DNA损伤修复相关因子在宫颈癌组织中表达的研究

目的探讨DNA损伤修复相关因子组蛋白H2AX和毛细血管扩张性共济失调突变因子(ataxia telangiectasia mutation,ATM)在宫颈癌组织中的表达水平及诊断意义。方法选取2016年1月~2017年7月我科宫颈癌30例(宫颈癌组),同时选取非宫颈癌18例为对照组,对宫颈癌组和对照组宫颈组织进行HE染色和免疫组化染色,在mRNA水平检测H2AX和ATM的表达情况,以磷酸化抗体检测磷酸化H2AX(γH2AX)与磷酸化ATM(phospho-ataxia telangiectasia mutation,p ATM)水平。结果荧光定量PCR分析宫颈癌组ATM mRNA为2.8546±0.8881,明显高于对照组1.0018±0.4980(t=9.256,P=0.000);宫颈癌组H2AX mRNA为2.4312±0.8224,显著高于对照组0.7896±0.4791(t=8.738,P=0.000)。γH2AX和p ATM主要在细胞核中表达,γH2AX阳性率80.0%(24/30),显著高于对照组11.1%(2/18)(Z=-3.381,P=0.000);宫颈癌组p ATM阳性率83.3%(25/30),显著高于对照组16.7%(3/18)(Z=-4.031,P=0.000)。结论γH2AX和p ATM在宫颈癌中高表达,作为DNA损伤修复因子对宫颈癌的早期诊断有一定的临床意义。     

软骨细胞与脂肪基质细胞共培养体外构建软骨的初步研究

目的 探讨软骨细胞与脂肪基质细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)共培养体外构建软骨的可行性,并阐明软骨细胞提供的软骨微环境能否诱导ADSCs向软骨细胞分化并形成软骨组织.方法 分别培养扩增人ADSCs与猪耳软骨细胞,将2种细胞按7:3(ADSCs:软骨细胞)比例混匀,以5.0×107/ml的细胞终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA,直径8 mm,高2 mm)支架作为共培养组,以相同终浓度的单纯软骨细胞和单纯ADSCs分别接种相同支架作为阳性对照组及阴性对照组,以30％上述浓度(1.5×107/ml)的单纯软骨细胞接种作为低浓度软骨细胞对照组.每组各接种6例标本,每例接种细胞悬液200μl.全部标本均于体外培养8周时取材,通过大体观察、组织学、免疫组化及湿重、蛋白多糖定量检测等方法对新生软骨进行初步评价.多样本t检验统计分析各组湿重及蛋白多糖含量差异.结果 各组细胞均与材料粘附良好.共培养组及阳性对照组体外培养8周时基本保持了复合物初始大小和形状,大体观察2组均形成了较成熟软骨组织,组织学显示大量软骨基质和软骨陷窝形成,免疫组化显示软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原分泌.定量测定结果表明,共培养组的平均湿重为(174±12) mg,平均蛋白多糖含量为(7.6±0.4) mg,两者分别达到阳性对照组的75％ (P＜ 0.01)和79％ (P＜ 0.01).阴性对照组(单纯ADSCs组)明显皱缩变形,组织学未见成熟软骨陷窝.低浓度软骨细胞组明显变薄,新生软骨平均湿重为(85 ±5) mg,是阳性对照组的37％ (P＜ 0.01),只在局部形成了不连续的软骨组织.结论 软骨细胞与ADSCs共培养能够在体外构建较成熟的软骨组织,软骨细胞能够诱导ADSCs成软骨分化及体外形成软骨组织.     

磷酸化组蛋白H2AX介导的DNA损伤精子受精卵内修复

成熟精子易受外界影响产生DNA损伤,却缺乏DNA损伤修复系统。由于DNA损伤精子仍具有受精能力和发育潜力,其损伤修复可能发生在受精后。遗憾的是,DNA损伤精子受精后的修复机制尚不清楚。研究发现磷酸化组蛋白H2AX(histone H2AX phosphorylation,γH2AX)参与了DNA损伤精子受精后的修复。本综述主要探讨DNA损伤精子受精后受精卵内经由γH2AX介导修复的可能机制。     

细胞共培养法诱导兔脂肪来源干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的利用软骨细胞与脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)共培养,观察ADSCs是否能向软骨细胞定向分化。方法 4月龄健康新西兰大白兔8只,雌雄不限,体重2.2～2.7 kg,分离、培养兔软骨细胞和ADSCs,取第2代细胞用于实验。将实验分为两组,实验组各取将1 mL细胞密度为2×104个/mL的软骨细胞和ADSCs分别接种至Transwell小室6孔板上、下层共同培养,对照组单独培养ADSCs。倒置相差显微镜观察两组ADSCs形态变化;培养14 d后行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,实时荧光定量PCR检测两组ADSCsⅡ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA表达。结果倒置相差显微镜观察示,随培养时间延长,实验组ADSCs逐渐变为软骨样细胞形态,呈圆形;对照组ADSCs仍以梭形为主,呈束状或漩涡状生长。培养14 d,实验组甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均为阳性;对照组均为阴性;实时荧光定量PCR检测示,实验组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9 mRNA相对表达量分别为1.43±0.07、2.13±0.08、1.08±0.08,显著高于对照组(0.04±0.03、0.13±0.04、0.10±0.02),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过与软骨细胞共同培养,ADSCs可定向分化为软骨细胞。     

光热效应及年龄因素对软骨细胞及骨关节炎模型制备的影响

目的观察不同年龄SD大鼠膝关节对热损伤的耐受能力,探究年龄因素诱导膝关节骨关节炎发生的机制。方法雄性SD大鼠按月龄分3组:青年组(1月龄)、中年组(6月龄)、老年组(18月龄)。取各年龄组大鼠各3只,大鼠双侧膝关节腔注入100μL浓度为100 mg/L的Cu9S5@SiO2,用980 nm、0.72 W/cm2激光照射右侧膝关节,温度上升至50℃后持续5 min,左侧膝关节作为对照组。4周后,观察大鼠膝关节软骨组织损伤情况。分别提取青、中、老年SD大鼠原代膝关节软骨细胞,检测3种细胞的端粒相对长度鉴定软骨细胞的衰老程度。依据来源将提取的软骨细胞分为青年、中年、老年。CCK-8法检测各年龄软骨细胞正常培养时的增殖能力及对过氧化氢(H2O2)和白细胞介素(IL)-1β的耐受能力。使用50μmol/L H2O2和100 ng/mL IL-1β分别干预3种软骨细胞后以TUNEL凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。结果光热损伤4周后青、中、老年组大鼠软骨损伤程度依次增加。CCK-8法显示青、中、老年大鼠膝关节软骨细胞增殖能力依次减弱(P0.05)。在H2O2作用下,中年大鼠软骨细胞抵抗能力最强,青年次之,老年最弱。IL-1β作用下,当其浓度≤200 ng/mL时能促进青、中年大鼠软骨细胞增殖能力,浓度60 ng/mL时明显抑制老年大鼠软骨细胞增殖能力。TUNEL细胞凋亡检测显示50μmol/L H2O2干预后青、中、老年大鼠软骨细胞凋亡比例依次减低(P0.05);100 ng/mL IL-1β干预后各年龄大鼠软骨细胞凋亡均无明显增高(P0.05)。结论不同年龄大鼠软骨细胞的增殖能力、对活性氧(ROS)和IL-1β的耐受能力差异显著。年龄越大,其自身增殖活性越低,抵抗外界损伤的能力越弱。初步验证了年龄因素诱导骨关节炎发生的机制。     

肿瘤干细胞的分离及耐双氧水模型的建立

目的从MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)中培养、分离肿瘤干细胞(cancer stem cells,CST),并研究其对氧化性应激的敏感性。方法将MCF-7细胞在无血清悬浮成球培养基中进行成球悬浮培养,倒置相差显微镜观察细胞形态变化(以MCF-7细胞培养液培养的MCF-7细胞作为对照)。取直径达100μm的CST细胞球(实验组)以及融合度达70%的MCF-7细胞(对照组),采用免疫细胞化学染色法检测CST标志物CD133的表达;取直径达150μm的第3代肿瘤球细胞,采用流式细胞仪检测其CD133阳性率;取直径达150μm的第2代肿瘤球细胞(实验组)以及相应代数的MCF-7细胞(对照组),采用50μmol/L H_2O_2损伤DNA 120 min,采用免疫细胞化学染色方法检测其DNA损伤标志物γH2AX表达。结果倒置相差显微镜观察示,MCF-7细胞最初形态以单细胞贴壁状态生长,经无血清悬浮成球培养基培养后细胞聚集生长,最后形成CST细胞球;而经MCF-7细胞培养液培养的对照MCF-7细胞呈伸展状贴壁生长,不能成球悬浮生长。荧光显微镜观察示,对照组MCF-7细胞CD133为阴性表达,而实验组肿瘤球CD133为阳性表达。流式细胞仪检测示,CST中CD133呈阳性表达,阳性率为92%。倒置荧光显微镜观察示,实验组CST肿瘤球经H_2O_2损伤120 min后,其γH2AX表达较对照组MCF-7细胞明显降低。结论无血清悬浮成球培养基能够从MCF-7肿瘤细胞系培养出成球生长的CST细胞,此类细胞具有很强的抗氧化损伤作用。     

瑞香素联合IGF-1对大鼠脂肪间充质干细胞成软骨分化的影响

目的初步研究瑞香素(dephnetin,DAP)联合IGF-1基因转染对大鼠脂肪间充质干细胞(adiposederived mesenchymal stem cells,ADSCs)成软骨分化的影响。方法采用酶消化法分离培养大鼠ADSCs。取第3代ADSCs以IGF-1基因转染作为实验组,未转染的ADSCs作为对照组。两组细胞分别用不同浓度DAP(0、30、60、90μg/mL)处理,培养72 h后采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖活性;培养14 d分别采用实时荧光定量PCR和Western blot检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA和蛋白表达,并行甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察。结果 CCK-8法检测示,随DAP作用浓度增加,对照组和实验组细胞吸光度(A)值均逐渐增加(P0.05);相同DAP浓度下,实验组细胞A值显著高于对照组(P0.05)。实时荧光定量PCR和Western blot检测示,随DAP作用浓度增加,对照组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量无明显变化,各浓度组间差异无统计学意义(P0.05);实验组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量逐渐增加,其中60、90μg/mL DAP浓度组显著高于0μg/mL DAP浓度组(P0.05)。相同DAP浓度下,实验组细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan的mRNA和蛋白相对表达量显著高于对照组(P0.05)。甲苯胺蓝染色示,随DAP作用浓度增加,对照组内和实验组内细胞着色无明显差异;相同DAP浓度下,实验组比对照组细胞着色略深。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色示,随DAP作用浓度增加,对照组细胞的细胞质内着色无明显差异;实验组细胞的细胞质内着色逐渐加深,其中60、90μg/mL DAP浓度组明显深于0μg/mL DAP浓度组。相同DAP浓度下,实验组比对照组细胞着色明显加深。结论 DAP对大鼠ADSCs增殖有一定促进作用;单独使用DAP诱导大鼠ADSCs向软骨细胞分化作用极微弱,但DAP联合IGF-1基因转染有明显协同作用,促进ADSCs成软骨分化。     

生长分化因子5诱导兔脂肪干细胞成软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨应用生长分化因子5(growth differentiation factor 5,GDF-5)诱导脂肪干细胞(adipose-deftved stern cells,ADSCs)成软骨细胞分化的可能性及效果. 方法 3月龄清洁级健康日本大耳白兔6只,雌雄不限,体重2～3 kg.取兔皮下脂肪4～6 Ml,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养ADSCs,取第3代细胞进行实验.波形蛋白免疫组织化学和CD44、CD49d、CDl06免疫荧光染色鉴定ADSCs.调整细胞密度为1×106个/Ml,分别用普通细胞培养液以及含0、10、100 ng/Ml GDF.5的软骨细胞诱导液诱导培养.倒置相差显微镜观察细胞形态变化;MTT法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测诱导细胞Col Ⅱ和蛋白多糖Mrna的表达;免疫组织化学、阿利新蓝染色、甲苯胺蓝染色和Western blot法检测诱导细胞Col Ⅱ和蛋白多糖表达. 结果 ADSCs呈小圆形、梭形、多角形分布,表面抗原标志CD44、CD49d呈阳性表达,CD106和波形蛋白呈阴性表达.100 ng/Ml GDF-5诱导的ADSCs呈圆形或类圆形,且细胞增殖旺盛.普通培养液和0、10、100 ng/Ml GDF.5成软骨细胞诱导培养后7 d,Col Ⅱ、蛋白多糖Mrna表达均呈浓度依赖性增加,除0、10 ng/Ml GDF-5两组间差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组差异均有统计学意义(P<0.05):100 ng/Ml GDF.5诱导培养14 d,Col Ⅱ、蛋白多糖Mrna以及蛋白表达达高峰,阿利新蓝、甲苯胺蓝染色以及Col Ⅱ免疫组织化学染色均呈阳性. 结论 经一定浓度的GDF-5诱导的ADSCs,Col Ⅱ和蛋白多糖表达明显增加,具有软骨细胞的部分生物学功能.     

2型糖尿病性骨质疏松大鼠ADSCs成骨能力的研究

目的探讨2型糖尿病性骨质疏松(DOP)大鼠自身脂肪干细胞(ADSCs)的体外成骨分化能力。方法将60只SD大鼠分为对照组、骨质疏松组(OP组)及2型糖尿病性骨质疏松组(DOP组),每组20只。DOP组大鼠喂食高脂高糖饲料后于左下腹部经腹腔注射STZ先建立2型糖尿病大鼠模型,再行卵巢切除术建立2型糖尿病性骨质疏松模型;OP组大鼠行卵巢切除术建立骨质疏松大鼠模型,对照组仅切除卵巢周围脂肪。对照组随机选取10只大鼠,DOP组及OP组从建模成功的大鼠中各随机选取10只作研究。从各研究大鼠腹股沟区脂肪组织中分离脂肪干细胞,培养并传代,取第3代细胞作成骨结节染色及定量分析,PCR检测成骨基因RUNX2、OCN、OPN、ALP mRNA的表达。结果造模后DOP组大鼠BMD明显低于对照组及OP组(P0.05);三组大鼠ADSCs细胞形态学及增殖情况无显著性差异;显微镜下观察见DOP组与OP组ADSCs的钙化结节量较对照组少,DOP组钙化结节最少,并且缺少大片状结节,染色较浅;成骨定量分析结果可得DOP组ADSCs的OD值低于对照组及OP组,差异有统计学意义(P0.05);RT-PCR检测成骨基因的表达,DOP组与OP组RUNX2、OCN、OPN、ALP mRNA的表达量均低于对照组(P均0.05),DOP组与OP组相比较,DOP组RUNX2与ALPmRNA的表达量明显低于OP组(P0.05),而OCN与OPNmRNA的表达量两组无明显差异(P0.05)。结论 DOP大鼠ADSCs成骨分化能力较弱,弱于单纯骨质疏松大鼠,原因可能与高血糖状态下其ADSCs中ALP和RUNX2的表达减少有关。     

大鼠BMSC与ADSC体外Transwell共培养诱导成骨的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)与脂肪来源基质细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSCs)体外Transwell共培养后对于ADSCs成骨分化的影响。方法取来源于同一只6周龄SD雄性大鼠的ADSCs及BMSCs,培养传代至第2代后按1∶1比例共培养(共培养组),下室植入ADSCs,上室植入BMSCs;同时设置单纯ADSCs组及BMSCs组为对照组。21 d时成骨诱导分化,然后行茜素红染色,比较共培养后BMSCs对于ADSCs成骨分化的影响。结果共培养组茜素红半定量测定结果与ADSCs组相比有显著性差异(P0.05),与BMSCs组相比无统计学差异(P0.05)。结论 ADSCs和BMSCs体外Transwell共培养后,其成骨矿化能力增强,BMSCs可通过旁分泌方式促进ADSCs成骨分化。     

Ku80分子表达对肝癌细胞DNA双链损伤水平的影响

目的 观察Ku80分子表达对肝癌细胞DNA双链损伤水平的影响.方法 Western blot检测40例肝癌和癌周组织中γ-H2AX和Ku80表达水平;将Ku80基因转染到SMMC7721细胞;免疫荧光和Western blot检测y-H2AX焦点分布和蛋白表达.结果 γ-H2AX在肝癌组织中的表达与癌周比较明显增高(31/40,77.5％),而Ku80表达明显减低(30/40,75％),γ-H2AX表达上调与Ku80表达下调相关(P＜0.05);筛选获得稳定高表达Ku80的克隆细胞;免疫荧光结果显示,Ku80 高表达克隆γ-H2AX焦点数目与对照组比较明显减低(P＜0.01);Western blot显示,Ku80高表达克隆γ-H2AX表达与对照组比较明显减低.结论 Ku80表达下调与肝癌细胞的DNA双链损伤相关,Ku80分子表达可减低肝癌细胞DNA双链损伤水平.     

DNA损伤在去分化源性表皮干细胞安全性评价中的作用及相关机制的研究

目的：：从分子、细胞及在体水平评估DNA损伤和非 DNA 损伤因素诱导所得去分化源性表皮干细胞的安全性,探讨DNA损伤及其应答分子对其安全性评估的意义与机制。方法：分别采用紫外线(UV)照射和bFGF处理诱导方案诱导表皮细胞去分化。采用 MTT法比较正常培养和血清培养条件下的两组去分化源性表皮干细胞的增殖能力;流式细胞术检测凋亡情况;Western blotting检测各组去分化过程中DNA损伤应答分子γ-H2AX、激活型 caspase、p53、p21表达的变化;在雌性BALB/c裸小鼠右侧腋窝皮下注射人黑色素瘤细胞及两种去分化源性表皮干细胞,同时设生理盐水注射对照,30 d 后取瘤块称重,评估两种去分化源性干细胞的成瘤性。结果：①两种去分化源性表皮干细胞均表现出较强的增殖能力,UV 照射所得干细胞具有较强的血清耐受性;②UV照射可导致表皮细胞DNA损伤和细胞凋亡,影响表皮细胞中 p53和 p21水平,而 bFGF处理组无此作用;③两种去分化源性表皮干细胞均无体内成瘤性。结论：去分化过程中细胞 DNA 损伤与否是评价去分化源性干细胞安全性的较敏感的关键指标,因此 bFGF处理诱导与 UV照射所得的表皮干细胞相比更为安全可靠。     

BMSCs旁分泌对软骨细胞IL-1β损伤后的保护作用

目的研究BMSCs对于软骨细胞IL-1β损伤后的保护作用,以及BMSCs存在情况下软骨细胞对于IL-1β抵抗能力的变化。方法取SD大鼠6只随机分为实验组(制备膝关节软骨缺损)和对照组,6 h后取软骨组织行实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)和ELISA检测IL-1β基因表达和相对含量。BMSCs修复功能实验:取培养的18孔SD大鼠软骨细胞随机分为3组(n=6),空白组不作处理,损伤组和共同培养组细胞采用IL-1β干预后,共同培养组使用Transwell小室建立SD大鼠BMSCs与软骨细胞共同培养体系,采用q RT-PCR法测定软骨细胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)和含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白4(a disintegrin and metalloprotease with Thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4)、ADAMTS-5 m RNA相对表达量,ELISA法检测各组Caspase-3含量,以及流式细胞术检测各组细胞凋亡率。BMSCs保护功能实验:将12孔软骨细胞分为2组(n=6),共同培养组置入含BMSCs的Transwell小室后,两组均采用IL-1β干预,检测指标同修复功能实验。结果动物体内损伤现象研究结果示,实验组IL-1βm RNA相对表达量和IL-1β相对含量均高于对照组(P0.05)。BMSCs修复功能实验结果示,损伤组和共同培养组Caspase-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 m RNA相对表达量及Caspase-3含量、细胞凋亡率均显著高于空白组,损伤组显著高于共同培养组,差异均有统计学意义(P0.05)。BMSCs保护功能实验结果示,共同培养组Caspase-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 m RNA相对表达量及Caspase-3含量、细胞凋亡率均显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论作为组织工程种子细胞的BMSCs同时具有抗炎、抗凋亡的应用潜质。     

腺病毒介导的BMP-2基因诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞定向分化

目的探讨人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因通过腺病毒转染青山羊脂肪间充质干细胞(ADSCs)的可行性及其向成骨细胞定向分化的能力。方法取麻醉状态下青山羊腹股沟脂肪组织,经体外分离培养获得ADSCs,转染以腺病毒介导的人BMP-2基因。倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测ADSCs生长增殖情况,免疫细胞化学法对ADSCs细胞进行碱性磷酸酶(ALP)活性测定,SABC法检测ADSCsⅠ型胶原的表达,通过RT-PCR、Western blot法检测BMP-2基因的表达水平。结果转染人BMP-2基因的ADSCs形态规则;细胞生长速度快,且随培养时间的延长逐渐增多(P0.05);成骨诱导后,转染组细胞ALP活性和Ⅰ型胶原表达强度明显高于未转染组(P0.05);转染组ADSCs BMP-2基因m RNA水平和蛋白含量均明显强于未转染组(P0.05)。结论经腺病毒介导的人BMP-2基因转染的青山羊ADSCs在体外诱导培养中可以向成骨细胞定向分化,并保持较强的增殖能力;转染后细胞BMP-2目的基因表达增高。     

细胞增殖对DNA损伤敏感度的影响

目的 观察细胞增殖状态对DNA损伤敏感度的影响.方法 相同时间和强度的紫外线(uV)作用于过以及未经过植物m凝素(PHA)刺激的外周血淋巴细胞(PBLs),荧光标记的磷酸化H2AX组蛋白(γ-H2AX)抗体特异性标记细胞核内DNA双链断裂(DSBs)处的,y-H2AX,然后用流式细胞仪定量检测并分析DNA损伤,用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡.结果 经PHA刺激PBLs细胞进人增殖状态,UV可引起DNA双链断裂,增殖期的PBLs细胞DNA损伤程度明显大于静止期PBLs细胞.结论 受到相同打击后,处于增殖期的淋巴细胞DNA损伤较静止期更为明显.     

与雪旺细胞共培养诱导脂肪来源干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的探讨非接触共培养条件下,大鼠SCs对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的诱导分化效应,为神经组织工程寻找理想种子细胞提供参考。方法取新生1~2 d SD大鼠双侧坐骨神经,酶消化法分离培养SCs,并行S-100免疫荧光染色鉴定。取成年雄性SD大鼠腹股沟和腹膜后脂肪组织,差速贴壁法纯化获得ADSCs并传代,流式细胞仪检测第3代细胞表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105。取原代SCs和第3代ADSCs按2∶1比例于Transwell共培养系统共培养(实验组),以单纯培养ADSCs作为对照组。倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变,培养14 d流式细胞仪检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)表达,免疫荧光染色观察微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、神经元核蛋白(neuronal nuclei protein,Neu N)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)神经元特异性标志物表达情况,并计算阳性细胞率。结果成功分离培养ADSCs并能连续传代,流式细胞仪检测示其高表达CD29、CD90、CD73和CD105,低表达CD34和CD45。倒置相差显微镜下见,实验组共培养后原本呈梭形的ADSCs以胞核为中心收缩,胞体折光性增强,胞体伸出多个长而粗的突起;对照组ADSCs形态无显著变化。流式细胞仪及免疫荧光染色示,共培养后14 d实验组均表达神经元特异性标志物NSE、MAP2、Neu N、GFAP,且阳性细胞率显著高于对照组(P0.01)。结论 SCs与ADSCs非接触共培养,两者不仅能够共生,且SCs能显著促进ADSCs向神经元样细胞分化。     

外源性TGF-β1及IGF-1诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的分离、培养、扩增方法及单层培养条件下外源性转化生长因子TGFβ-1和胰岛素样生长因子IGF-1诱导ADSCs向软骨细胞定向分化的可能性及两者的协同作用分析。方法取大鼠大网膜及肾周脂肪囊等处脂肪组织,酶消化法分离培养脂肪干细胞;免疫荧光测定CD29和CD44抗原的表达;分别用4组诱导培养基定向软骨方向诱导;诱导2周后细胞爬片行免疫荧光鉴定Collagen II表达;RT-PCR、Western blot对定向诱导后的细胞的表达进行检测。结果自大鼠脂肪组织中可分离出脂肪干细胞,体外生长形态类似成纤维细胞,可长期增殖,CD29和CD44抗原表达阳性,定向诱导后IGF-1组、TGFβ-1组及TGFβ-1 IGF-1组细胞可表现出软骨细胞的特性,TGFβ-1和IGF-1共同作用组软骨特异性基质的分泌明显高于单独诱导组。结论从大鼠脂肪组织中可分离出脂肪干细胞,生物学特性稳定,TGFβ-1和IGF-1均能定向诱导ADSCs向软骨方向分化,两者共同诱导时具有协同作用。     

PPARγ基因对脂肪来源干细胞迁移能力的影响

目的通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)基因,研究其对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)迁移能力的影响,探讨可能的信号通路。方法提取人ADSCs进行体外培养,分别用含有不同浓度的PPARγ抑制剂双酚A二缩水甘油醚(bisphenol adiglycidyl ether,BADGE)作用于ADSCs,然后通过划痕实验及Transwell小室实验观察ADSCs的迁移情况,分别用PCR、WB方法检测与迁移相关基因MMP2、MMP9、CXCR4及其蛋白表达情况。结果 ADSCs迁移能力在二维和三维空间均下降(P0.05)。二维空间细胞迁移情况:在72 h,对照组迁移率约63%,25μm/L组约43%,50μm/L组约24%。三维空间:与对照组相比,抑制PPARγ基因,24 h时25μm/L及50μm/L组ADSCs穿过小室的细胞数量较对照组分别降低了14%和28%(P0.05)。抑制PPARγ基因后MMP2、MMP9、CXCR4的基因及其蛋白表达显著降低(P0.05)。结论抑制PPARγ基因后ADSCs的迁移能力下降,其抑制作用随抑制剂浓度增加而增加,可能的调控机制是抑制了MMP和CXCR4信号通路的传导。     

富血小板血浆通过调节细胞周期抑制蛋白p27促进大鼠脂肪干细胞成骨分化

目的 观察富血小板血浆(PRP)通过调节细胞周期蛋白p27表达,促进脂肪干细胞(ADSCs)向成骨细胞分化过程中的具体机制.方法 酶消化法获得大鼠ADSCs,观察PRP对大鼠ADSCs向成骨细胞分化的影响.流式细胞仪检测PRP作用与ADSCs对细胞周期和细胞周期蛋白表达的影响,Western blot法检测细胞周期蛋白表达的变化.结果 PRP干预组ADSCs增殖率为41.0％,空白对照组增殖率为7.4％.S期ADSCs的比例由诱导前的26.5％提高到67.9％.结论 PRP通过下调细胞周期抑制蛋白,提高ADSCs的增殖和分化率,促进ADSCs的成骨分化.     

大分子拥挤对脂肪干细胞增殖及其成骨分化能力的影响

目的 研究大分子拥挤环境对脂肪干细胞(ADSCs)增殖及体外成骨分化能力的影响。方法 将大分子拥挤试剂Ficoll 400和Ficoll 70分别以25 mg/mL和37.5 mg/mL的浓度混合,制备成50 mg/mL Fc混合液,用于体外培养ADSCs。通过CCK-8法、dsDNA核酸定量分析及BCA蛋白浓度测定,定量检测大分子拥挤环境对ADSCs增殖能力的影响;在不同培养时间对ADSCs进行成骨诱导,茜素红染色,检测ADSCs成骨分化能力。结果 CCK-8法检测显示大分子拥挤促进了ADSCs的增殖;dsDNA核酸定量分析及BCA蛋白浓度测定结果表明,大分子拥挤促进了ADSCs的DNA和蛋白质的合成;茜素红染色结果显示,大分子拥挤环境下ADSCs成骨分化能力增强,钙结节增加。结论 大分子拥挤环境对ADSCs的增殖及其体外成骨分化均有一定的促进作用。