壳聚糖-藻酸盐多通道支架材料细胞相容性研究

[目的]通过体外细胞毒性试验,细胞与支架材料复合培养实验和体内植入试验,评价壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞相容性。[方法]通过冷冻干燥法制备具有纵行、平行排列通道的壳聚糖-藻酸盐支架材料。将大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived stromalcell,BMSCs)与其浸提液培养,采用MTT法检测培养1、3、5d时支架材料的细胞毒性。在体外将BMSCs与壳聚糖-藻酸盐支架材料复合培养3、5、7d后行扫描电镜检测,并将其植入急性脊髓半横断损伤模型中,6周后行免疫荧光检测BMSCs在材料中的生长与分化情况。[结果]MTT法检测示壳聚糖-藻酸盐支架材料的细胞毒性为0-1级。扫描电镜观察细胞在支架材料复合培养3d后即可粘附于支架材料表面,细胞呈一定方向排列。术后6周,Neurofilament200、NSE免疫荧光检测证实,支架材料内有大量BMSCs存活,部分向神经元样细胞分化。[结论]壳聚糖-藻酸盐支架具有良好的细胞相容性,有望成为一种较理想的神经组织工程支架材料。     

3-D打印胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架的研究

目的利用3-D生物打印机制备胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架,为组织工程化治疗脊髓损伤提供细胞载体。方法制备硫酸肝素-胶原蛋白水凝胶,采用3-D打印仿生脊髓支架,扫描电镜观察其结构,排水法计算孔隙率,体外降解实验测量支架p H值和质量变化。取孕14 d SD大鼠的胎鼠脑皮质分离培养神经干细胞(neural stem cells,NSCs),实验分为2组,A组取仿生脊髓支架体外与NSCs共培养,B组直接将细胞悬液接种于预涂左旋多聚赖氨酸的24孔培养板上。采用光镜和扫描电镜观察细胞黏附与形态变化,MTT检测细胞活力,免疫荧光染色鉴定NSCs的分化情况。结果 3-D打印机成功制备出胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架,扫描电镜显示内部具有纵行排列、平行的微孔结构,孔隙率为90.25%±2.15%;体外降解实验中,支架p H值未发生明显变化,8周左右支架降解完全,符合组织工程支架要求。MTT检测示两组培养1、3、7 d吸光度(A)值比较差异均无统计学意义(P0.05);光镜观察两组均可见大量神经球分化,神经纤维交织成网状;培养7 d A组扫描电镜观察示细胞黏附于支架上,大量细胞伸出轴突,并且有神经球形成;免疫荧光染色示,两组均可分化为神经元和胶质细胞,定量分析显示A、B组分化率分别为29.60%±2.68%和10.90%±2.13%,差异有统计学意义(t=17.30,P=0.01)。结论 3-D打印的胶原蛋白-硫酸肝素仿生脊髓支架具有良好的生物相容性,能促进NSCs增殖和分化,作为神经组织工程支架具有良好的研究和应用前景。     

修饰有BMP-7功能片段的功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶RADKPS制备及其生物相容性研究

目的制备并评价载有BMP-7功能片段的新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS的生物相容性,为其在退变髓核再生领域中的体内研究提供实验依据。方法以自组装多肽RADA16-Ⅰ为原料,通过化学键链接BMP-7功能片段构建功能化自组装多肽RADA-KPSS,再与RADA16-Ⅰ等比例混合制备新型功能化自组装多肽RADKPS。通过大体观察、原子力显微镜评估RADKPS支架材料的结构特点。分离培养3月龄新西兰大白兔BMSCs,取第3代BMSCs与RADKPS复合培养7 d,通过扫描电镜、细胞荧光素二乙酸盐/碘化丙啶活性染色、MTT法检测RADKPS的细胞相容性;于6月龄新西兰大白兔离体椎间盘内注射1%RADKPS后培养并观察其髓核内细胞活性。采用溶血实验检测RADKPS的血液相容性。将RADKPS植入6~8周龄昆明小鼠皮下28 d,行大体观察及HE染色观察RADKPS组织相容性。结果 RADKPS在L-DMEM中成胶后呈均匀透明水凝胶状;原子力学显微镜示纳米纤维相互连接呈三维网状结构,纤维直径(25.68±4.62)nm,纤维长度(512.42±32.22)nm。RADKPS支架复合BM SCs 7 d后,扫描电镜示细胞在支架上黏附良好,细胞活性维持在90%以上;MTT检测示0.1%、0.05%、0.025%RADKPS溶液均不同程度促进新西兰大白兔BMSCs增殖。溶血实验结果示,不同浓度RADKPS溶液相对溶血率均5%,符合医用生物材料的溶血实验要求。小鼠皮下注射实验结果示,28 d后注射局部皮肤无水疱、红斑及焦痂形成;HE染色示淋巴细胞等炎性细胞浸润,大量纤维组织取代水凝胶支架,材料组织相容性良好。结论新型功能化自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料RADKPS具有良好的生物相容性和安全性,适合于髓核的组织工程修复与再生研究。     

不同种子细胞复合壳聚糖水凝胶构建可注射组织工程髓核的比较研究

目的比较兔髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)和BMSCs在温敏性壳聚糖水凝胶支架中的生长及细胞外基质合成,筛选用于构建可注射组织工程髓核的种子细胞。方法取3周龄新西兰乳兔,体重150～200g,雌雄不限,分离培养兔NPCs;取1月龄新西兰白兔,体重1.0～1.5kg,雌雄不限,穿刺抽取骨髓分离培养BMSCs。以壳聚糖、β甘油磷酸钠水溶液和羟乙基纤维素溶液为原料制备壳聚糖水凝胶支架。取第2代NPCs和第3代BMSCs分别与壳聚糖水凝胶混匀,构建可注射组织工程髓核。复合培养2d,观察NPCs和BMSCs在壳聚糖水凝胶中的存活情况;复合培养1周,扫描电镜观察两种细胞在支架中的生长分布;复合培养3周,行组织学、免疫组织化学检查,并用RT-PCR检测组织工程髓核中聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达。结果温敏性壳聚糖水凝胶室温呈液态,37℃放置15min发生交联反应成为半固态凝胶。吖啶橙/碘化丙啶染色示壳聚糖水凝胶中多数NPCs和BMSCs存活,少数死亡,细胞存活率均90%。扫描电镜示NPCs和BMSCs分布于网状支架中,细胞表面有分泌的细胞外基质。HE染色、番红O染色及免疫组织化学染色显示细胞具有分泌细胞外基质的功能。RT-PCR检测示NPCs在壳聚糖水凝胶支架中复合培养3周,Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA表达量分别为0.564±0.071、0.725±0.046,BMSCs复合培养物分别为0.713±0.058、0.852±0.076,两种细胞比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论温敏性壳聚糖水凝胶具有良好的细胞相容性,与NPCs比较,BMSCs复合壳聚糖水凝胶培养保持了更好的形态、增殖及细胞外基质合成功能。     

骨形态发生蛋白-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨对骨髓基质干细胞生物学行为的影响

目的 探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)活件多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料对骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖、黏附及分化等生物学行为的影响. 方法制备重组胶原矿化骨支架材料,将BMP-2活性多肽通过交联剂共价结合到材料上,扫描电镜观察支架材料表面微观形貌;取第3代BMSCs接种到材料上,以未结合多肽的重组胶原矿化骨作为对照,采用MTT法检测BMSCs在材料表面的增殖;沉淀法检测BMSCs在材料表面的黏附率;扣描电镜观察比较BMSCs在材料表面的生长形态;通过检测细胞中的碱性磷酸酶活性及钙含量,观察BMSCs在材料表面的分化情况. 结果扫描电镜结果显示:支架材料旱多孔状;X射线光电子能谱法证实BMP-2活性多肽成功共价结合到材料表面;BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料表面BMSCs的黏附和向成骨细胞方向分化能力均高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),而BMSCs的增殖能力与对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05). 结论BMP-2活性多肽可以显著改善重组胶原矿化骨复合材料的细胞相容性和生物活性,经BMP-2活性多肽修饰的重组胶原矿化骨复合材料是一种理想的骨组织工程支架材料.     

纳米支架与犬骨髓基质干细胞体外生物相容性的实验研究

目的研究具有纳米结构二嵌段共聚物左旋聚乳酸-聚己内酯（PLLA-b-PCL）与犬骨髓基质干细胞（BMSCs）的体外生物相容性，探讨其作为软骨组织工程支架的可行性。方法开环聚合制备PLLA-b—PCL，液-液相分离制备PLLA-b-PCL纳米支架，扫描电镜观察材料结构。分离培养犬BMSCs，取第3代BMSCs接种于PLLA-b—PCL膜进行复合二维培养，MTT法检测细胞毒性；通过倒置显微镜、Hoechst33342荧光法观察细胞的形态与黏附情况。另取第3代BMSCs与纳米PLLA—b-PCL支架材料（实验组）、PLLA—b—PCL支架材料（对照组）进行三维培养3周，扫描电镜观察BMSCs的形态、黏附、生长情况，Hoechst33258荧光法检测复合物中细胞DNA含量，BCA法测定蛋白质含量。结果PLLA-b-PCL无细胞毒性，BMSCs在纳米PLLA—b—PCL支架上黏附、增殖良好。随时间延长，BMSCs在支架材料上的DNA和蛋白质含量逐渐增加，DNA和蛋白质含量均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论PLLA-b—PCL纳米支架能为BMSCs的生长分化提供较好的环境，具有良好的生物相容性，有望成为一种较好的软骨组织工程支架材料。     

利用温敏胶原动态培养构建组织工程复合物的初步研究

目的研究动态培养条件下以BMSCs为种子细胞、温敏胶原(thermosensitive collagen hydrogel,TCH)为细胞黏附基质和聚乳酸(poly-L-lactic acid,PLLA)为支架材料体外构建的细胞-支架复合物形态及功能特征。方法分离Fischer344大鼠长骨来源的BMSCs,并体外扩增至第3代作为种子细胞,利用PLLA纤维编织材料作为支架,结合TCH为细胞黏附基质构建细胞-支架复合物。实验组和对照组细胞-支架复合物分别行动态培养和静态培养。体外培养7 d对两组复合物行大体观察和扫描电镜观察,检测培养0、1、3、7 d后复合物中总DNA含量。结果两种方式培养后胶原均包绕PLLA支架材料并形成致密的膜状结构。扫描电镜观察示,实验组复合物表面BMSCs呈梭形沿长轴排列整齐,细胞活性良好,表面可见绒毛凸起,纵断面见PLLA纤维之间充满胶原纤维和细胞;对照组复合物表面BMSCs呈延展状态,PLLA之间的细胞相对较少。体外培养1、3、7 d实验组细胞-支架复合物中总DNA含量均明显高于对照组(P0.05)。与培养0 d比较,两组培养1、3、7 d的总DNA含量均逐渐升高,但仅7 d时总DNA含量与培养0 d比较差异有统计学意义(P0.05)。结论利用TCH和PLLA纤维联合构建的复合细胞外基质具有良好的生物相容性,动态培养可促进BMSCs在材料表面和内部的分布,促进细胞增殖,可用于组织工程复合物的体外构建。     

脱细胞软骨基质三维支架的制备及特性研究

[目的]探索脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备及其应用于关节软骨组织工程的可行性。[方法]新鲜牛膝关节软骨粉碎后,梯度离心法获取软骨微粒,采用改进的Courtman改良法处理细胞后,再冷冻干燥,制备脱细胞软骨基质三维多孔支架。然后,采用京尼平对三维支架进行交联,再次冷冻干燥后,对支架材料进行大体、组织学染色及扫描电镜观察,分别测定支架的孔隙率、溶胀率、降解率。最后,分离培养兔骨髓基质细胞(BMSCs),采用MTT法检测BMSCs在支架材料上的生长、增殖情况,以柱形图表示。[结果]大体观察显示支架呈疏松多孔状,京尼平交联后整体呈深蓝色。组织学观察显示支架材料无软骨细胞碎片残留,HE染色、甲苯胺兰染色观察均未见软骨细胞残留。测量示支架孔隙率为90%,溶胀率为(1314±337)%,降解率2周为(13.69±7.3)%,4周为(25.99±8.9)%。MTT法显示细胞在支架上生长良好,与对照组DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P0.05),提示支架无细胞毒性。扫描电镜显示支架内孔洞较明显,BMSCs通过细胞突起黏附于支架表面,黏附良好,能较好地在其上生长。[结论]经改进的Courtman改良法处理的软骨基质三维多孔支架脱细胞更彻底,保留了软骨的天然细胞外基质成分,天然交联剂京尼平交联后支架的细胞相容性好,抗降解性得到了提高,是一种适用于软骨组织工程的良好载体。     

聚羟基烷酸酯与绵羊骨髓基质干细胞相容性的研究

目的评价聚羟基烷酸酯(PHBV)作为组织工程支架与绵羊骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性。方法原代培养绵羊BMSCs,传至2～3代后,接种至PHBV膜和泡沫样三维支架上,光镜和扫描电镜观察细胞形态,计数1、2、6 h时的细胞黏附率;并以接种至培养板上细胞为对照组,每日细胞计数,绘制生长曲线;按培养液量与支架体积10 mL／cm3为标准浓度制备浸提液,并制备标准浓度1／16～16倍的浸提液,以MTT法检测细胞毒性;流式细胞仪分析接种到材料上的细胞周期,计算增殖指数;BMSCs接种于PHBV三维支架上4、8、12 d,以Hoechst33258荧光法定量测定细胞内DNA含量, BCA法测定蛋白质含量。结果第3代BMSCs接种至PHBV膜上2 h后即大部黏附,黏附率75．6％,与对照组相比差异无统计学意义,绘制生长曲线见细胞生长与对照组无差异;MTT法检测见9个浓度梯度的浸提液毒性均为0级;光镜和扫描电镜观察见细胞接种于PHBV膜上2 h后大部分黏附,3 d后伸展良好,呈纺锤形或梭形,在三维支架的孔隙内立体生长,1周开始细胞间连接,3周广泛连接,分泌大量基质;流式细胞分析见接种于材料上的细胞周期无变化;接种至PHBV三维支架上的细胞内DNA、蛋白质浓度与对照组比较无差异。结论PHBV作为BMSCs的组织工程支架材料,具有良好的生物相容性。     

兔骨髓间充质干细胞在藻酸锶凝胶中体外三维培养的实验研究

[目的]观察兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)于藻酸锶凝胶中体外三维培养的形态与活性变化,为藻酸锶凝胶复合干细胞应用于骨组织工程提供理论依据。[方法]分离培养原代兔BMSCs并扩增,取第3代BMSCs以细胞密度为5×105个/ml复合于藻酸锶凝胶中三维培养,每日于倒置相差显微镜下观察细胞形态,在不同时间点对其进行Live/Dead染色测细胞存活,CCK-8检测细胞增殖,并用扫描电镜观察凝胶的超微结构及细胞于凝胶上的黏附情况。[结果]藻酸锶凝胶质软、透明、渗透性较好;BMSCs接种于藻酸锶凝胶中初始形态为圆形、呈悬浮生长,后细胞逐渐贴壁生长并呈星形或多角形;接种第1 d和第14 d凝胶中活细胞率分别为(88.61±4.08)%和(92.16±2.10)%,两者间无显著统计学差异(P>0.05);第4、7、10、13 d时二维培养组中OD值显著高于三维培养组(P<0.05);扫描电镜示藻酸锶凝胶呈典型的"鸡蛋箱"样结构,孔隙直径大小平均为150μm;接种于凝胶中7 d后可见细胞均匀黏附于凝胶壁生长。[结论]藻酸锶凝胶是一种优良的细胞支架,将其复合种子细胞应用于骨组织工程具有广阔的前景。     

BMSCs复合胶原材料三维诱导软骨细胞的初步研究

目的 通过体外培养犬BMSCs,以胶原海绵作为支架材料,体外三维复合培养后,观察向软骨细胞定向诱导的可行性. 方法 健康家犬10只,体重10～15 kg,雌雄不拘.抽取骨髓,体外培养BMSCs,传至第3代,倒置相差显微镜观察细胞形态.实验组将第3代BMSCs以1×106/mL密度接种于胶原海绵支架材料,体外培养48 h后,将细胞材料复合物以软骨细胞定向诱导培养基进行诱导,每隔2天换液;对照组将第3代BMSCs以相同密度接种于胶原海绵支架材料,每隔2天以DMEM换液.培养后14 d,将细胞材料复合物行HE染色和免疫组织化学染色观察. 结果 倒置相差显微镜下第3代BMSCs与第2代BMSCs形态基本一致,传代初期细胞伸出伪足,呈梭形或三角形,7 d后逐渐以梭形为主,胞体饱满,细胞传代后增长速度明显加快.组织学观察实验组细胞广泛分布于支架材料孔隙内,多数细胞呈多角形或者不规则形,少数呈短梭形,细胞周围间隙可见基质成分;对照组细胞分布于支架材料孔隙内,呈梭形或圆形,核呈圆形或椭圆形,胞体较大,胞质透亮均匀,细胞核轮廓清楚,呈蓝色.免疫组织化学染色显示,实验组支架材料孔隙内的细胞胞浆可见棕黄色颗粒,细胞周围出现黄染区;对照组无表达. 结论 BMSCs接种于胶原海绵材料后,经定向软骨诱导后,可向软骨组织方向分化.     

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-重组蛛丝蛋白/聚乙烯醇支架材料的细胞相容性研究

目的 通过体外细胞毒性实验和细胞与支架材料复合培养实验的研究,评价精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-重组蛛丝蛋白(pNSR16)/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)支架材料的细胞相容性.方法 通过溶剂浇铸/粒子沥滤的方法制备pNSR16/PVA支架材料及其浸提液.将小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3细胞)与浸提液培养,采用MTT法检测培养1、3、5 d时支架材料的细胞毒件.将NIH-3T3细胞与pNSR16/PVA支架材料复合培养2、4、6 d后行扫描电镜、HE染色观察,并于复介培养6 d后行免疫组织化学检测,观察NIH-3T3细胞在支架材料上的黏附、生长及表达功能情况.结果 MTT法检测显示pNSR16/PVA支架材料的细胞毒性为0级.扫描电镜观察细胞在支架材料复合培养4 d后即可覆盖支架材料表面,细胞呈一定方向排列.HE染色示细胞能存支架表面黏附和生长,且随培养时间的延长,细胞向支架内部迁移.免疫组织化学检测到NIH-3T3细胞分泌的bFGF,细胞能进行正常分化.结论 pNSR16/PVA支架材料具有良好的细胞相容性,有望作为一种较理想的组织工程支架材料.     

多肽修饰的聚己内酯-左旋聚乳酸与犬骨髓基质干细胞生物相容性的研究

目的 探讨精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的聚己内酯-左旋聚乳酸共聚物(PCL-b-PLLA)与犬骨髓基质干细胞(BMSCs)的生物相容性.方法 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬BMSCs,观察细胞形态及超微结构,流式细胞仪鉴定其表面标记物.将第3代犬BMSCs接种于RGD纳米胶束修饰的PCL-b-PLLA膜L培养,作为实验组,对照组为BMSCs与未修饰的PCL-b-PLLA膜复合培养,3 d后Hoechst 33342荧光染色、倒置显微镜及扣描电镜观察细胞形态,MTT法检测细胞毒性.分别于2、4、6 h细胞计数仪计数检测黏附的细胞数,计算黏附率.结果 原代及传代培养的BMSCs呈梭形外观,具有较强的增殖能力.BMSCs超微结构显示其胞体较小,细胞核/浆比例大,胞浆少,染色质较疏松.细胞表而扰原CD29、CD44表达阳性,CD34表达阴性.Hoechst 33342荧光染色示实验组细胞核形态正常,核质均染,细胞数较对照组明显增多,未见明显凋亡及坏死细胞.扫描电镜示实验组较对照组细胞数量多,延展好,伪足相互接触紧密.两组材料对细胞均无毒性作用.随时间延长两组材料上细胞黏附率逐渐增高,各时间段实验组细胞黏附率显著高于对照组(P＜0.01).结论 RGD修饰的PCL-b-PLLA不仅与犬BMSCs具有良好的生物相容性,而且可显著促进BMSCs黏附、生长,是一种较为理想的组织工程支架材料.     

腺病毒介导BMP-2和EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞及种植脱钙骨的体外观察

目的用腺病毒载体介导人骨形态发生蛋白-2及EGFP基因转染兔骨髓基质干细胞(rBMSC),种植DBM(脱钙骨)支架体外构建组织工程骨。方法兔髓基质干细胞(rBMSC)的分离、培养;流式细胞仪检测细胞表面标记;转染后,荧光显微镜观察细胞最适感染复数(MOI)及蛋白印迹检测外源基因的表达情况;采用Urist提供的方法制备脱钙骨(DBM),用细胞计量法测定BMSCs与DBM复合培养的黏附率。然后将转染后细胞接种到DBM支架上,用荧光显微镜观察细胞是否成功粘附于支架材料上,扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果 BMSCs细胞表型鉴定:CD44表达阳性,CD45表达阴性;转染后,蛋白印迹试验检测到BMP-2表达增高;骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质的平均粘附率为(72.74±1.99)%;扫描电镜见转染细胞生长良好,伸出丝状突起,相互连接。结论成功培养及鉴定兔BMSCs,Ad-BMP-2/EGFP可高效转染兔BMSCs,转染后的细胞种植于DBM支架材料后生长状况良好,组织工程骨构建成功。     

壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤的实验研究

目的探讨壳聚糖多孔支架复合BMSCs移植修复大鼠创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的可行性。方法取成年SD大鼠胫骨及股骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法分离培养BMSCs,并传代。取第3代细胞行表面抗原CD29、CD45鉴定及BrdU标记。采用冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架,并与BrdU标记的第3代BMSCs进行体外共培养;扫描电镜观察细胞黏附情况,MTT法检测支架内细胞生长情况。取50只成年SD大鼠,随机分为A、B、C、D、E组(n=10)。A～D组大鼠采用Feeney自由落体打击致伤原理制备TBI模型,造模后72 h分别移植BMSCs-壳聚糖多孔支架复合体、BMSCs、壳聚糖多孔支架和完全培养基;E组为假手术组。于造模前及造模后1、7、14、35 d,各组大鼠行改良神经功能缺损评分(modified neurological severity scores,mNSS);造模后进行Morris水迷宫测验,包括定位航行测验(造模后31～35 d连续5 d检测潜伏期)及空间探索测验(造模后35 d检测穿越平台次数);造模后36 d取标本行HE染色、BrdU与高分子量神经丝蛋白免疫组织化学双重染色以及BrdU与神经胶质酸性蛋白免疫组织化学双重染色,观察大鼠脑损伤区BMSCs的迁移与分化情况。结果流式细胞仪检测示第3代BMSCs的CD29阳性率为98.49%,CD45阳性率仅为0.85%;扫描电镜示支架-细胞共培养48 h后,BMSCs呈梭形并分泌细胞外基质黏附于支架上;MTT法检测示壳聚糖多孔支架对BMSCs的增殖分化无不良影响。TBI造模后35 d,A组大鼠mNSS评分、定位航行测验的潜伏期显著低于B、C、D组,空间探索测验的穿越平台次数显著高于B、C、D组,差异均有统计学意义(P0.05);A、E组间上述指标比较差异均无统计学意义(P0.05)。HE染色示A组壳聚糖多孔支架已部分降解,其与脑组织融合良好,修复程度优于B、C、D组。免疫组织化学双重染色结果示,A组移植的BMSCs存活、分化为神经元和神经胶质细胞,并迁移至正常脑组织内,修复程度优于B、C、D组。结论壳聚糖多孔支架介导的BMSCs移植能够明显改善大鼠TBI后的神经功能,亦能抑制大鼠脑损伤区胶质瘢痕形成,并可使BMSCs在脑损伤区存活、增殖和分化为神经细胞。     

重组人BMP-2修饰的β磷酸三钙/胶原材料制备及其诱导成牙性能的初步研究

目的构建重组人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)修饰的β磷酸三钙(βtricalciumphosphate,β-TCP)/胶原生物支架材料,初步探讨其在牙组织工程中发挥的作用,评价其作为牙组织工程支架材料的可行性。方法将纳米级β-TCP粉末与胶原在强碱性水溶液中复合,制备β-TCP/胶原生物支架材料,并与rhBMP-2复合,制备牙组织工程支架材料。SPF级8～10周龄SD大鼠46只,雄性34只,雌性12只,体重250～300 g。体视显微镜下分离新生SD大鼠的下颌骨,取牙胚消化成细胞悬液,与支架材料复合培养制备组织工程牙胚。通过扫描电镜观察、细胞黏附率测定和MTT测定细胞增殖情况评价支架材料对牙胚细胞体外生长的影响。将组织工程牙胚植入SD大鼠肾被膜下作为实验组(n=12),另分别植入单独牙胚细胞团块(细胞对照组,n=12)及单独支架材料(材料对照组,n=4)作为对照,4、8周时取出标本行大体及组织学观察。结果扫描电镜示β-TCP/胶原生物支架材料呈疏松多孔状,质地柔软,亲水性良好;复合培养3 d后牙胚细胞可紧密贴附于支架材料,生长状态良好。牙胚细胞接种至支架材料上经4、8、12 h孵育后,细胞黏附率分别为27.20%±2.37%、44.52%±1.87%、73.81%±4.15%。MTT检测示牙胚细胞在β-TCP/胶原生物支架材料上的增殖情况与未放置支架材料相似,差异无统计学意义(P>0.05)。各组植入物移植于大鼠肾被膜下4、8周后大体观察可见白色钙化物形成;植入后4周,实验组镜下可见明显牙样形态及典型的釉质和牙本质样结构形成,细胞对照组可见釉质和牙本质样结构,但排列相对紊乱;植入后8周,实验组釉质及牙本质样结构较4周成熟,层次也更加清晰,细胞对照组也可见较为成熟的釉质和牙本质样结构;植入后4、8周,材料对照组均未见牙样结构形成。结论 rh BMP-2修饰的β-TCP/胶原生物支架材料与牙胚细胞生物相容性良好,可作为牙组织工程支架材料的良好选择。     

3D打印制备聚己内酯/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架及其理化特性的研究

目的采用低温沉积技术3D打印制备聚己内酯(polycaprolactone,PCL)/Ⅰ型胶原组织工程半月板支架(以下简称PCL/Ⅰ型胶原半月板支架),探讨其理化特性。方法制备15%PCL/4%Ⅰ型胶原溶液及15%PCL溶液,利用低温沉积技术3D打印制备PCL/Ⅰ型胶原半月板支架及PCL半月板支架。大体及扫描电镜观察支架形态及微观结构,生物力学试验测量支架压缩模量及拉伸模量,红外光谱分析支架成分,测量支架表面接触角;将两种支架及其浸提液分别与兔半月板细胞复合培养,细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖,并以正常培养细胞作对照;扫描电镜观察支架-细胞复合物中细胞黏附及生长情况。结果大体及扫描电镜观察显示,两种支架均具有取向的三维微观结构及孔隙,但PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面更粗糙。生物力学测试,两种支架压缩模量及拉伸模量比较,差异均无统计学意义(P0.05)。红外光谱分析提示,PCL/Ⅰ型胶原半月板支架中PCL和Ⅰ型胶原成功混合。PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面接触角为(83.19±7.49)°,较PCL半月板支架(111.13±5.70)°显著减小(t=6.638,P=0.000)。CCK-8检测显示,随培养时间延长,两种支架浸提液培养的细胞数量呈递增趋势,与对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。支架-细胞复合物扫描电镜观察示,PCL/Ⅰ型胶原半月板支架表面黏附细胞多于PCL半月板支架。结论低温沉积技术3D打印制备的PCL/Ⅰ型胶原半月板支架具有优良的理化学性能,无细胞毒性,有望作为半月板组织工程支架材料。     

胶原-透明质酸钠-纤维蛋白胶复合去抗原松质骨支架的制备及特征

[目的]探索胶原-透明质酸钠-纤维蛋白胶多孔支架复合去抗原松质骨的骨软骨一体化材料的制备方法及其特征.[方法]将胶原、透明质酸钠及纤维蛋白胶混匀,利用纤维蛋白胶的粘合性与去抗原牛松质骨复合,成为骨软骨一体化的支架材料.通过大体观察和扫描电镜观察了解材料的孔径和交通情况;分离、增殖仔兔骨髓基质细胞(BMSCs),取第3代BMSCs接种至支架材料复合培养,1、3、5、7和10 d后,行MTT检测并绘制细胞生长曲线;取第7 d标本,行扫描电镜观察.[结果]经交联和复合的一体化骨软骨支架材料具有良好的三维多孔结构,骨相孔径约300～500μm,软骨相孔径约80～120μm,两部分连接紧密;电镜观察见骨相及软骨相均有细胞黏附,细胞周围有基质存在;MTF检测显示,各时间点的OD值在实验组与对照组之间无统计学差异(P＞0.05).[结论]胶原-透明质酸钠-纤维蛋白胶多孔支架复合去抗原牛松质骨的一体化材料具有良好的空间结构和生物相容性,可用于修复骨软骨联合缺损的组织工程支架材料的研究.     

静电纺丝聚乳酸聚乙醇酸/聚乙二醇纳米纤维作为组织工程支架的体外细胞相容性研究

目的 探讨静电纺丝聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)/聚乙二醇(PEG)共聚物纳米纤维作为组织工程支架的可行性,及其与大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外相容性. 方法 静电纺丝法分别制备PLGA/PEG和PLGA纳米纤维支架,扫描电镜(SEM)观察材料结构;分离培养大鼠BMSCs,取第3代BMSCs分别接种于PLGA/PEG纳米纤维支架和PLGA纳米纤维支架进行培养,噻唑蓝(MTT)法测定其细胞毒性及细胞增殖;接种后2、4、6h血球计数板计数法测定其黏附率;DAPI荧光染色观察细胞核形态;SEM观察细胞和支架的形态、黏附及生长情况. 结果 SEM观察显示两组支架呈相互交联的多孔网状无纺结构.PLGA/PEG组和PLGA组纤维直径分别为(655±57)nm和(539±48)nm;孔隙率分别为86.8％±1.5％和84.7％±1 2％.MTT检测BMSCs在两组支架中生长良好,OD值均随时间延长而增大,两组各时间点比较差异均有统计学意义(P＜0 05).各时间段PLGA/PEG组的细胞黏附率明显高于PLGA组,差异均有统计学意义(P＜0.05).DAPI染色示各组细胞核形态正常,核质均染,未见明显凋亡及坏死细胞;PLGA/PEG组细胞较PLGA组明显增多.SEM观察显示,PLGA/PEG组BMSCs在支架上生长良好,基质分泌、生长情况优于PLGA组. 结论 采用静电纺丝法制备的PLGA/PEG纳米纤维支架安全无毒,具备合适的孔径和孔隙率,适合BMSCs生长,细胞相容性良好,是一种组织工程良好的支架载体.     

转BMP-7基因BMSCs复合nHAC体外培养的实验研究

目的 建立能够稳定表达骨形态发生蛋白-7(BMP-7)的骨髓基质干细胞(BMSCs),并与纳米羟基磷灰石胶原(nHAC)材料复合培养体外构建组织工程骨.方法 用慢病毒把人BMP-7基因和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因导入大鼠BMSCs,用G418筛选获得阳性细胞后接种于nHAC支架体外复合培养.荧光显微镜下观察eGFP表达, 判断感染效率;以四唑盐(MTT)实验检测细胞活力;RT-PCR、ELISA检测目的基因表达;碱性磷酸酶(ALP)活性检测成骨能力;扫描电镜观察细胞在支架材料中的黏附、生长状况.结果 慢病毒24 h对BMSCs的转染率约为90%;MTT实验显示细胞活性较未转染组无明显差异(P＞0.05);RT-PCR检测到BMP-7表达,在1 300 bp处出现特异性条带;ELISA检测24h BMP-7蛋白含量为(150.2±18.3)pg/ml;ALP活性以第16天左右最强;扫描电镜见细胞种植nHAC支架后粘附、生长良好.结论 BMP-7可在BMSCs内稳定表达,并诱导其向成骨分化;与nHAC复合培养可构建组织工程骨.