毒阳性标本,RdRp区和VP1区序列扩增各得到11条诺如病毒基因序列。根据RdRp区和VP1区系统进化分析证明感染病例的诺如病毒分型为GⅡ.17型。该病毒株与引起暴发疫情的诺如病毒GⅡ.17型新变异株珠海ZHITHC-12株高度同源,RdRp区和VP1区核苷酸差异分别为0%和0.1%,氨基酸差异均为0%。结论引发北京某旅行团旅客急性胃肠炎暴发疫情的病原体是引起中国2015年暴发流行的诺如病毒GⅡ.17型新变异株。     

GⅠ.P11-GⅠ.6型诺如病毒分子特征分析

目的 分析引起北京市丰台区某小学1起胃肠炎疫情的诺如病毒分型特征，为诺如病毒防控提供参考依据。方法 2021年10月在北京市丰台区某小学发生1起胃肠炎疫情，留取粪便标本做便常规检测和便隐血检测，并在便标本中提取核酸，使用荧光定量PCR技术进行诺如病毒核酸检测，采用一步法逆转录PCR扩增特异性核酸片段分析诺如病毒亚型。结果 共14例胃肠炎病例，14份粪便标本便常规结果正常，7份便隐血结果阳性，阳性率为50.0%。13份标本检测出诺如病毒阳性，基因型别为GⅠ.P11-GⅠ.6。结论 本次疫情检测出的诺如病毒型别引起的胃肠炎便隐血阳性率较高，超过其他文献报道的比率，并发现其在氨基酸水平上聚合酶区和VP1区都发生了关键位点的变异。需持续进行疫情监测和防控工作，以减少该类疫情的发生。     

RT-LAMP法对Ⅱ型诺如病毒的检测

目的在本实验室建立适合于基层使用的Ⅱ型诺如病毒快速检测方法 RT-LAMP法,并将其应用于临床病毒性腹泻的检测,为了解诺如病毒导致的病毒性腹泻在南京市的流行状况提供方法和数据。方法用实验室保存的诺如病毒阳性标本进行方法学建立,并收集南京地区某医院2011年秋冬因腹泻就诊并临床诊断为病毒性腹泻的57例成年人患者的粪便进行Ⅱ型诺如病毒检测,包括荧光定量PCR法及基于环的等温扩增(LAMP)法,并对检测为阳性标本核酸进行测序分析。结果所建立的Ⅱ型诺如病毒RT-LAMP法和荧光定量检测法均可以检测到稀释到10 000倍的阳性标本,即两种方法具有相同的敏感度。对于诺如病毒I型、甲肝病毒及乙肝病毒没有扩增,即对诺如病毒Ⅱ型的扩增具有特异性。57例临床粪便标本,荧光定量PCR法与RT-LAMP法均检测到6例Ⅱ型诺如病毒阳性病例,两种方法符合率为100%,经测序分析,5例为诺如病毒GⅡ.4亚型,1例为诺如病毒GⅡ.6亚型。5例GⅡ.4亚型分别来源于4个不同的流行株,3个国家和地区,巴西、俄罗斯和北京。结论南京地区2011年诺如病毒腹泻病例以GⅡ.4亚型为主要感染亚型,也有GⅡ.6亚型。结果提示该病毒传播范围的广泛性和流行病学防控的艰巨性。荧光定量PCR与RT-LAMP法都可以快速进行病原检测,但RT-LAMP法因其方法简易、不需要特殊仪器、结果直接肉眼观察而更适合基层使用。     

贝类中诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立实时荧光定量PCR法检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒的方法。对东海区域市场内零售贝类海产品中诺如病毒携带情况进行监测,为海产品食品安全和风险预警提供科学依据。方法采集浙江沿海地区市场上常见贝类,利用实时荧光定量PCR检测技术对贝类进行检测。结果 2 955份样品中有63份样品携带诺如病毒,其中杂色蛤、太平洋牡蛎、僧帽牡蛎、毛蚶中均检出GⅡ型诺如病毒。贝类样品中太平洋牡蛎的检出率最高,为15.64%。贝类中诺如病毒在冬季(11月-次年2月)的检出率明显高于夏季(6月-9月),其季节分布差异有统计学意义(χ~2=31.3,P0.05)。结论东海区域贝类中,特别是生食或半熟食贝类中诺如病毒的携带水平较高、分布较广,应持续做好贝类中诺如病毒携带监测,同时做好风险预警。     

一起GⅡ.17型诺如病毒引起的聚集性腹泻疫情报告

目的调查一起GⅡ.17型诺如病毒感染引起的聚集性腹泻疫情。方法收集该起疫情患者粪便标本,采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)检测诺如病毒核酸,阳性标本进行核苷酸序列测定并进行同源性分析。结果该起感染性腹泻疫情共36例患者,采集13例临床表现典型患者的粪便标本进行检测,诺如病毒核酸阳性8份,阳性率为61.54%。将5株测序成功序列进行比对,确定诺如病毒基因型为GⅡ.17型。与2014年中国香港分离的诺如病毒GⅡ.17型参考株Norovirus HK GⅡ.17 2014在同一个进化分支上,核苷酸序列同源性为99.3%~99.7%。结论本次疫情是由GⅡ.17型诺如病毒感染引起的聚集性腹泻疫情,应加强对此毒株的监测工作。     

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒

目的建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法。方法设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系。引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒。将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测。结果显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测。灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒。利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价。结果表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好。结论本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测。     

湖州市散发急性胃肠炎病例诺如病毒检测结果分析

目的分析湖州市散发急性胃肠炎病例诺如病毒感染的分子流行病学特征。方法选取2014年7月—2015年6月湖州市某哨点医院873例散发急性胃肠炎病例为研究对象,采用实时荧光定量RT-PCR方法对病例粪便标本进行诺如病毒核酸检测,选取部分阳性标本进行核苷酸序列测定,确定诺如病毒基因型并作流行病学分析。结果 873份腹泻粪便标本,检出诺如病毒核酸阳性256份,阳性率为29.32%;其中GⅠ型2份,GⅡ型254份。选取核酸浓度较高的169份PCR扩增阳性产物进行序列分析,结果显示:2株GⅠ型诺如病毒分属于GⅠ.7和GⅠ.Pb/GⅠ.6基因型;167株GⅡ型诺如病毒共存在10种基因亚型,以GⅡ.P17/GⅡ.17(65.27%)和GⅡ.Pe/GⅡ.4(28.74%)基因型为主,其他基因型有GⅡ.21、GⅡ.3、GⅡ.2、GⅡ.6、GⅡ.7、GⅡ.13、GⅡ.P7/GⅡ.6和GⅡ.P12/GⅡ.4,重组株出现频率高。诺如病毒感染的发病高峰为10月至次年3月。结论诺如病毒是湖州市散发急性胃肠炎病例的主要病原菌之一,其中GⅡ.P17/GⅡ.17型是流行的优势株。     

福州市某医院急性腹泻病人诺如病毒检测分析

目的对福州市某综合医院疑似食源性腹泻病人粪便样本进行诺如病毒检测,了解其感染情况与流行特征。方法采集腹泻病人粪便样本,磷酸盐缓冲液处理后用试剂盒提取病毒核酸,用实时荧光定量PCR的方法检测。结果某医院2015年9月至2018年12月,共采集412份样本,诺如病毒检出率为16.8%(69/412),2015年为27.9%(17/61)、2016年为15.7%(14/89)、2017年为16.0%(23/144)、2018年为12.7%(15/118);各组诺如病毒检出率:GⅠ组为4.1%(17/412))、GⅡ组为13.6%(56/412)、GⅠ与GⅡ组同时阳性率1.0%(4/412);各年龄组人群皆可感染诺如病毒,21～30岁组人群感染率较高(10.0%)。结论应加强对诺如病毒监测,及时发布预警信息,以提高诺如病毒感染性急性胃肠炎的防控能力。