牡蛎中GⅡ型诺如病毒快速检测方法研究

目的建立牡蛎中GⅡ型诺如病毒快速有效的检测方法,为食源性疾患疫情暴发的溯源提供可靠的实验室依据。方法梯度稀释含有GⅡ型诺如病毒的便悬液分别加入牡蛎消化道组织匀浆中,用蛋白酶K消化-PEG6000沉淀方法富集后,实时荧光RT-PCR进行终端检测,评估灵敏度及回收率。结果该方法的灵敏度为3.91×103copies/g,病毒平均回收率为6.64%。结论蛋白酶K消化-PEG沉淀法操作简单、快速,有望进一步优化后应用于不同贝类中病毒的检测。     

贝类中诺如病毒检测方法的优化

目的优化贝类中GⅡ型诺如病毒(No V GⅡ)的检测方法。方法用No V GⅡ人工染毒贝类样本,分别比较曲通X-100缓冲液(KNT)、Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGBE)缓冲液、甘氨酸缓冲液、脱脂牛奶、磷酸盐缓冲液(PBS)、PBS-吐温80缓冲液和大豆蛋白缓冲液的洗脱效果以及PEG沉淀法、超滤法和膜吸附法3种浓缩方法的回收效果,并采用实时荧光RT-PCR方法进行检测,最后运用优化后的方法对诺如病毒污染的贝类各组织的病毒含量进行检测,以确定最佳检测部位。结果实时荧光RT-PCR结果表明,人工染毒后的贝类样品采用KNT缓冲液洗脱,再用PEG沉淀法浓缩,回收率最好,达18.95%;诺如病毒在贝类中的分布主要集中于进出水口、鳃和消化腺。结论贝类海产品中诺如病毒的检测建议取贝类的进出水口、鳃和消化腺,用KNT缓冲液洗脱、PEG沉淀法浓缩,实时荧光RT-PCR进行检测,以提高检测率。     

水中肠道病毒三种富集方法的效果比较

目的 探讨一种效果较好的水中病毒富集方法,为水中病毒的检测提供依据.方法 向高压灭菌处理的水样中接种已知滴度的脊髓灰质炎Ⅰ型病毒,采用载阳电荷滤料法、膜吸附-洗脱法Ⅰ、膜吸附-洗脱法Ⅱ对水样分别进行病毒富集后,利用荧光定量RT-PCR技术检测并计算回收率.结果 当水中病毒载量为7×102 ～7×105 pfu/L时,载阳电荷滤料法的病毒回收率为92％～94％；2种膜吸附-洗脱法的回收率为72％ ～ 77％.结论 载阳电荷滤料法富集水中病毒的效果好于2种膜吸附-洗脱法.     

水中诺如病毒浓缩与应急检测研究

目的探索适合于基层实验室开展的水中诺如病毒浓缩与应急检测的方法,评估钙离子法对水体中诺如病毒的富集效果及检测灵敏度,为水源性诺如病毒突发疫情的病原检测提供可靠的检测数据。方法将不同浓度的指示病毒(GⅡ型诺如病毒)加入到不同水样中,用钙离子法进行富集,用荧光定量PCR检测,根据富集前后的病毒浓度,评估方法的回收率;根据不同梯度的检测值,评估方法的灵敏度。同时制备不同的模拟水样进行荧光定量PCR检测。结果钙离子法的平均回收率为81.6%,检测灵敏度为模拟样本中病毒浓度为10 copy/μl。而10份不同模拟水样荧光定量PCR检测阳性9份。结论钙离子法浓缩水样中的诺如病毒,回收率与灵敏度均较高,操作简单;同时,荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏的优点,适用于基层实验室开展水体中诺如病毒的应急检测。     

水体中诺如病毒富集技术的研究

目的评估不同实验条件下NanoCeram-PEG富集法对水中诺如病毒(NV)的富集效果,以获得较优的富集方法。方法构建诺如病毒阳性标准质粒,以此为模板,应用荧光定量RT-PCR方法绘制病毒定量标准曲线;将含诺如病毒粪便悬液加入纯净水中,在不同实验条件下经富集操作,富集液经荧光定量RT-PCR方法进行绝对定量并计算最终回收率,从而确定最优富集方法。结果通过病毒定量标准曲线确定荧光定量RT-PCR方法对水中诺如病毒的检测灵敏度为100 copy/μl。本实验通过正交设计方法考察了洗脱液p H值、洗脱速度和PEG浓度3个因素对最终病毒回收率的影响,最终确定在洗脱液流速为300 ml/min,洗脱液p H值为9.5,PEG6000浓度为13%的条件下病毒回收率最高,达到26.55%。结论证明NanoCeram-PEG富集法具有较好的病毒回收率,加以发展将为水源性诺如病毒疫情的溯源提供可靠的实验室依据。     

秦皇岛市海产品贝类中诺如病毒监测分析

目的了解秦皇岛市海产品中血蚶、牡蛎、海虹受诺如病毒污染情况,检测3种贝类带毒率,对检测出的诺如病毒进行GⅠ和GⅡ分型。建立Mengo病毒作为阳性质控检测病毒回收率方法。方法蛋白酶水解法富集病毒,全自动核酸提取仪提取病毒RNA,实时荧光定量PCR方法对诺如病毒进行检测和分型,用Mengo病毒做标准曲线,检测诺如病毒回收率。结果 Mengo病毒回收率均1%符合富集要求,检测牡蛎、海虹、血蚶各20份,检出诺如病毒阳性样本11份,其中GⅠ型1株,GⅡ型10株,总检出率为18.33%。牡蛎、血蚶均检出GⅡ型毒株,检出率分别为30.00%、5.00%,海虹检出GⅠ型和GⅡ型毒株,检出率分别为5.00%和15.00%。结论 3种贝类产品均受到诺如病毒不同程度的污染,GⅡ毒株含量较多,牡蚶和海虹受到污染较为严重。     

水样中诺如病毒富集方法初探

目的评价磁珠吸附法富集水样中诺如病毒的效果,为疫情检测提供参考。方法制备诺如病毒污染模拟样,比较磁珠吸附法与阴离子过柱法吸附效果差异,考察不同批次磁珠、不同样本(自来水、桶装水)磁珠吸附法的富集效果,并进一步以模拟盲样与疫情标本进行验证。富集后产物提取核酸,实时荧光PCR检测,参考Ct值对富集效果进行评价。结果磁珠吸附法富集效果优于阴离子过柱法,不同磁珠批号与不同标本效果无显著差异,富集倍数均104。盲样检测结果正确;疫情标本阴性,与流行病学调查结果吻合。结论磁珠吸附法简便快速,能有效富集水中诺如病毒,有望用于相关疫情的检测,值得进一步研究推广。     

贝类中诺如病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立实时荧光定量PCR法检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒的方法。对东海区域市场内零售贝类海产品中诺如病毒携带情况进行监测,为海产品食品安全和风险预警提供科学依据。方法采集浙江沿海地区市场上常见贝类,利用实时荧光定量PCR检测技术对贝类进行检测。结果 2 955份样品中有63份样品携带诺如病毒,其中杂色蛤、太平洋牡蛎、僧帽牡蛎、毛蚶中均检出GⅡ型诺如病毒。贝类样品中太平洋牡蛎的检出率最高,为15.64%。贝类中诺如病毒在冬季(11月-次年2月)的检出率明显高于夏季(6月-9月),其季节分布差异有统计学意义(χ~2=31.3,P0.05)。结论东海区域贝类中,特别是生食或半熟食贝类中诺如病毒的携带水平较高、分布较广,应持续做好贝类中诺如病毒携带监测,同时做好风险预警。     

水体中GⅡ型诺如病毒荧光定量RT-PCR检测

目的建立水体中诺如病毒的富集和荧光定量RT-PCR检测方法。方法梯度稀释诺如病毒阳性便样标本,模拟水体通过含有阳离子混合醋酸纤维膜的微生物抽滤系统,加入浓度20%的PEG6000,高速离心2次浓缩水体获取病毒粒子,以构建标准质粒作对照,荧光定量RT-PCR检测水体中GII型诺如病毒。结果重组质粒T-NVS定量荧光PCR扩增良好,线性相关系数98%,最低检测灵敏度为100 copies/μL;10-1~10-4倍稀释的模拟水样经富集浓缩后,病毒回收率为5.75~19.74%。结论初步建立了水体中诺如病毒的富集与检测方法。     

重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒

目的建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法。方法设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系。引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒。将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测。结果显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测。灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒。利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价。结果表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好。结论本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测。     

2014年厦门地区市售牡蛎诺如病毒污染状况调查分析

目的调查2014年厦门地区市售牡蛎中GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的污染状况,为食用诺如病毒污染的牡蛎引起的胃肠炎提供预警信息和防控建议。方法 2014年1月-2014年11月对厦门地区市售牡蛎进行连续采样,利用实时荧光定量RT-PCR法对样品中诺如病毒进行检测,确定牡蛎中诺如病毒污染状况及基因型分布状况。结果 198份牡蛎样品中诺如病毒总检出率为22.7%,GⅠ型No Vs检出率为6.1%,GⅡ型No Vs检出率为9.1%,GⅠ型和GⅡ型No Vs同时检出率为7.1%;消化腺中诺如病毒RNA载量水平为400 copy/g~485 000 copy/g,均值为9 500 copy/g。结论 2014年厦门地区市售牡蛎的诺如病毒污染情况较严重,GⅠ型和GⅡ型No Vs均有污染,建议相关部门采取措施,降低人群感染诺如病毒的风险。     

贝类中诺如病毒ELISA与荧光定量PCR检测技术的研究

目的:贝类中诺如病毒是世界范围内急性非细菌性流行性胃肠炎的重要病原。目前我国沿海地区也暴发了诺如病毒,为了更准确的检测,本文寻找和建立了贝类产品中诺如病毒的快速检测方法。方法:用荧光定量PCR和ELISA法对大连地区的贝类样品进行检测。结果:大连地区的贝类样品未检测出诺如病毒。结论:通过实验证明荧光定量PCR法和ELISA法都可用于快速检测诺如病毒,但ELISA法更适于检测诺如病毒含量低的样品。     

纯净水中病毒富集和浓缩方法优化及筛选

目的 使用膜吸附（混合纤维素酯膜,MCE）–超滤法对纯净水中的病毒进行富集浓缩,通过优化其富集试验条件,研究不同试验条件下纯净水中病毒的富集和浓缩效率,筛选最优试验条件。方法 以噬菌体MS2为目标病毒,首先对膜吸附过程中4个影响因素进行多水平的排列组合试验,再使用筛选出的最优条件与超滤过程中2个影响因素进行组合筛选,使用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-q PCR）技术检测、计算噬菌体MS2的回收率,最后对试验数据进行统计学分析。结果 MCE-超滤法的最优富集条件为：阳离子浓度（0.025 mol/L）、MCE膜的孔径（0.22μm）、洗脱液（1%TGBE）、洗脱方式（震荡洗脱）、超滤管截留分子量（30 k D）、离心力（3 000 g）。优化后的MCE-超滤法对纯净水中的噬菌体MS2病毒回收率可达到81.20%(95%CI=71.86%～90.54%)。结论 经优化后的MCE-超滤法对纯净水中的噬菌体MS2病毒有较高的回收率,可用于纯净水中病毒的富集浓缩。     

GⅠ和GⅡ型诺如病毒双重荧光RT-PCR法检测

目的 建立应用Allglo探针同时检测GⅠ和GⅡ型诺如病毒的双重荧光反转录\聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法 设计针对GⅠ和GⅡ型诺如病毒开放阅读框架ORF1及ORF2为目的基因的引物和Allglo探针,优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系;对该方法的特异性、抗干扰性、灵敏度进行评估,对96份临床粪便标本进行检测、测序分析.结果 该方法特异性强,与轮状病毒、扎如病毒、星状病毒、腺病毒同时检测无交叉反应;同一体系下GⅠ或GⅢ型诺如病毒相互之间没有干扰;最低检测限均为10 copies/μL;对96份临床粪便标本进行检测,结果与单重荧光RT-PCR方法符合率100％,且测序结果显示目标序列正确.结论 本研究建立的Allglo探针法检测GⅠ和G Ⅱ型诺如病毒技术特异性好,灵敏度高,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速筛查.     

实时逆转录环介导等温扩增检测GⅡ.4型诺如病毒的研究

目的建立快速检测诺如病毒GⅡ.4型的实时逆转录环介导等温扩增方法(RT-LAMP)。方法选取GⅡ.4型诺如病毒的ORF1与ORF2接头处较为保守的基因序列设计RT-LAMP引物并进行筛选,优化反应条件,分析方法的灵敏度、分析特异性和稳定性,采用优化的方法检测40例临床病毒性腹泻样本,结果与实时荧光逆转录PCR(RT-PCR)比较。结果该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP的最佳反应温度为65℃;该方法检测GⅠ型和GⅡ非诺如病毒4型、轮状病毒、札如病毒、星状病毒、腺病毒、CA16、EV71、CA6和CA10等常见10种其他腹泻病毒的结果为阴性;该方法对诺如病毒GⅡ.4型的检测能力与实时荧光RT-PCR相当;与实时荧光RT-PCR相比,该研究建立的RT-LAMP法检测诺如病毒GⅡ.4型阳性样本和诺如病毒阴性样本的符合率为100%。结论该研究建立的诺如病毒GⅡ.4型RT-LAMP快速检测方法灵敏度高,特异性好,为建立诺如病毒其他基因型的RT-LAMP检测方法奠定了基础。     

实时荧光定量PCR联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法建立与应用

目的建立实时荧光定量PCR法联合检测诺如病毒和副溶血性弧菌的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒和副溶血性弧菌tlh基因设计特异性引物。通过调整引物浓度和优化反应条件,建立多重荧光定量PCR检测体系,对方法的灵敏度和特异性进行验证。结果多重荧光定量PCR检测方法对诺如病毒、副溶血性弧菌、轮状病毒、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌O157等样本进行检测,未发生交叉反应。结论本研究建立的实时荧光定量PCR法同时检测诺如病毒和副溶血性弧菌灵敏度高、特异性好,能用于食品携带病原微生物和感染性腹泻暴发中诺如病毒和副溶血性弧菌的检测。     

水及水产品诺如病毒快速检测技术研究

目的:进行水中病毒富集和水产品前处理方法的研究,以确定水及水产品诺如病毒快速检测技术。方法:不同水中病毒的浓缩富集方法,不同水产品前处理方法,通过荧光PCR检测比较效果,同时检测实际样本的诺如病毒。结果:两步浓缩法浓缩水中病毒效果比PEG沉淀法好,而两种水产品前处理方法相近,实际样本检测诺如病毒均为阴性。结论:确定了水和水产品诺如病毒快速检测技术,为水系和水产品诺如病毒监测提供依据。     

诺如病毒和轮状病毒实时荧光PCR联合检测在托幼机构病毒性腹泻疫情检测中的应用

目的探讨实时荧光PCR联合检测诺如病毒和轮状病毒在托幼机构病毒性腹泻疫情中的应用。方法收集2017-01/2018-06期间青白江区托幼机构报告的疫情患儿肛拭子和大便样品共124份,同时用实时荧光PCR检测诺如病毒和轮状病毒RNA。结果 124份样品中共检出了诺如病毒GⅡ型69例,检出率55.6%,轮状病毒(A/B/C)26例,检出率21.0%;混合感染3例(2.4%)。其中47份肛拭子样品检出诺如病毒16例,检出率34.0%;检出轮状病毒5例,检出率10.6%;77份大便样品检出诺如病毒53例,检出率68.8%;检出轮状病毒21例,检出率27.3%。结论在托幼机构的病毒性腹泻疫情中,诺如病毒检出率最高,但轮状病毒也占一定的比例,因此同时检测两种病毒很有必要。大便样品病毒RNA检出率显著高于肛拭子样品,提示要尽量采集大便样品进行检测。     

大连市首次在急性胃肠炎暴发疫情标本中检出GⅠ型诺如病毒

目的为确定引起大连市某幼儿园急性胃肠炎暴发疫情的病原体,对患儿粪便和呕吐物标本进行诺如病毒核酸检测。方法应用实时荧光RT-PCR法对12份标本进行GⅠ型和GⅡ型诺如病毒RNA检测。结果 12份患儿标本中,9份GⅠ型诺如病毒核酸阳性。结论首次在大连地区发现由GⅠ型诺如病毒引起的暴发疫情。     

依赖核酸序列的扩增技术在诺如病毒基因检测中的应用

目的将一种新颖的核酸扩增技术-依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)应用于诺如病毒的快速检测与辅助诊断。方法根据NCBI诺如病毒RdRp基因保守序列设计特异性引物,建立NASBA检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度和重复性,并利用所建立的NASBA检测方法对临床收集的108例病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果本文建立的NASBA检测方法对诺如病毒具有高度特异性,与轮状病毒等腹泻相关病毒均无交叉反应,反应体系具有很高的稳定性;灵敏度高,即诺如病毒最低检测线为20 pg/μl;检测周期短,NASBA反应在42℃90 min即可进行有效扩增,3 h~4 h即可完成样品中目标基因的筛选。结论本研究应用的诺如病毒NASBA检测方法特异性好、灵敏度高、快速易操作,尤其适用于诺如病毒的日常监测和暴发疫情的应急诊断。