靶向Notchl基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定靶向Notchl基因的siRNA真核表达载体.方法:根据Notchl基因cDNA序列,设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列,将其插入U6启动子下游,克隆到真核表达载体pGsensil中,并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定.采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中,荧光下观测转染效率.RT-PCR检测Notchl基因mRNA在转染前后的表达.结果:转染48 h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了Notchl mRNA的表达.酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确.结论:成功构建的靶向Notchl的siRNA真核表达载体,具有抑制Notchl基因mRNA表达的功能,可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向.     

靶向Notch1基因siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定靶向Notch1基因的siRNA真核表达载体。方法：根据Notch1基因cDNA序列，设计靶向目的基因的3个siRNA靶序列，将其插入U6启动子下游，克隆到真核表达载体pGsensil中，并进行酶切鉴定和DNA测序鉴定。采用脂质体介导法将构建好的3个siRNA表达载体分别转染T24人膀胱癌细胞中，荧光下观测转染效率。RT-PCR检测Notch1基因mRNA在转染前后的表达。结果：转染48h后3个siRNA表达载体均不同程度的抑制了Notch1 mRNA的表达。酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。结论：成功构建的靶向Notch1的siRNA真核表达载体，具有抑制Notch1基因mRNA表达的功能，可能为膀胱癌基因治疗研究提供一个新的方向。     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

G9a特异性siRNA表达载体的构建及在QBC939细胞中对G9a基因表达的影响

目的构建特异性组蛋白甲基转移酶G9a基因的siRNA表达载体并检测QBC939细胞对G9a表达的抑制作用。方法设计、合成G9a特异性的短链寡核苷酸,经退火形成双链DNA片段.克隆到pSilencer neo^TM2.1-U6载体中,构建G9a特异性siRNA的表达载体。EcoRⅠ＋BamHⅠ和EcoRⅠ＋HindⅢ双酶切及测序鉴定重组体,并转染QBC_（939）细胞,G418筛选出稳定表达细胞株,半定量RT-PCR方法和Western印迹法检测G9a mRNA和蛋白的表达水平。结果双酶切与测序鉴定证实成功构建了G9a-siRNA表达载体,转染人胆管癌细胞株QBC939后,在mRNA和蛋白表达水平对G9a的抑制率分别为55.2%和54.8%。结论运用pSileneer neo^TM2.1-U6载体构建的G9a-siRNA表达载体可有效抑制G9a在胆管癌细胞株QBC939中的表达。     

靶向MUC1的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定针对黏蛋白1(MUC1)特异性的siRNA表达载体。方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状MUC1-siRNA的寡核苷酸链,将其插入pGCsilencerTMU6/Neo/RNAi质粒载体中,用双酶切、阳性克隆聚合酶链反应(PCR)鉴定及DNA测序鉴定所构建的重组载体是否正确;以脂质体法将构建的重组载体导入人胆管癌细胞QBC939中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测转染细胞中MUC1mRNA和蛋白的表达。结果双酶切、PCR鉴定及DNA测序证实MUC1-siRNA真核表达载体构建成功,转染该载体后的QBC939(干扰组)中MUC1mRNA及其蛋白质表达水平明显下调(P0.05)。结论成功构建的特异性siRNA表达载体,转染QBC939后可特异性地封闭MUC1的表达,为进一步研究MUC1-siRNA载体提供了实验基础。     

Survivin 抑制人胆管癌细胞凋亡相关信号通路的实验研究

目的:探讨survivin基因对人胆管癌细胞凋亡信号通路的调节机制.方法:构建针对survivin基因的siRNA和对照siRNA,将QBC939人胆管癌细胞分为3组,分别为siRNA-survivin转染组,对照siRNA转染组和未转染组.转染后,首先用Western blot检测未转染QBC939细胞和QBC939/siRNA(-)细胞及QBC939/siRNA(+)细胞中survivin的表达,验证干扰效果,继而分别用流式细胞仪,激酶活性测定和Western blot检测以上3种状态的QBC939细胞的凋亡情况,caspase-3的活性和caspase-3,caspase-9及procaspase-9凋亡信号分子的表达.结果:QBC939/siRNA(+)细胞survivin蛋白表达量明显低于未转染的QBC939细胞(P＜0.05),而QBC939/siRNA(-)细胞survivin蛋白表达量无明显改变(P＞0.05).与未转染的QBC939细胞比较,QBC939/siRNA(+)细胞凋亡明显增加,caspase-3活性明显升高,caspase-3和caspase-9表达明显上调,而procaspase-9表达降低(均P＜0.05);上述指标在QBC939/siRNA(-)细胞与未转染的QBC939细胞间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:survivin基因可能通过促进procaspase-9的活化阻止caspase-3和caspase-9的激活,从而抑制胆管癌细胞的凋亡.     

人RhoC基因正、反义真核表达载体的构建及对肿瘤增殖的影响

目的构建人RhoC基因正、反义真核表达载体，研究RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株增殖的影响。方法应用分子克隆技术，用KpnⅠ和BamHⅠ双限制性内切酶从RhoC基因切下所需目的片段，然后将该片段正、反向定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1／Hyg（＋）上，构建正、反义RhoC cDNA真核表达载体，以脂质体转染人胆管癌QBC939细胞，检测细胞生长曲线。结果经测序鉴定，将正、反义目的片段成功的连接到pcDNA3.1／Hyg（＋）载体上。结果序列测定证实RhoC基因正、反义.真核表达载体成功构建，反义RhoC基因抑制QBC939细胞增殖，正义RhoC基因促进QBC939细胞增殖。结论成功地将RhoC目的片段正、反向插入到pcDNA3．1／Hyg（＋）中，构建了人RhoC正、反义表达真核载体，RhoC基因调控QBC939细胞增殖。     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。     

RNA干扰降低环氧化酶2基因表达对人胆管癌QBC939细胞的体外作用

目的研究小干扰RNA（siRNA）降低环氧化酶2（COX-2）基因对胆管癌QBC939细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白表达的影响。方法采用RNA干扰的方法,将胆管癌细胞株QBC939细胞分为4组：COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体、空白对照组。将COX-2 siRNA转染入QBC939细胞;流式细胞仪检测siRNA降低COX-2基因表达对凋亡的作用,WesternBlot法检测siRNA降低COX-2基因表达对caspase-3表达变化的影响。结果 RNA干扰后QBC939细胞COX-2表达下降至空白对照组的42%,流式细胞仪检测结果显示COX-2 siRNA干预组细胞的凋亡率以及凋亡蛋白caspase-3的表达明显高于其他3个对照组。结论 RNA干扰可抑制细胞COX-2蛋白的表达,促使胆管癌QBC939细胞的凋亡,caspase-3途径可能是其调控通路之     

人FHIT基因的克隆及其真核表达质粒的构建

目的克隆人脆性组氨酸三联体（FHIT）基因,构建其真核表达质粒pRcCMV-FHIT。方法提取人外周血总RNA,用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术扩增人FHITcDNA全长开放阅读框序列,PCR产物与中间载体pGEM-T连接后转化到大肠杆菌DH5α。然后对单菌落进行菌落PCR、限制性内切酶酶切鉴定和测序。用EcoRI将目的片段切下,插入真核表达载体pRc／CMV2的相应位点,构建表达质粒pRc／CMV2-FHIT,将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR、酶切鉴定。结果测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的FHITcDNA含有781个碱基,与Genbank（NM_002012．1）序列完全一致。pRc／CMV2-FHIT经酶切鉴定与预期结果一致。结论成功构建重组真核表达质粒pRcCMV-FHIT,为进一步研究脂质体转染FHIT基因对结肠癌细胞株SW480凋亡作用的影响奠定基础。     

反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌细胞MBD1基因表达的影响

目的：探讨反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因表达的影响，为进一步研究该基因的作用提供依据。方法：构建反义MBD1基因真核表达载体，通过脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC 939中，以G418进行筛选得到稳定转染细胞株，用PCR鉴定外源性neoR基因在转染细胞中的表达以确定转染成功。半定量RT PCR观察转染前后MBD1基因mRNA水平的变化，流式细胞术检测转染前后MBD1蛋白的变化。 结果：人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的mRNA水平从0.912±0.022降低至0.215±0.017，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)；MBD1蛋白水平从(80.19±5.05)％降低到(35.11±4.05)％，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)。 结论：反义MBD1基因转染能降低人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的表达水平，提示MBD1基因在胆管癌的发生发展中具有重要作用，反义MBD1基因转染有可能成为胆管癌治疗的一种新方法。     

反义调控DNA甲基转移酶3b基因对人胆管癌细胞QBC939生长的影响

目的观察转染反义DNMT3b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞QBC939生长的影响，初步探讨DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法构建反义DNMT3b基因真核表达质粒，用脂质体介导法将其转人人胆管癌细胞株QBC939；Western blot检测转染前后DNMT3b蛋白表达的变化；MTT法和软琼脂克隆形成试验观察细胞的生长增殖能力；流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果转染反义基因能使DNMT3b蛋白表达水平降低；转染反义DNMT3b基因不能抑制QBC939的生长曲线，对其软琼脂克隆形成率亦无影响（P=0．717）；转染反义DNMT3b基因不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡（P=0．089）。结论转染反义DNMT3b基因真核表达质粒可下调DNMT3b在QBC939细胞中的表达水平，但对QBC939的生长和增殖无影响，也不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡的发生。     

靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响

目的：探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA（shRNA）的双链寡核苷酸并构建pSilencer2．1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察。结果：neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中。通过RT—PCR及westernblot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68固％和613％。细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓（P〈O．01）。流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少。DNAladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多。结论：靶向survivin的shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体外抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。     

葡聚糖磁性纳米颗粒靶向rhNIS基因浓聚125Ⅰ对胆管癌细胞生长的影响

目的 观察基因载体葡聚糖磁性纳米颗粒(DMN)靶向rhNIS基因浓聚125Ⅰ对胆管癌细胞QBC939体外培养和体内接种生长状态的影响.方法 构建DMN-rhNIS-PDC316复合物并转染QBC939细胞,设立实验组(DMN-rhNIS-PDC316)、脂质体转染对照组(Liposome-rhNLS-PDC316)、空白对照组(PDC316),转染后加入3μg DMN-125Ⅰ复合物并外置300 mT磁场,流式细胞仪检测细胞凋亡率.45只胆管癌裸鼠瘤体模型随机分组(每组n=15),经裸鼠尾静脉注入3μg DMN-rhNIS-PDC316、3μg Liposome-rhNIS-PDC316和3μg PDC316并在瘤体设置300 mT磁场,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定瘤体组织细胞内rhNIS-mRNA相对表达水平.另经尾静脉注入5μgDMN-125Ⅰ并外置500mT磁场,测定瘤体处125Ⅰ滞留率,观察治疗后瘤体大小变化.结果 流式细胞仪检测DMN-rhNIS-PDC316转染组细胞凋亡率为(20.12±1.62)%,明显高于其他两组(P<0.05),脂质体对照组凋亡率为(5.31±0.14)%,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),空白对照组凋亡率为(0.15±0.02)%;实验组瘤体细胞内rhNIS-mRNA表达水平较对照组明显增多;瘤体处125Ⅰ滞留率达到18.52%,明显高于对照组;125Ⅰ治疗后实验组抑瘤效应达到64.32%;瘤体体积明显小于对照组,其差异有统计学意义(P<0.05).结论 葡聚糖磁性纳米颗粒能有效靶向rhNIS基因转染胆管癌细胞并稳定表达,增加125Ⅰ的摄入量和滞留率,促进胆管癌细胞的凋亡,而且抑瘤效应明显.     

Apr-1基因对胆管癌细胞QBC939细胞周期的调节机制研究

目的 研究Apr-1基因对胆管癌细胞的细胞周期调节作用及机制.方法 采用脂质体介导法将Apr-1基因转染胆管癌细胞系QBC939,建立稳定表达Apr-1基因的细胞模型(QBC939-Apr-1).运用RT-PCR检测转染前后QBC939细胞系中Apr-1 mRNA的表达;流式细胞分析以及生长曲线等方法观察目的 基因对该细胞系的细胞周期的影响.采用细胞周期基因芯片,观察Apr-1基因对细胞周期相关基因表达的调节作用.结果 Apr-1基因在QBC939细胞系中呈阴性表达,转染Apr-1基因的QBC939-Apr-1细胞出现了Apr-1 mRNA的表达,成功建立了稳定表达Apr-1基因的细胞模型,该细胞模型表现出细胞生长受抑,细胞周期显示G2期细胞由9%增加至13%(P＜0.01).细胞周期抑制;并且细胞周期基因芯片检测结果发现:Skp2、UBE基因的表达水平出现明显上调,而CDC6、Cyclin H等25种基因的表达下降,其中MRE11A、CKS2、CDK8、CDC45下调在3倍以上.结论 Apr-1基因在体外能够使QBC939细胞的细胞周期在G2期延长,出现细胞周期多种调节基因的表达差异.

Abstract：

Objective To investigate the role and the mechanism of Apr-1 gene on cholangiocarcinoma QBC939 cell lines proliferation and cell cycle regulation. Methods Apr-1 gene was transfected into QBC939 cells by using liposomes to establish a QBC939 cell model ( QBC939-Apr-1 ) stably expressing Apr-1 gene. Apr-1 mRNA expression and the changes in cell cycle and cell growth of QBC939 cells were analyzed by RT-PCR, flow cytometry ( FCM ) and growth curve before and after transfection. The regulatory effect of Apr-1 gene on the expression of cell cycle-related genes was investigated in QBC939 cells before and after Apr-1 transfection using cell cycle gene microarrays. Results Significant suppression of cell growth was observed with the cell model stably expressing Apr-1 gene. Apr-1 over-expression caused cell arrest from 9% to 13% (P ＜0. 01 ) increase in G2 population. Cell cycle gene microarrays demonstrated that the expression of Skp2 、UBE1 was up-regulated, while the expression of MRE11A 、CKS2 、CDK8 、CDC45 was down-regulated by more than 3 folds. Conclusions Apr-1 gene suppresses QBC939 cell proliferation in vitro, QBC939 cells presented with differences in the expression of cell cycle-related genes after Apr-1 gene transfection.     

脆性组氨酸三联体基因对胆管癌细胞凋亡的影响

目的 观察脆性组氨酸三联体(FHIT)基因对胆管癌细胞株QBC939凋亡的影响,探讨FHIT基因对细胞周期蛋白Cyclin D1的调控作用.方法 通过构建重组人FHIT真核表达质粒转染QBC939细胞,应用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡的变化,并通过荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测胆管癌细胞Cyclin D1表达的变化.结果 成功构建出重组人FHIT真核表达质粒并转染入QBC939细胞,转染后QBC939细胞的凋亡率明显增高(25.8%比30.9%比55.4%,P<0.05);并且Cyclin D1 mRNA表达下降至原细胞株的0.03倍,该基因蛋白质的表达也明显下降(0.33±0.02对比0.33±0.01比0.14±0.02,P<0.05).结论 FHIT基因可以促进QBC939细胞凋亡,并能下调Cyclin D1基因的表达.     

WWOX表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨含有WW结构域的氧化还原酶基因(WWOX)表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 用脂质体转染法将WWOX重组真核表达质粒转染QBC939细胞;采用荧光定量逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法鉴定WWOX在QBC939细胞中的表达;流式细胞仪(FCM)法检测转染前后各细胞凋亡率的变化;JC-l染色法检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;荧光定量RT-PCR和Western blot法检测胆管癌细胞bcl-2表达的变化;将未转染和转染空质粒的细胞作为对照组接种到裸鼠皮下以检测荷瘤,TUNEL方法原位检测移植瘤的凋亡.结果 建立了稳定表达WWOX基因的QBC939/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.FCM显示QBC939/WWOX组的细胞凋亡率明显增高[(1.24±0.35)％比(1.73±0.48)％比(21.40±2.35)％,P＜O.01],JC-l显示转染组的线粒体膜电位下降[(4.27±0.64)％比(4.96±0.52)％比(28.60±3.94)％,P＜O.01],bcl-2 mRNA及蛋白的表达均显著降低(P＜0.05).转染组的皮下肿瘤较对照组生长速度明显减慢(P＜0.05),TUNEL实验证实转染组的皮下肿瘤凋亡指数为(13.6±1.5)％,较对照组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.O1).结论 WWOX基因能促进胆管癌细胞的凋亡,其机制可能与下调bcl-2的表达,激活线粒体凋亡通路有关.