KLD-12多肽/重组人BMP-2凝胶诱导兔BMSCs成骨活性的实验研究

目的探讨KLD-12多肽复合重组人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)诱导兔BMSCs成骨活性的影响。方法取3月龄新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度法分离培养BMSCs。取第3代BMSCs分别采用KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶三维培养(实验组)和KLD-12多肽凝胶培养(对照组)。培养7 d倒置相差显微镜下观察实验组细胞在凝胶内的形态;3、7、10、14、21 d检测两组细胞培养基中ALP及骨钙蛋白含量;培养14 d两组行Ⅰ型胶原免疫荧光染色观察,实时荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原和骨钙蛋白基因相对表达量。结果倒置相差显微镜下观察,培养7 d实验组及对照组凝胶内BMSCs呈圆形,分布均匀。两组培养3、7 d时ALP表达量及骨钙蛋白含量比较差异无统计学意义(P0.05),10~21 d实验组以上指标均明显高于对照组(P0.05)。培养14 d,激光共聚焦显微镜观察示,实验组Ⅰ型胶原免疫荧光染色阳性,且荧光强度较对照组高;实时荧光定量PCR检测实验组Ⅰ型胶原、骨钙蛋白基因相对表达量均显著高于对照组,比较差异有统计学意义(t=15.902,P=0.000;t=12.998,P=0.000)。结论 BMSCs在KLD-12多肽内正常生长并增殖,KLD-12多肽/rhBMP-2凝胶诱导BMSCs向成骨细胞分化的生物活性良好。     

改良免疫磁珠结合克隆法培养SD大鼠阴茎海绵体内皮细胞

目的:探索大鼠阴茎海绵体内皮细胞(CCECs)分离、纯化和培养的方法,观察其生长特性,并为勃起功能障碍的研究提供种子细胞。方法:采用0.1%弹性蛋白酶消化SD大鼠阴茎海绵体组织,分离原代SD大鼠CCECs,然后采用免疫磁珠纯化,进一步扩增,利用克隆环筛选出单克隆CCECs,并观察其形态及增殖特性,免疫荧光染色鉴定CCECs血管假性血友病因子(VWF)、免疫组化染色鉴定CCECs CD31分子,流式细胞仪测定CCECs纯度,CCK-8法检测CCECs细胞增殖并绘制生长曲线。结果:经克隆环筛选纯化培养1周后倒置相差显微镜下观察到CCECs生长汇合呈铺路石样改变。生长曲线显示CCECs最初1~2 d处于潜伏期,生长缓慢,3~4 d处于对数生长期,生长迅速,第6天进入平台期。免疫荧光染色检测CCECs VWF呈阳性,荧光显微镜下胞质内可见大量绿色荧光。免疫组化检测CCECs CD31分子呈阳性,倒置显微镜下胞质内可见大量黄褐色颗粒。流式细胞仪检测经磁珠联合克隆环纯化VWF标记的CCECs细胞阳性率可达(91.9±3.75)%。结论:免疫磁珠联合克隆环纯化法可成功培养出纯度高SD大鼠CCECs,并可在内皮细胞培养液中稳定生长及传代。     

上皮细胞条件培养液对BMSCs分化的影响

目的 探讨上皮细胞条件培养液(epithelial cell conditioned medium,ECCM)体外诱导犬BMSCs向上皮细胞分化的可行性.方法 成年健康雄性比格犬1只,体重10 kg.于犬髂后上棘采用骨髓穿刺法取骨髓5 mL,分离培养BMSCs.取犬口腔黏膜下组织,剪成约4 mm×4 mm大小,制备ECCM.取第2代BMSCs以2×104个/孔细胞密度接种,实验组于ECCM中培养,对照组于低糖DMEM完全培养基中培养.观察两组细胞形态特征,MTT法绘制生长曲线,诱导培养21 d免疫组织化学染色鉴定上皮细胞特异性标志物--细胞角蛋白19(cytokeratinl9,CK-19)和细胞角蛋白AE1/AE3,透射电镜观察细胞超微结构.结果 倒置相差显微镜下见两组细胞均呈长梭形,均匀分布,折光性较强,增殖迅速.两组细胞生长曲线均呈"S"形,实验组生长曲线较对照组右移,提示ECCM对细胞增殖有抑制作用.实验组CK-19和细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学染色均呈阳性反应,对照组呈阴性.透射电镜下实验组细胞胞浆内可见紧密连接.结论 ECCM体外有诱导同种BMSCs向上皮细胞分化的作用.     

成骨细胞条件培养液对BMSCs诱导分化作用研究

目的 探讨大鼠成骨细胞条件培养液对同种大鼠BMSCs的成骨诱导分化作用,为骨组织工程种子细胞的获得寻找一种新方法 . 方法 健康1周龄SD大鼠10只,雌雄不限,体重20～30 g,采用贴壁法和酶消化法分别获得BMSCs和成骨细胞,并进行鉴定.无菌条件收集第1～5代成骨细胞培养液上清,与完全培养基1:1混合,制备成骨细胞条件培养液,与第2代BMSCs共培养为诱导组,相同代次BMSCs与完全培养液共培养为对照组.倒置相差显微镜下观察共培养后BMSCs形态变化,MTT法检测BMSCs生长情况,免疫组织化学染色检测共培养后BMSCs的ALP、Col Ⅰ、骨钙素(osteocalcin,OCN)蛋白的表达,采用RT-PCR检测Col Ⅰ、OCN mRNA的表达. 结果 诱导组共培养7 d BMSCs体积变大,细胞由长梭形展开为扁平形和多边形,并带有突起;9 d细胞呈集落状生长.细胞生长曲线示BMSCs数量随培养时间延长而增加,对照组增殖能力较诱导组强;诱导培养4～7 d,对照组细胞数量与诱导组比较差异有统计学意义(P<0.05).诱导组培养12 d,ALP染色呈阳性表达;18 d 出现钙结节;21 d Col Ⅰ和OCN呈阳性表达;对照组均呈阴性表达.RT-PCR检测示诱导组培养21 d有Col Ⅰ、OCN mRNA表达,对照组未见表达. 结论 体外大鼠成骨细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠BMSCs向成骨样细胞分化的作用.     

TNF-α诱导滑膜MSCsMSCs与BMSCs凋亡的比较研究

目的通过比较TNF-α诱导滑膜MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs)与BMSCs凋亡,探讨SMSCs的抗凋亡能力。方法取患者自愿捐赠的滑膜组织及骨髓,分别采用组织贴壁法和密度梯度离心法分离培养SMSCs和BMSCs并传代,取第3~5代细胞行细胞免疫表型及三系分化鉴定后进行实验。实验分为4组,其中SMSCs、BMSCs凋亡诱导组(SMSCs、BMSCs实验组)用20 ng/m L TNF-α和10μg/m L放线菌酮对细胞进行凋亡诱导,其对应对照组以正常培养基培养。倒置相差显微镜下观察凋亡诱导细胞形态变化;培养24 h取各组细胞,采用细胞计数试剂盒8及流式细胞术检测细胞存活率及凋亡率,Western blot法检测细胞半胱氨酶天冬氨酶蛋白酶降解产物8、3(Cleaved Caspase-8、3)的表达。结果经细胞表型及三系分化鉴定培养获得的细胞均符合MSCs鉴定标准。倒置相差显微镜观察示,随凋亡诱导培养时间延长,两实验组细胞形态及生长均较对应的对照组差。培养24 h,两对照组细胞存活率均为100%,未见细胞凋亡;SMSCs、BMSCs实验组细胞存活率分别降至60.13%±8.63%及46.55%±10.54%,均显著低于对照组(P0.05),SMSCs实验组细胞存活率显著高于BMSCs实验组(t=3.152,P=0.006)。SMSCs和BMSCs对照组细胞凋亡率分别为1.12%±0.24%和1.35%±0.31%,两实验组分别增高至36.54%±8.63%及53.77%±11.52%,均显著高于对照组(P0.05),且SMSCs实验组细胞凋亡率显著低于BMSCs实验组(t=3.785,P=0.001)。两对照组细胞Cleaved Caspase-8、3蛋白几乎不表达,且SMSCs实验组和BMSCs组细胞Cleaved Caspase-8、3蛋白明显高表达;其中BMSCs实验组明显高于SMSCs实验组(t=13.870,P=0.000;t=7.309,P=0.000)。结论经TNF-α诱导培养,SMSCs凋亡明显少于BMSCs,具有更强的抗凋亡能力。     

雪旺细胞对不同年龄大鼠BMSCs分化的影响

目的 BMSCs具有多向分化潜能,在不同培养条件下能够向多种细胞分化,但年龄对BMSCs分化的影响尚不明确。探讨雪旺细胞(Schwann cells,SCs)形成的体外微环境对不同年龄大鼠BMSCs向神经元和少突胶质细胞分化的影响。方法从幼年(1月龄)Wistar大鼠预变性坐骨神经中分离纯化SCs,从幼年(1月龄)、成年(6月龄)、老年(12月龄)Wistar大鼠骨髓中提取BMSCs,均行免疫荧光鉴定。将第3代SCs与PKH26标记的第2代BMSCs在双层培养皿内等体积、等密度共培养,根据BMSCs来源不同将实验分为3组:A、B、C组SCs分别与幼年(1月龄)、成年(6月龄)、老年(12月龄)大鼠BMSCs共培养。倒置相差显微镜下观察分化过程中BMSCs形态变化,免疫荧光染色检测共培养后第7天BMSCs分化表达神经特异性烯醇化酶(neuron-specifi c enolase,NSE)和磷脂碱性蛋白(myelin basicprotein,MBP)的情况,ELISA法检测各组细胞共培养0、3、6、9、12 d培养液上清神经调节蛋白1(neuregulin 1,NRG1)的表达。结果实验成功分离并培养SCs和BMSCs,免疫荧光鉴定SCs呈S-100阳性表达,BMSCs呈CD29阳性表达、CD44阳性表达、CD90阳性表达。细胞共培养第7天倒置相差显微镜观察示,A组BMSCs胞体回缩,呈圆形或锥形,并带有突起,形态类似神经组织细胞;B、C组大部分BMSCs形态无明显改变。细胞共培养第7天免疫荧光染色示,A、B、C组BMSCs的NSE阳性表达率分别为22.39%±2.86%、12.89%±1.78%和2.69%±0.80%,MBP阳性表达率分别为16.13%±2.39%、6.33%±1.40%和0.92%±0.17%,各组间NSE阳性表达率和MBP阳性表达率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA法检测示,A组细胞培养液上清中NRG1含量于细胞共培养后逐渐增多,且呈时间依赖性增加;细胞共培养6、9、12 d,A组NRG1含量高于B、C组,B组高于C组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论不同年龄大鼠BMSCs与SCs共培养均可向神经元和少突胶质细胞分化,但分化能力随年龄增加而降低,SCs分泌的多种生长因子可能是诱导BMSCs分化的重要因素。     

FTY720-P对MC3T3-E1细胞分化成熟的作用研究北大核心CSCD

目的探讨FTY720-P对MC3T3-E1细胞分化成熟的作用。方法取MC3T3-E1细胞,分为实验组和对照组。实验组以400 ng/mL FTY720-P(以氯仿为溶剂)作用于细胞,建立体外诱导成骨分化模型;对照组培养基中仅加入氯仿。培养48 h后,倒置相差显微镜观察两组细胞形态;免疫荧光染色检测两组成骨细胞相关蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达;ALP染色及茜素红染色观察两组成骨细胞形成情况及矿化结节形成情况;TUNEL荧光法检测两组细胞凋亡情况。结果培养48 h后,可见两组细胞均已长满瓶底,呈梭形,细胞形态无明显差异。免疫荧光染色显示,实验组Ⅰ型胶原蛋白表达呈阳性,对照组呈弱阳性;实验组的Ⅰ型胶原蛋白积分吸光度(IA)值为187 600±7 944,显著高于对照组的14 230±1 070,差异有统计学意义(t=43.680,P=0.001)。实验组和对照组Ⅲ型胶原蛋白表达均呈弱阳性,两组Ⅲ型胶原蛋白IA值比较差异无统计学意义(t=1.976,P=0.119)。实验组细胞ALP染色和茜素红染色均呈阳性,而对照组均呈阴性。实验组TUNEL染色呈阳性,对照组呈阴性;实验组TUNEL染色细胞阳性率为35.82%±2.99%,显著高于对照组的2.28%±0.51%(t=23.420,P=0.002)。结论 FTY720-P可以促进MC3T3-E1细胞成骨分化,加快细胞外基质成熟和矿化,且能影响细胞凋亡。     

FTY720-P对MC3T3-E1细胞分化成熟的作用研究

目的探讨FTY720-P对MC3T3-E1细胞分化成熟的作用。方法取MC3T3-E1细胞,分为实验组和对照组。实验组以400 ng/mL FTY720-P(以氯仿为溶剂)作用于细胞,建立体外诱导成骨分化模型;对照组培养基中仅加入氯仿。培养48 h后,倒置相差显微镜观察两组细胞形态;免疫荧光染色检测两组成骨细胞相关蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达;ALP染色及茜素红染色观察两组成骨细胞形成情况及矿化结节形成情况;TUNEL荧光法检测两组细胞凋亡情况。结果培养48 h后,可见两组细胞均已长满瓶底,呈梭形,细胞形态无明显差异。免疫荧光染色显示,实验组Ⅰ型胶原蛋白表达呈阳性,对照组呈弱阳性;实验组的Ⅰ型胶原蛋白积分吸光度(IA)值为187 600±7 944,显著高于对照组的14 230±1 070,差异有统计学意义(t=43.680,P=0.001)。实验组和对照组Ⅲ型胶原蛋白表达均呈弱阳性,两组Ⅲ型胶原蛋白IA值比较差异无统计学意义(t=1.976,P=0.119)。实验组细胞ALP染色和茜素红染色均呈阳性,而对照组均呈阴性。实验组TUNEL染色呈阳性,对照组呈阴性;实验组TUNEL染色细胞阳性率为35.82%±2.99%,显著高于对照组的2.28%±0.51%(t=23.420,P=0.002)。结论 FTY720-P可以促进MC3T3-E1细胞成骨分化,加快细胞外基质成熟和矿化,且能影响细胞凋亡。     

Toll样受体亚型在干细胞成骨过程中的作用

[目的]探索大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)成骨过程各阶段,不同Toll样受体(Toll Like Receptor,TLR)亚型的作用。[方法]利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠BMSCs,传代扩增,免疫荧光分析检测细胞表面分子CD44、CD105、Vimentin的表达并进行细胞鉴定。选取活力好的第3代细胞,随机分为3组:空白组,TLR-3激活组和TLR-4激活组,均以成骨诱导培养液在相同的环境下培养。Westernblot法检测Collagen-I和Osteocalcin的表达,观察干细胞向成骨细胞(Osteoblast,OB)分化。于培养10、14 d进行碱性磷酸酶染色及茜素红染色,观察矿化结果。[结果]细胞表面抗原CD44、CD105、Vimentin呈阳性。Collagen-I和Osteocalcin的蛋白表达依次为,TLR-4激活组>TLR-3激活组>空白组。3组碱性磷酸酶染色及茜素红染色均呈阳性,TLR-3激活组强度最高,TLR-4激活组和空白组差异不明显。[结论]在BMSC成骨过程中,不同TLR亚型在不同的阶段起作用,TLR-3和TLR-4均可在BMSCs向OB分化过程中起促进作用,TLR-4的效果更明显。在OB成熟矿化为骨细胞的过程中,TLR-3起促进作用,而TLR-4则起抑制作用。     

兔椎间盘髓核细胞体外生物学特性的实验研究

目的 对兔椎间盘髓核细胞进行体外培养,观察细胞的形态、表型及超微结构改变,研究其体外生物学特性.方法 取2周龄健康新西兰白兔椎间盘髓核组织,在含有15%灭活FBS的DMEM/F12培养液中培养,倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞形态.分别在取材后、原代、第1代、第2代细胞培养期间,进行髓核细胞活力测定;爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O、Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察;MTT法绘制髓核细胞生长曲线,并行原代及第2代细胞透射电镜观察,对体外细胞的生物学特性进行研究.结果 倒置相差显微镜见原代髓核细胞呈类圆形,折光性较强;5 d开始有细胞贴壁,细胞呈多角形或短梭形;6～8 d细胞生长进入指数生长期;约17 d时,细胞长满瓶壁,可进行传代;随传代次数增加,细胞形态逐渐由多角形、短梭形向长梭形改变.髓核细胞活力测定在刚分离完成后细胞活力为95%～97%,原代培养期间为98%～100%,第1代培养期间仍能维持为100%,第2代细胞活力下降较为明显,为75%～80%.髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性:HE染色见细胞核、细胞质着色明显.第1代髓核细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性;第2代细胞Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性,聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅.MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符.透射电镜显示原代髓核细胞内线粒体少,胞质内有大量糖原颗粒,随传代次数增加,糖原颗粒减少,线粒体数量增多,细胞器开始肿胀.结论 明确了兔髓核细胞体外生物学特性变迁,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据.     

BMSCs复合胶原材料三维诱导软骨细胞的初步研究

目的 通过体外培养犬BMSCs,以胶原海绵作为支架材料,体外三维复合培养后,观察向软骨细胞定向诱导的可行性. 方法 健康家犬10只,体重10～15 kg,雌雄不拘.抽取骨髓,体外培养BMSCs,传至第3代,倒置相差显微镜观察细胞形态.实验组将第3代BMSCs以1×106/mL密度接种于胶原海绵支架材料,体外培养48 h后,将细胞材料复合物以软骨细胞定向诱导培养基进行诱导,每隔2天换液;对照组将第3代BMSCs以相同密度接种于胶原海绵支架材料,每隔2天以DMEM换液.培养后14 d,将细胞材料复合物行HE染色和免疫组织化学染色观察. 结果 倒置相差显微镜下第3代BMSCs与第2代BMSCs形态基本一致,传代初期细胞伸出伪足,呈梭形或三角形,7 d后逐渐以梭形为主,胞体饱满,细胞传代后增长速度明显加快.组织学观察实验组细胞广泛分布于支架材料孔隙内,多数细胞呈多角形或者不规则形,少数呈短梭形,细胞周围间隙可见基质成分;对照组细胞分布于支架材料孔隙内,呈梭形或圆形,核呈圆形或椭圆形,胞体较大,胞质透亮均匀,细胞核轮廓清楚,呈蓝色.免疫组织化学染色显示,实验组支架材料孔隙内的细胞胞浆可见棕黄色颗粒,细胞周围出现黄染区;对照组无表达. 结论 BMSCs接种于胶原海绵材料后,经定向软骨诱导后,可向软骨组织方向分化.     

骨形态发生蛋白7体外诱导大鼠骨髓间质干细胞向神经元分化的研究

目的探索骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7, BMP7)在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元的作用。方法 SPF级SD大鼠10只,雄性,4周龄,体重约110 g,以全骨髓贴壁法分离、培养大鼠骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs);成脂诱导、成骨分化检测BMSCs多向分化能力。将BMSCs随机分为对照组、25 ng/ml、50 ng/ml、75 ng/ml及100 ng/ml BMP7组,MTT法检测BMP7对大鼠BMSCs增殖的影响;倒置相差显微镜下观察大鼠BMSCs诱导后形态学变化;qRT-PCR检测诱导得到的细胞NF200、SYN1、MAP2、GFAP mRNA相对表达量;免疫荧光检测NSE蛋白表达情况。结果体外培养的第3代大鼠BMSCs呈长梭形,细胞聚集生长呈漩涡状。大鼠BMSCs成脂诱导后胞浆内出现脂滴,油红"O"染色呈阳性;大鼠BMSCs经成骨诱导后出现不透光团状矿物质结节,茜素红染色呈阳性。诱导1后第1天,各组细胞吸光度值比较差异无统计学意义;诱导后2～6 d,各组细胞...     

肿瘤干细胞的分离及耐双氧水模型的建立

目的从MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)中培养、分离肿瘤干细胞(cancer stem cells,CST),并研究其对氧化性应激的敏感性。方法将MCF-7细胞在无血清悬浮成球培养基中进行成球悬浮培养,倒置相差显微镜观察细胞形态变化(以MCF-7细胞培养液培养的MCF-7细胞作为对照)。取直径达100μm的CST细胞球(实验组)以及融合度达70%的MCF-7细胞(对照组),采用免疫细胞化学染色法检测CST标志物CD133的表达;取直径达150μm的第3代肿瘤球细胞,采用流式细胞仪检测其CD133阳性率;取直径达150μm的第2代肿瘤球细胞(实验组)以及相应代数的MCF-7细胞(对照组),采用50μmol/L H_2O_2损伤DNA 120 min,采用免疫细胞化学染色方法检测其DNA损伤标志物γH2AX表达。结果倒置相差显微镜观察示,MCF-7细胞最初形态以单细胞贴壁状态生长,经无血清悬浮成球培养基培养后细胞聚集生长,最后形成CST细胞球;而经MCF-7细胞培养液培养的对照MCF-7细胞呈伸展状贴壁生长,不能成球悬浮生长。荧光显微镜观察示,对照组MCF-7细胞CD133为阴性表达,而实验组肿瘤球CD133为阳性表达。流式细胞仪检测示,CST中CD133呈阳性表达,阳性率为92%。倒置荧光显微镜观察示,实验组CST肿瘤球经H_2O_2损伤120 min后,其γH2AX表达较对照组MCF-7细胞明显降低。结论无血清悬浮成球培养基能够从MCF-7肿瘤细胞系培养出成球生长的CST细胞,此类细胞具有很强的抗氧化损伤作用。     

人正常腹膜间皮细胞原代培养方法

目的探讨人正常腹膜间皮细胞原代培养方法。方法以胰酶和乙二胺四乙酸磁性搅拌分离人正常腹膜间皮细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态结构和大体生长过程,Calretinin免疫荧光染色鉴定间皮细胞,初步观察传代细胞的贴壁生长情况。结果培养第4天细胞贴壁良好,第15天呈铺路石状、生长良好,1个月时细胞密集铺满皿壁;腹膜间皮细胞Calretinin表达都呈阳性;传代腹膜间皮细胞数量显著减少。结论磁性搅拌酶分离培养可得到数量多、纯度高的原代人正常腹膜间皮细胞,能够满足一般实验要求。     

降钙素基因相关肽促进大鼠BMSCs迁移及VEGF的表达

目的观察外源性降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在大鼠BMSCs迁移中的作用及对VEGF、血管黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)表达的影响,探讨CGRP通过BMSCs促进血管生成的作用机制。方法全骨髓法分离、培养SD大鼠BMSCs,采用Western blot法于传代培养1、2、3周时检测BMSCs中CGRP受体(CGRP receptor,CGRPR)蛋白的表达。使用浓度为1×10-8 mol/L的CGRP作用于BMSCs作为实验组,单纯BMSCs作为对照组,在培养72 h时采用细胞趋化实验检测CGRP对BMSCs迁移的影响;在培养1、3、5、7 d采用实时荧光定量PCR检测CGRP作用后VCAM-1 mRNA的表达变化,采用免疫细胞化学染色、Western blot法检测CGRP作用后VEGF的表达变化。结果 Western blot检测示BMSCs稳定表达CGRPR,2周时表达最高。细胞趋化实验显示,实验组CGRP刺激后穿膜迁移细胞数(3.20±1.77)个/HP,较对照组(1.11±0.49)个/HP明显增多(t=4.230,P=0.001)。实时荧光定量PCR检测示,实验组VCAM-1 mRNA表达随时间延长逐渐增加,7 d时最高;实验组3、5、7 d的VCAM-1 mRNA表达量与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞化学染色示,培养1、3 d两组均无阳性染色;培养5、7 d实验组VEGF染色呈阳性,对照组无阳性染色。Western blot检测示,培养1、3 d两组均未检测到VEGF蛋白表达;培养5、7 d实验组VEGF蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05);实验组5 d的VEGF蛋白表达量明显高于7 d(P<0.05)。结论 CGRP能促进BMSCs迁移及VEGF表达,这可能是CGRP调节骨内部血流变化而影响骨代谢的机制之一。     

大鼠小肠Cajal间质细胞的体外分离、培养及鉴定

目的：探讨大鼠小肠Cajal间质细胞（ICC）的原代分离、培养及鉴定方法。 方法：出生后5~10 d的SD乳大鼠,颈椎脱臼处死。无菌条件下取出小肠,在解剖显微镜下剥去小肠系膜、肠黏膜和黏膜下层,将小肠平滑肌层组织剪成小块后接种于含有干细胞因子的DMEM培养基中进行培养。倒置显微镜下连续观察组织块周围细胞的游出情况及细胞的形态,用酪氨酸蛋白激酶受体c-kit特异性抗体免疫荧光染色鉴定细胞类型。 结果：培养1周后,倒置显微镜下可见组织块周围长出细胞,呈梭形、三角形,有多个短突起;随着培养时间的延长,突起细长化并彼此相互连接形成网络。该类细胞c-kit抗体免疫荧光染色呈阳性。 结论：该研究成功建立了一套由大鼠小肠平滑肌组织块原代培养ICC的方法,为ICC的生物学特性及其与胃肠道动力障碍性疾病关系的研究奠定了基础。     

与雪旺细胞共培养诱导脂肪来源干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的探讨非接触共培养条件下,大鼠SCs对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的诱导分化效应,为神经组织工程寻找理想种子细胞提供参考。方法取新生1~2 d SD大鼠双侧坐骨神经,酶消化法分离培养SCs,并行S-100免疫荧光染色鉴定。取成年雄性SD大鼠腹股沟和腹膜后脂肪组织,差速贴壁法纯化获得ADSCs并传代,流式细胞仪检测第3代细胞表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105。取原代SCs和第3代ADSCs按2∶1比例于Transwell共培养系统共培养(实验组),以单纯培养ADSCs作为对照组。倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变,培养14 d流式细胞仪检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)表达,免疫荧光染色观察微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、神经元核蛋白(neuronal nuclei protein,Neu N)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)神经元特异性标志物表达情况,并计算阳性细胞率。结果成功分离培养ADSCs并能连续传代,流式细胞仪检测示其高表达CD29、CD90、CD73和CD105,低表达CD34和CD45。倒置相差显微镜下见,实验组共培养后原本呈梭形的ADSCs以胞核为中心收缩,胞体折光性增强,胞体伸出多个长而粗的突起;对照组ADSCs形态无显著变化。流式细胞仪及免疫荧光染色示,共培养后14 d实验组均表达神经元特异性标志物NSE、MAP2、Neu N、GFAP,且阳性细胞率显著高于对照组(P0.01)。结论 SCs与ADSCs非接触共培养,两者不仅能够共生,且SCs能显著促进ADSCs向神经元样细胞分化。     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

转化生长因子-β2体外诱导骨髓间充质干细胞表达软骨细胞表型的观察

目的观察骨髓间充质干细胞(MSCs)在转化生长因子(TGF-β2)诱导下向软骨细胞表型转化的能力,探讨其作为软骨组织工程种子细胞的可能性。方法抽取兔髂骨骨髓液3～4ml,进行原代和传代培养,传代后实验组以高糖DMEM无血清特定培养液诱导,培养液含TGF-β210ng/ml、地塞米松10-7mol/L、维生素C50μmol/L;对照组以高糖DMEM无血清培养液培养,相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色深而均匀。结论TGF-β2可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,分泌软骨细胞特异性基质,有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

基于细胞膜片技术构建三维真皮样组织的体外研究

目的探讨应用细胞膜片技术构建三维真皮样组织的新策略。方法取2~3周龄新西兰大白兔骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养兔BMSCs(rabbit BMSCs,rBMSCs)并传代,取人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)传代培养。取第2代rBMSCs、第3代HDFs分别于培养皿采用膜片条件培养基连续培养2周,获得单层细胞膜片。取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)接种于rBMSCs膜片上,构建预血管化膜片。培养期间于倒置相差显微镜下观察膜片上细胞形态变化;共培养1、3、7、14 d后取材行HE染色、CD31免疫荧光染色,观察细胞分布及微血管网络生成情况,以rBMSCs膜片作为对照。分别将培养7 d的预血管化膜片(实验组)及rBMSCs膜片(对照组)放于2层HDFs膜片中间,制备三维真皮样组织,培养24 h后行CD31免疫荧光染色及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色,评估细胞分布及胶原表达情况。结果细胞连续培养2周后成功制备HDFs膜片及rBMSCs膜片。HUVECs接种于rBMSCs膜片3 d后重新排列,7 d后形成网状结构,14 d后网状结构更明显;HE染色见膜片间有空泡形成,且随时间延长空泡日趋明显、膜片厚度显著增加;CD31免疫荧光染色可见微血管管腔形成。而rBMSCs膜片仅见细胞膜片增厚,未见细胞形态改变、空泡结构形成。三维真皮样组织观测显示,实验组内皮细胞CD31免疫荧光染色呈阳性,rBMSCs、HDFs及HUVECs细胞排列整齐;而对照组染色呈阴性,细胞随机排列。实验组和对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原均呈阳性表达,与对照组比较,实验组细胞排列紧密,细胞基质分布规律,呈"蜂巢状"结构;两组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论应用细胞膜片技术可以构建三维真皮样组织,其中采用HUVECs联合rBMSCs膜片构建预血管化膜片后细胞基质分布较规律,具有形成组织工程真皮的潜力。