过表达人TSHR-A亚单位的重组腺病毒Ad-TSHR289/6xHis载体构建与鉴定

目的：构建以促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor,TSHR）A亚单位（TSHR289）基因片段为免疫原的重组腺病毒载体,以期建立Graves病（Graves’s disease,ＧＤ）动物模型,为探讨中药复方对GＤ的防治作用提供条件。方法：利用重叠PCR技术从 pSV2neoECE-TSHR289-6H-dhfr 质粒中将目的基因TSHR289扩增至载体attB1-Kozak-TSHR289/6xHis/IRES/eGFP-attB2,琼脂糖凝胶电泳回收,GatewayR技术构建重组腺病毒载体（pAV.EX1d-TSHR289/6xHis/IRES/eGFP,pAd-TSHR289/6xHis）,转化到大肠杆菌Stbl3中,菌落PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。将pAd-TSHR289/6xHis转染HEK293A细胞包装腺病毒,CsCl梯度离心法纯化腺病毒,TCID50法检测病毒滴度。RT-PCR法检测HEK293A中TSHR289的mRNA表达。应用该腺病毒免疫BALB/c小鼠制备GＤ模型。结果：菌落 PCR 筛选阳性克隆,测序证明构建正确;细胞感染腺病毒后出现明显细胞病变及增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）表达;RT-PCR 检测证实重组腺病毒转染的细胞中TSHR289的mRNA表达量是未转染的285倍;实验测得病毒滴度为3.16×1010 PFU/ml;BALB/c小鼠免疫第10周T4、TSHR抗体（TRAb）阳性率7/10。结论：成功构建了过表达人TSHR289基因的重组腺病毒载体,动物实验证明该腺病毒诱发自身免疫,产生TRAb。为下一步体内药物治疗GＤ试验提供了条件。     

CD_(80)/CD_(86)在Graves病动物模型中的表达及意义

目的:探讨CD80/CD86在动物模型各组织的表达及意义。方法:将23只BALB/c小鼠分为两组,分别注射Ad-Lacz(对照组)或促甲状腺素受体A亚单位重组腺病毒(Ad-TSHR289)诱导甲亢(造模组)。所有小鼠于第2次注射后两周取血、甲状腺、胸腺、心脏、肝脏和脾脏。放免法测T4,实时定量PCR或免疫组化测CD80/CD86的表达。结果:造模组小鼠的甲状腺组织以及肝脏组织的CD86表达明显增高(P<0.05),而CD80表达在各组间无明显差异(P>0.05)。结论:CD86可能参与了GD的发病机制,是甲亢引起肝脏损伤的潜在危险因素。     

促甲状腺素受体在亚临床甲状腺功能减退小鼠心室肌的表达及意义

【摘要】 目的 探讨促甲状腺素受体（TSHR）在亚临床甲状腺功能减退（SCH）小鼠心室肌的表达及意义。方法 30只BALB/c小鼠随机分为对照组及实验组,每组15只。实验组小鼠构造亚临床甲状腺功能减退动物模型,对照组小鼠饮用正常水,腹腔注射等量生理盐水。比较两组小鼠超声心动图检测结果,血清TT3、TT4、TSH水平。免疫组织化学染色法检测各组小鼠心室肌组织中TSHR的表达情况。结果 两组超声心动图检测结果显示,实验组E/E’值高于对照组（P＜001）。两组TT3水平比较差异无统计学意义(P＞005);实验组血清TT4水平明显低于对照组,血清TSH水平明显高于对照组（P＜001）。免疫组织化学染色结果显示,实验组心室肌组织中TSHR表达明显高于对照组。结论〓当发生亚临床甲状腺功能减退时,心室肌组织TSHR表达上调,与高浓度的TSH结合后可能通过某种机制影响心脏舒缩功能。     

Graves病母鼠分娩后甲状腺自身抗体水平的观察

目的:建立Graves病小鼠模型,研究Graves病母鼠分娩后甲状腺自身抗体水平变化?方法:应用表达促甲状腺激素刺激激素受体(thyrotropic-stimulating hormone receptor,TSHR) A亚单位的重组腺病毒Ad-TSHR-289免疫雌性Balb/c小鼠制备Graves病动物模型?将6周Balb/c雌性小鼠随机分为实验组?对照组,分别用重组Ad-TSHR-289?Ad-β-gal经小鼠腿部肌肉注射,免疫剂量均为3.3 × 108 pfu/50 μl PBS,每隔3周免疫1次,共3次?免疫结束后,内眦静脉取血,检测血清甲状腺素(T4)?促甲状腺素受体抗体(TRAb),然后分别与Balb/c雄性小鼠配对,确定妊娠后继续饲养至分娩?分娩后1 d,处死母鼠,检测母鼠血清T4?TRAb?抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)?甲状腺球蛋白抗体(TGAb),并分离母鼠甲状腺,行组织学检查?结果:实验组中96.7%的母鼠血清TRAb水平显著增高(P < 0.05);实验组第3次免疫后有56.7%(17只) 的小鼠达到甲亢标准,分娩后73.3%(22只)的母鼠达到甲亢标准;实验组中16.7%的母鼠血清TPOAb水平明显高于正常范围;母鼠血清TGAb较对照组显著增高,差异有统计学意义(P < 0.05)?结论:利用Ad-TSHR-289免疫Balb/c小鼠可以成功制备Graves病小鼠模型?分娩后Graves病母鼠血清TPOAb及TGAb水平升高可能与TRAb有关?     

灵芝多糖在Graves病小鼠模型中对甲亢及甲亢肝脏功能损伤的影响

目的 探讨灵芝多糖对Graves病(GD)模型小鼠甲状腺功能亢进症(甲亢)及其所致肝脏功能损伤的影响.方法 利用促甲状腺素受体A亚单位(TSHR-A)免疫BALB/c小鼠获得GD动物模型,检测小鼠血清甲状腺素(T4)、促甲状腺素受体抗体(TRAb)和肝功能指标并分析相关性.在建模过程中,分别给予纯水、低剂量灵芝多糖(100 mg·kg-1·d-1)和高剂量灵芝多糖(400 mg·kg-1·d-1)灌胃,观察小鼠血清T4、TRAb和肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)的变化.结果 与模型组未发生甲亢和对照组小鼠比较,模型组发生甲亢小鼠的血清ALT、AST和ALP水平均显著升高(P＜0.05),血清AST、ALP与T4水平呈显著正相关(r值分别为0.585和0.744,P＜0.05),与TRAb水平无相关性(P＞0.05).灵芝多糖干预后,模型小鼠血清T4和TRAb无显著变化(P＞0.05).经低剂量灵芝多糖干预的模型组发生甲亢小鼠的肝功能指标(血清ALT和ALP)均显著优于纯水组(P＜0.05).结论 灵芝多糖对GD模型小鼠的甲亢状态无明显影响,但对甲亢引起的肝脏功能损伤具有改善作用.     

变形链球菌亚单位疫苗SBR制备及经颌下腺免疫小鼠的抗体应答

目的:探讨变形链球菌(S.mutans)唾液结合区段(SBR)作为亚单位防龋疫苗的免疫原性,并评价经涎腺接种诱导有效免疫应答的可行性。方法:构建含S.mutansSBR基因的重组原核表达质粒pTriEx-4-SBR,用该质粒转化大肠杆菌E.coliJM109DE3,培养转化后的E.coli并诱导其表达SBR蛋白;以SBR蛋白作为亚单位防龋疫苗经颌下腺免疫BALBC小鼠,ELISA检测特异性抗体指标。结果:纯化得到的SBR蛋白与预期相符;ELISA结果表明,SBR蛋白经颌下腺免疫小鼠能够诱导血清抗SBR特异IgG(P<0.01)、唾液抗SBR特异IgGP<0.01、唾液抗SBR特异IgAP<0.01显著应答。结论:本实验所表达及纯化的SBR蛋白经涎腺接种途径可诱导明显的免疫应答。     

Graves病动物模型建立研究进展

Graves病(GD)为甲状腺功能亢进中最常见的类型,约占80%～85%。目前,GD的发病机制尚未明确,建立成功的动物模型,有助于研究该病免疫系统功能异常的发生机制及制定新的治疗策略。本文从细胞免疫、核酸免疫、腺病毒免疫、转基因动物模型等对近年来制备GD动物模型的研究进展作一综述。     

百日咳毒素B-亚单位在诱导小鼠自身免疫性疾病中的作用

目的:探讨百日咳毒素(PT)B-亚单位(PT-B)对小鼠自身免疫性疾病模型视网膜-脉络膜炎(EAU)的发病诱导作用。方法:①应用C57BL/6品系小鼠,以牛视网膜结合蛋白(IRBP)为抗原诱发小鼠视网膜-脉络膜炎;②将以上小鼠分为6组,分别以PT、PT-B(4个剂量)及空白作为免疫佐剂,与IRBP同时注射;③21d后对眼球行病理切片以判断发病情况,同时诱导耳部迟发型变态反应(DTH),并测量耳叶厚度;④取腹股沟及髂窝引流淋巴结,制备T细胞悬液,行T-细胞增殖实验,并取培养液上清,测IFN-γ、IL-12p70蛋白的表达水平;⑤取脾细胞提取mRNA,行RT-PCR测定IL-12p40基因表达水平。结果:PT-B亚单位与全毒素PT一样,可诱导小鼠自身免疫性疾病视网膜-脉络膜炎,并引起相应的免疫应答反应(与空白对照组相比P<0.01)。所用的PT-B不含有内毒素LPS成分的污染。结论:PT-B亚单位是PT作为自身免疫性疾病诱导增强佐剂的主要有效成分。     

GD甲状腺功能亢进中TSHR和TRAb的研究现状

Graves病(GD)是常见的自身免疫性甲状腺病之一,发病机制尚不清楚。已有研究证实多个易感基因与GD发病相关,其中促甲状腺激素受体(TSHR)基因不仅是GD甲状腺功能亢进发病的一个易感基因,而且具有特异性。TSHR作为主要的自身抗原引起促甲状腺激素受体抗体(TRAb)的产生,是GD自身免疫反应的主要环节。TSHR易感基因及其编码的TSHR在免疫应答中的作用成为研究热点。由于TRAb是GD甲状腺功能亢进发生、发展的主要免疫标志,所以应关注TRAb在GD甲状腺功能亢进诊断、治疗选择、转归预测等方面的研究,为制订个体化的治疗方案提供科学依据。     

促甲状腺激素受体的裂解和脱落

促甲状腺激素受体(TSHR)是一种重要的自身抗原,TSHR的裂解和脱落可诱发自身免疫。裂解的TSHR是甲状腺主要的功能性受体,α亚单位的脱落对于刺激型TSHR抗体(TSAb)的形成及TSAb和阻断型TSHR抗体(TBAb)之间的平衡有重要意义,对于TSHR胞外域裂解和脱落的相关研究不仅有助于深入理解TSHR的结构和功能,而且有助于阐明自身免疫性甲状腺疾病的发病机制及探寻新的治疗方法。该文就TSHR概况、受体裂解和脱落的机制及其意义作一综述。     

TSHR基因上新发现SNP及其在GD致病中的评价

目的探讨TSH受体上单核苷酸多态性(SNP)与Graves病(GD)的相关性。方法(1)以一GD家系的12个成员(包括3例患者、9例家系成员)为研究对象,抽提外周血DNA,设计引物,扩增TSHR的全部外显子和部分内含子,PCR产物纯化后测序,对TSH受体的SNP进行筛查。(2)应用病例-对照研究方法,检测筛查出的SNP基因型和等位基因变化频率与GD有无相关性。结果共发现8个多态位点,其中第8外显子上的多态位点在SNP库中未见报道,为首次发现。这些多态位点的变化频率在患者与正常组间相比较,无明显统计学差异。结论新发现的SNP及其他多态位点与GD不连锁;提示汉族人TSH受体基因与GD无相关性;该基因的多态位点在不同的人种间存在明显差异。     

汉族人群促甲状腺素受体基因内含子1区域多态性与Graves病及临床表现的关系

目的:探讨汉族人群促甲状腺素受体（TSHR）基因内含子1区域上单核苷酸多态性（SNPs）位点与Graves病（GD）及临床表现的关系。方法:选取699例汉族GD患者和563名健康对照者入组。用TaqMan探针技术,检测GD患者和健康对照者14号染色体TSHR基因内含子1区上6个SNPs位点的基因分型,进行相关性分析,研究这6个SNPs与GD易感性关系。结果:GD患者和对照组rs179247、rs2284722、rs12101261、rs4903964四个位点在病例-对照中的分布上均具有显著差异（P<0.01）;rs12101261为与GD相关性最强的主效易感位点,与血清TRAb水平、性别有关,与甲状腺肿大程度、眼征无明显关联。结论:TSHR基因内含子1区域多态性与GD显著相关,其中rs12101261为相关性最强的主效易感位点,与促甲状腺素受体抗体阳性的GD患者发病密切相关。     

TSH受体基因多态性(D36H)与自身免疫性甲状腺疾病的关系

目的 :探讨TSH受体 (TSHR)基因 3 6D→H变异在中国辽南地区汉族人群中的分布情况以及与自身免疫性甲状腺疾病 (AITD)的关系。方法 :应用PCR -RFLP法测定 72例Graves病 (GD) ,5 8例桥本甲状腺炎(HT) ,5 0例健康对照者的TSHR -D3 6H变异率和基因型。结果 :GD组出现 1例TSHR -D3 6H变异(1.4% ) ,HT组有 2例变异 (3 .4% ) ,AITD(CD +HT)组共 3例 (2 .3 % ) ,对照组为 1例 (2 .0 % ) ;变异率在各病例组之间以及各病例组与对照组之间比较 ,差异不显著 (P >0 .0 5 )。 4例变异皆呈原始细胞杂合型 (GC型 )。结论 :TSHR -D3 6H是一多态性改变 ,它与AITD的发生不相关 ;但不排除与其他AITD易感基因 (位点 )及环境因素共同作用致病的可能     

促甲状腺激素受体抗体与Grave''''s病关系及其临床检测近况

本文扼要介绍促甲状腺激素激素受体(TSHR)结构,作为一种自身免疫性甲状腺疾病(AITD)主要抗原,它与促甲状腺激素受体抗体(TSHR-Abs)结合后,触发一系列生物化学级联反应,持续地刺激甲状腺细胞合成与释放甲状腺激素(T3T4)的增加,最终诱发Grave's病(GD),同时也介绍了一些当前推出的GD病人血清中TSHR-Abs检测新方法。     

正丁醇法制备大鼠脂肪组织细胞膜TSHR

目的:利用正丁醇对大鼠脂肪组织细胞膜上的促甲状腺素受体(TSHR)进行提纯,以获得膜受体的均一水溶性溶液。方法:使用差速离心法获得大鼠含TSHR脂肪组织细胞膜碎片后,用正丁醇进一步提纯;采用SDS-PAGE和ELISA法鉴定所得蛋白完整性、生物学活性,并用BCA法测定相关蛋白含量。结果:正丁醇提纯的大鼠TSHR结构完整;经正丁醇提纯后的TSHR包被酶标孔孔间测定值变异系数较未经正丁醇提取组以及阳性对照组低。结论:经正丁醇提纯后的大鼠TSHR可以满足临床ELISA法检测Graves病患者血清TRAb的要求,同时可以降低酶标孔间测定值的误差。     

促甲状腺激素受体基因启动子区甲基化与乳头状甲状腺癌的关系研究

目的观察促甲状腺激素受体（TSHR）在乳头状甲状腺癌（PTC）中的表达,分析其基因启动子区甲基化与肿瘤发生的关系。方法选择50例PTC和32例良性甲状腺肿瘤患者（对照组,包括20例结节性甲状腺肿和12例甲状腺腺瘤患者）,对两组患者手术获取的标本提取RNA后,逆转录为cDNA,进行PCR,检测鸭HR基因的表达情况;运用甲基化特异性PCR（MSP）法检测上述组织中TSHR基因启动子区甲基化的情况。结果PTC组患者中,有34例（68．0％）TSHR基因启动子发生甲基化,16例（32．0％）TSHR基因mRNA表达缺失;对照组患者中,有7例（21．9％）TSHR基因启动予发生甲基化,4例（12．5％）TSHR基因mRNA表达缺失,PTC组织TSHR基因启动子区甲基化率及TSHR基因mRNA表达缺失率均显著高于对照组,差异有统计学意义（X^2值分别为16．61和4．02,P〈0．05）。34例发生了TSHR基因启动子区甲基化的PTC患者中,有14例（41．2％）TSHRmRNA表达缺失;16例未发生甲基化的PTC患者中,2例（12．5％）发生了mRNA表达缺失,二者mRNA表达缺失率间差异有统计学意义（X^2=4．11,P〈0．05）。结论PTC患者TSHR基因启动子甲基化发生率显著高于良性甲状腺肿瘤患者,而TSHR基因mRNA的表达则较良性甲状腺肿瘤降低;推测TSHR基因启动子区甲基化可能与PTC的发生、发展相关。     

促甲状腺激素受体在甲状腺相关眼病眼外肌原位表达的研究

OBJECTIVE: To investigate the expression of thyrotropin receptor (TSHR) in the extraocular muscles (EOM) of the eyes of patients with thyroid-associated ophthalmopathy (TAO). METHODs: EOM specimens were obtained from 12 patients with severe TAO and 10 healthy subjects within 1 hour after accidental death and the paraffin-embedded sections were observed by streptavidin-peroxidase (SP) immunohistochemical methods. RESULT: The expression of TSHR was observed in the perimysium, cytomembrane and cytoplasm in 10 of the 12 TAO specimens, accounting for a TSHR expression rate of 83.3% in the EOM of TAO patients. No TSHR protein was found in the healthy subjects. CONCLUSION: High TSHR expression in the EOM of TAO patients indicates that as a common antigen between the orbit and thyroid, TSHR play a key role in the pathogenesis of TAO.     

促甲状腺激素受体在甲状腺相关眼病眼外肌原位表达的研究

目的研究甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy, TAO)患者眼外肌组织中促甲状腺激素受体(Thy-rotropin receptor, TSHR)的表达,确定TSHR在TAO发病机制中的作用。方法收集手术治疗的12例严重的TAO患者的眼外肌组织标本及10例健康人意外死亡1 h内取出的眼外肌组织标本,4%中性甲醛固定24 h,石蜡包埋组织,作连续切片,采用免疫组织化学链霉卵白素·过氧化物酶连接法对12例严重TAO患者及10例健康人的眼外肌石蜡组织切片进行光学显微镜观察。结果TSHR在眼外肌肌束膜、细胞膜及少量胞浆中表达,12例TAO患者中有10例检测出TSHR蛋白,阳性检出率为83.3%,正常对照组未检测出TSHR蛋白的表达。结论TSHR蛋白TAO患者眼外肌组织中有表达,而在正常个体中没有表达,证实TAO患者球后眼外肌组织中存在有活性的TSHR蛋白,提示TSHR可能作为交叉抗原在TAO发病机制中起重要作用。     

促甲状腺激素受体的分子结构与自身免疫疾病的相关研究进展

Graves'病是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病,与其他自身免疫性疾病引起器官损伤不同,它表现为器官的高功能状态,临床特征为甲状腺功能亢进。在Graves’病中,甲状腺刺激性自身抗体模仿TSH的作用,刺激甲状腺细胞产生及分泌过多的甲状腺激素。目标抗原TSHR的分子结构是导致甲状腺刺激性自身抗体产生的主要原因。编码TSHR的基因位于人14号染色体长臂3区1带,翻译后完整的TSHR要经过一系列加工修饰,如糖基化,硫酸盐化,蛋白棕榈化及裂解和脱落等。近十年来我们对TSHR受体分子的结构和功能特点及其与Graves’病发病相关性等方面的研究有了更大突破。本文就此领域做一综述。