日本血吸虫雄虫免疫血清对成虫cDNA文库的筛选及克隆分析

目的　筛选和分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新基因 ,为血吸虫疫苗研究提供新的候选分子。 方法　以日本血吸虫雄性成虫抗原免疫兔血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR鉴定及测序分析。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白的结构与功能。结果　筛选获 11个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 7～ 2 3kb之间。对部分阳性克隆进行测序分析 ,获两个Sj新基因 ,即Sj-MA及Sj -Cp8(登录号分别为AF5 1980 8和AF5 2 4 896 ) ,分别编码 2 4 9和 71个氨基酸的核内蛋白和胞浆蛋白。Sj-MA蛋白含有 9个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N -肉豆蔻酸化位点。Sj-Cp8蛋白含一个跨膜区、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N -肉豆蔻酸化位点。结论　筛选Sj成虫cDNA文库所获得两个新基因 ,其编码的蛋白可能为存在于胞浆和胞核内的日本血吸虫的重要信息传递分子 ,有望成为新的血吸虫病疫苗候选分子。     

日本血吸虫雌虫抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库

目的筛选日本血吸虫(Schistosoma ja ponicum，Sj)新的疫苗候选基因或雌虫性别特异性基因。方法用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清，对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增，采用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆插入子进行测序，与GeneBank中的已知序列进行比对分析。结果共获得26个阳性克隆，其PCR产物大小约0．5～3kb。在进行测序的8个阳性克隆中发现了GeneBank未报道的Sj肌球蛋白的部分基因序列(GeneBank登录号为AY322148)和1个新基因(命名为Sj-F1，GeneBank登录号为AY261995)。Sj-F1编码的蛋白理论分子质量为13．45ku，等电点为6．29，富含α螺旋和随机卷曲，含多个蛋白激酶磷酸化位点，1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点和1个豆蔻酸位点。结论Sj雌虫免疫血清可识别Sj特异性抗原分子，该抗原基因是否为雌虫性别特异性基因及其作为日本血吸虫病疫苗候选基因的价值，有待进一步研究。     

日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库与新基因分析

目的　筛选与日本血吸虫尾蚴抗原有共同免疫原性的日本血吸虫成虫抗原分子,为血吸虫病诊断和疫苗研究提供新的候选分子。　方法　利用日本血吸虫尾蚴可溶性抗原免疫兔血清筛选日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)成虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。　结果　共筛选出13个阳性克隆,PCR扩增出特异的插入片段。测序分析获4个新基因SjCAI、SjCA、SjCAI2和SjCAI3(登录号分别为AF495883、AF515834、AY118086和AY129303),分别编码353、161、137和72个氨基酸的蛋白。SjCAI蛋白含6个DNA结合锌指,与原肠胚锌指蛋白XLCGF48.2有一定同源性;SjCA蛋白、SjCAI2蛋白和SjCAI3蛋白含N糖基化和磷酸化位点。　结论　筛选Sj成虫cDNA文库获得了新的基因序列。     

日本血吸虫雌虫抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库

目的　筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的疫苗候选基因或雌虫性别特异性基因。　方法　用Sj雌虫抗原免疫家兔制备血清 ,对Sj成虫cDNA文库进行免疫筛选 ,将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增 ,采用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法对阳性克隆插入子进行测序 ,与GeneBank中的已知序列进行比对分析。　结果　共获得 2 6个阳性克隆 ,其PCR产物大小约 0 .5～ 3kb。在进行测序的 8个阳性克隆中发现了GeneBank未报道的Sj肌球蛋白的部分基因序列 (GeneBank登录号为AY3 2 2 14 8)和 1个新基因 (命名为Sj F1,GeneBank登录号为AY2 61995 )。Sj F1编码的蛋白理论分子质量为 13 .45ku ,等电点为 6.2 9,富含α螺旋和随机卷曲 ,含多个蛋白激酶磷酸化位点 ,1个酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个豆蔻酸位点。　结论　Sj雌虫免疫血清可识别Sj特异性抗原分子 ,该抗原基因是否为雌虫性别特异性基因及其作为日本血吸虫病疫苗候选基因的价值 ,有待进一步研究。     

旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 探讨旋毛虫与血吸虫之间交叉免疫的分子机制,并寻找有效的日本血吸虫疫苗侯选分子。方法 以旋毛虫感染鼠血清为探针,筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对获得的阳性克隆插入片段进行PCR扩增。结果 共筛选出11个阳性克隆,其插入的cDNA片段大小在1．4－5．0kb之间,其中1．4kb片段2个,5．0kb片段9个。结论 获得的阳性在隆插入基因片段可能为编码旋毛虫与日本血吸虫共同的抗原基因,其表达产物可能有抗日本血吸虫感染的作用。     

日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库的免疫筛选及PCR初步鉴定

用成虫抗原免疫免血清筛选构建于表达载体λgt11的日本血吸虫成虫cDNA文库，再以多聚酶链反应（PCR）技术鉴定免疫筛选的阳性克隆。结果，对cDNA表达库中随机选取的约6.2×104个噬菌斑进行了筛选．初筛时共挑出52个可能的阳性斑，经两次复筛后，有25个噬菌仍呈阳性反应；以阳性噬菌斑DNA为模板，经PCR扩增均可获得一定大小的片段，从564bp到1200bp不等。这样能快速大量地筛选cDNA文库，便于高效地获得有价值的重组抗原基因克隆。     

免疫筛选日本血吸虫cDNA文库的研究进展

日本血吸虫病是一种流行广泛并严重危害公众健康的人兽共患寄生虫病.目前研制开发高效的抗血吸虫疫苗和新型药物已成为血防科研的热点领域.     

日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫筛选

目的：从日本血吸虫虫卵文库中筛选并鉴定出与免疫诊断及免疫预防有关的基因克隆。方法：采用Ｓ．ｊＳＥＡ超免疫兔血清对日本血吸虫卵文库进行筛选。先去除抗大肠杆菌抗体，经三轮筛选得到１２个阳性克隆，然后，用辅助噬菌体进行体内剪切，经抗菌素平板筛选含重组质粒的阳性菌落，每个菌落分为２份，一份进行ＰＣＲ扩增以测定插入片段的大小。另一份用于制备纯质粒ＤＮＡ模板，进行ＤＮＡ序列测定，通过ＧＣＧ软件对所得ＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ中的序列进行同源性比较。结果：共筛得１２个阳性克隆，ＰＣＲ后测得其长度大多为１．２ｋｂ，其中８个与Ｓ．ｊ热休克蛋白７０的基因同源，２个与Ｓ．ｊ钙网蛋白同源，１个与Ｓ．ｍｉｍｍｕｎｏｐｈｉｌｉｎ同源，１个与Ｓ．ｊ２３ｋＤａ蛋白同源。结论：本研究首次报道用抗ＳＥＡ血清对日本血吸虫虫卵文库的筛选结果，所得的１２个阳性克隆均为编码日本血吸虫免疫诊断及预防有关的基因。     

水牛感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 筛选新的有潜质的日本血吸虫保护性抗原分子编码基因。方法 用水牛感染血清对日本血吸虫(Schistosoma Japonicum，Sj)成虫cDNA文库进行免疫筛选，将阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。结果 3轮筛选后，将7个阳性克隆经辅助噬菌体自动剪切并PCR扩增显示，插入的日本血吸虫cDNA片段大小在0．8～2．0kb之间，选取其中4个经DNA测序分析，发现2个未曾报道过的日本血吸虫新基因，分别命名为Sj-IB1和Sj-Rho GTPase-like gene，并在Gene Bank登记注册。结论 水牛感染血清可识别日本血吸虫的特异性抗原分子，这些抗原分子的免疫保护作用值得进一步研究。     

日本血吸虫未成熟卵抗血清对日本血吸虫cDNA文库的免疫筛选

目的为了获得抗雌虫生殖和卵胚发育相关抗原的血吸虫基因。方法通过采用抗日本血吸虫未成熟卵SIEA26—28kDa免疫血清对日本血吸虫成虫cDNA文库进行筛选。结果共获得阳性克隆23个,经重复筛选之后,随机挑取其中的5个阳性克隆,分别进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳显示获得单一扩增条带,其大小位于150bp～1.5kb之间。结论从SjcDNA文库中筛选出抗卵相关阳性克隆,有关分析鉴定在进一步进行中。     

大鼠抗感染血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　探讨大鼠抗日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)感染的分子机制 ,为血吸虫病疫苗的研制提供新的抗原分子。方法　用Sj感染大鼠血清筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆cDNA插入片段进行PCR扩增及测序分析。 结果　对cDNA文库中约 3× 10 5个噬菌斑进行筛选 ,获 7个阳性克隆 ,其插入基因片段大小为 0 9kb～ 2 0kb。初步测序获 5个部分序列 ,其中R3与Sj线粒体基因明显同源 ;R5为新基因序列 ,命名为Sj-Cs2 (GenBank的登录号为AY0 36 5 80 ) ,经计算机分析该基因片段编码 2 0 6个氨基酸组成的跨膜蛋白 ,Sj-Cs2蛋白含有 3个蛋白激酶C磷酸化位点和 6个N -肉豆蔻酸化位点 ;其余序列亦为新基因片段 ,但无完整编码框。结论　筛选获得了与大鼠抗Sj感染有关的基因克隆 ,相关克隆cDNA全长的获取、新基因的结构与功能以及免疫学特性值得深入研究     

日本血吸虫童虫cDNA文库免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

用日本血吸虫感染14 d的小鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,将获得的7个阳性克隆进行核苷酸序列同源性分析,结果显示其中一个克隆所测序列与日本血吸虫HSP70有很高的同源性（分值score=650）,另有2个克隆所测序列分别与已报道的日本血吸虫FABP（score=229）和含锌指结构的CDGSH型蛋白样蛋白（score=246）明显同源,其余4个未找到已知的同源序列,为新基因。4个新基因序列已被GenBank接受（登录号为EU121231、202646、202647和202648）。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫筛选和阳性克隆的鉴定

目的寻找可用于日本血吸虫病诊断或疗效考核的抗原分子。方法在安徽省安庆市某现场,采集经粪检(Kato-Katz法,2送6检)日本血吸虫卵阳性的10份患者血样,患者年龄13～64岁,EPG为4～172;并收集该10例患者经吡喹酮(60 mg/kg×2 d)治疗6个月后的血样,将吡喹酮治疗前和治疗后的血清各10份分别混合,分别筛选虫卵cDNA文库,将所获阳性克隆分类,测定阳性克隆插入片段的DNA序列,经BLAST程序分析同源性,并利用在线的生物信息学软件预测阳性克隆基因编码蛋白的结构和功能。结果初次筛选共获得75个阳性克隆,其中46个阳性克隆吡喹酮治疗前和治疗后的日本血吸虫病患者血清反应一致(为Ⅰ类),21个阳性克隆吡喹酮治疗前的血清强于治疗后的(为Ⅱ类);8个阳性克隆吡喹酮治疗后的血清强于治疗前的(为Ⅲ类)。结合反应强度、分类和插入片段的大小选择了14个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,多数阳性克隆插入片段均属于虫卵毛蚴抗原家族,1个阳性克隆的插入片段与含EF-hand结构域的钙结合蛋白具有一定的同源性(分值=143),1个阳性克隆的插入片段与应激反应组分1前体具有较高的同源性(分值=487),其余阳性克隆的插入片段仅与假定蛋白有一定的同源性,蛋白功能无明确注释。结论用吡喹酮治疗前后的日本血吸虫病患者血清筛选虫卵cDNA文库,获得的29个阳性克隆在吡喹酮治疗前后有差异。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定

目的　免疫法筛选日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,S j) 15d肝期童虫cDNA表达文库 ,并进行鉴定 ,以获得S j疫苗候选抗原分子。方法　采用紫外线照射致弱尾蚴免疫的兔血清 ,对S j中国大陆株 15d肝期童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,选取部分阳性克隆进行插入片段的核苷酸序列分析 ,将结果通过Internet送入NCBIGenBank进行同源性比较 ,并将发现的新基因送入GenBank登录。结果　对大约 10 4个噬菌斑进行了初筛 ,共获得 4 9个阳性克隆 ,复筛了其中的 12个克隆 ,获得 8个持续阳性反应克隆。对 6个克隆的核苷酸序列测定及同源性分析表明 ,2个为编码S j线粒体的基因 ,另外 4个为S j未知基因 ,新基因序列已被GenBank接受 ,并获得进入编号。 结论　从S j肝期童虫cDNA文库中筛选到一批S j基因 ,其中部分为未知基因 ,为血吸虫新的疫苗候选分子的研究提供了材料。     

紫外线致弱尾蚴免疫猪血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 寻找紫外线致弱日本血吸虫尾蚴中起免疫保护作用的候选抗原分子,为血吸虫疫苗研究提供新的候选靶位抗原.方法用紫外线照射致弱尾蚴免疫猪血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,测定用于筛选的cDNA文库滴度,选用最佳滴度的cDNA文库用于筛库.结果测得最佳cDNA文库的滴度为1.89×109 ρfu/mL,经3轮筛选,致弱尾蚴组分别获得20个、10个阳性克隆,经3轮筛选获7个阳性克隆;对照尾蚴组获15个和9个阳性克隆,经3轮筛选获3个阳性克隆;无尾蚴感染组未获阳性克隆.结论获得的阳性克隆可能为寻找编码抗日本血吸虫感染的抗原基因提供了材料与方向.     

日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库的构建

目的 构建日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。 方法 用Trizol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA，分离纯化mRNA，经随机引物反转录合成双链cDNA。在双链cDNA末端加上定向EcoRⅠ/HindⅢ接头，再用EcoRⅠ和HindⅢ消化，使其成为两端分别带有EcoRⅠ和HindⅢ粘性末端的双链cDNA。收集300 bp以上的双链cDNA片段，与T7Select 10-3b载体连接，经体外包装后，以大肠埃希菌BLT5403为宿主菌构建T7噬菌体展示cDNA文库。通过滴度测定及PCR技术鉴定文库质量，用7种特异性引物以PCR法从文库中钓取目的基因以检测文库的代表性。 结果 原始文库的库容量为4.98×10⁶ pfu，扩增后文库滴度为3.85×10¹¹ pfu/ml。对随机挑取的96个噬菌斑进行PCR鉴定，重组率为93.8%，其中95.6%的插入片段大于300 bp。7种特异性引物均能从文库中钓取到日本血吸虫成虫相关基因。 结论 构建了日本血吸虫成虫T7噬菌体展示cDNA文库。     

日本血吸虫成虫cDNA表达文库免疫筛选及抗原表达克隆的鉴定

用表达载体λgtll构建日本血吸虫成虫cDNA表达文库,并直接以日本血吸虫病人血清抗体筛选,从1.5×10~4个噬菌体克隆中筛选出9个阳性克隆.经Western印渍分析,Sjll4,Sill5,Si116 3个克隆显示有大于β-半乳糖苷酶的重组融合蛋白带,并被日本血吸虫病人血清所识别,其分子量分别为130、135和 130kDa.经重组DNA技术获得单一性日本血吸虫抗原蛋白,对于研究日本血吸虫病、血吸虫和宿主之间的复杂关系和大量制备标准化日本血吸虫病诊断抗原或疫苗侯选成分具有重要意义.