携带反义热休克蛋白70抑制人喉癌细胞的生长

目的 构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究.方法 将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70.结果 成功的构建携带反义HSP70的重组腺病毒载体系统,经测病毒滴度可达8×109.HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经Western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70.转染反义HSP70的腺病毒载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有.结论 构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70可望有效地将反义HSP70导入人喉癌细胞株,为进一步研究喉癌基因治疗提供实验基础.     

联合应用抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

目的构建含有抗原加工递呈分子基因HSP70C的HTNV嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒。方法通过PCR扩增获得HSP70C基因,分别克隆入本室已构建的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7及pShuttle-pCAGGcS0.7中,进而构建新的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7-HSP70C及pShuttle-pCAG-GcS0.7-HSP70C。进一步通过双酶切将转移载体中的目的嵌合基因再分别克隆入腺病毒载体,得到重组腺病毒载体rAd-pCAG-GnS0.7-HSP70C、rAd-pCAG-GcS0.7-HSP70C,使用Pac I线性化后转染HEK293细胞,包装后获得重组腺病毒,感染HEK293细胞后用免疫荧光法检测表达产物。结果经过酶切、PCR扩增和测序结果显示,各重组腺病毒转移载体及重组腺病毒载体构建正确。免疫荧光实验检测到各重组腺病毒中目的蛋白的表达。结论成功制备了含抗原递呈分子HSP70C基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒,为进一步研究构建的汉滩病毒重组腺病毒的免疫学特性奠定了实验基础。     

人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制备

目的:利用HEK293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素(canstatin)重组腺病毒载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法:PCR法扩增cansta-tin全长基因,克隆至pGEM-T载体,经酶切和测序证实后,亚克隆到穿梭质粒pAdS-CMV中,获得穿梭质粒pAdS-CMV/canstatin.用PasI酶单独酶切穿梭质粒pad5-CMV/canstatin和腺病毒E3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体,采用标准的磷酸钙方法共转染HEK293细胞.7～10 d后收获细胞裂解物,在HEK293细胞中扩增,病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,分光光度计检测重组病毒滴度.结果:测序证实pEGM-T/canstatin基因片段与GenBank公布的can-statin基因序列一致.重组腺病毒质粒转染293细胞后24 h观察到绿色荧光,病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/L).结论:成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒,为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.     

小鼠HSP27基因腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:为深入研究热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)的生理与病理功能,应用PAdEasy腺病毒载体系统构建带荧光蛋白的小鼠HSP27重组腺病毒,并进行鉴定.方法:采用基因技术,将目的基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,通过PCR、序列测定、酶切鉴定;利用PAdEasy系统进行重组,在293细胞中包装和扩增,然后体外感染小鼠精原母细胞,Westernblot检测HSP27蛋白表达.结果:测序和酶切鉴定重组腺病毒质粒构建正确;经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获高滴度重组腺病毒体外感染小鼠精原母细胞,并且可正确表达HSP27.结论:应用PAdEasy系统重组技术成功构建了小鼠HSP27带荧光蛋白腺病毒载体,并在小鼠精母细胞系进行体外有效表达,为进一步研究HSP27的功能奠定基础.     

人生长终止特异性同源盒基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 生长终止特异性同源盒(growth arrest-specific homeobox,Gax)基因表达产物是核转录因子,主要存在于心血管系统中,对胚胎发育、细胞生长、分化和迁移等起基因调控作用,其表达异常与多种疾病相关.为深入研究Gax基因在临床疾病中的作用,文中构建表达了人Gax基因的重组腺病毒载体.方法 根据pEGFP-N1-Gax质粒的多克隆位点,用NheⅠ和Hind Ⅲ双酶切获得人Gax基因片段,连接至穿梭质粒pDC18-mCMV上,构建穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax,然后与骨架质粒pPE3共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-Gax,反复感染293细胞扩增病毒后,氯化铯梯度离心纯化病毒,并测定病毒滴度.结果 穿梭质粒pDC318-mCMV-Gax经双酶切和测序证实构建成功;PCR鉴定人Gax基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度为4.5×1010pfu/ml.结论 该研究成功构建了重组腺病毒载体Ad5-Gax,为进一步在体内外研究Gax基因参与多种疾病的发生发展提供了材料.     

Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒栽体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度.用逆转录PCR和westem blot法检测Mathl基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结果 构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确.四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度约为3X10"Tu/L.逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结论 成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达.     

人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的 利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒. 方法 自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中.酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒.重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达. 结果 经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒. 结论 成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体.     

重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定

目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。     

人K562细胞糖皮质激素受体基因阻断模型的建立

目的 利用腺病毒载体介导的RNAi技术,建立糖皮质激素受体基因阻断的人K562细胞模型。方法 将针对糖皮质激素受体发挥RNAi效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中,在含有pAdEasy-I病毒骨架的BJ5183大肠菌内进行同源重组;重组体通过脂质体介导转染293T细胞,并在293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒,通过反复感染扩增病毒以达感染靶细胞的适当滴度,通过绿色荧光表达来监测腺病毒扩增;应用Western blot法检测人K562细胞感染病毒后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果 重组腺病毒穿梭质粒psiGR/Adeno和重组腺病毒pAdEasy-siGR的成功构建;转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光,随着时间逐渐增强并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增,病毒达到合适的滴度;受腺病毒感染的K562细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论 可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNAi腺病毒载体,为进一步研究糖皮质激素受体的生物学功能奠定基础。     

含有人热休克蛋白基因的重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞的实验研究

目的:研究含有人热休克蛋白70(HSP70)基因的重组腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染效率以及基因转染后HSP70的表达。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)体外感染心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。结果:Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法以及免疫组化染色法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功地表达HSP70。     

重组腺病毒介导的HSP70转染对肠上皮细胞缺氧再复氧损伤的防护作用

目的　研究重组腺病毒介导的热休克蛋白 70转染对肠上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法　将重组含人全长HSP70基因的腺病毒载体 (AdCMVHSP70 )转染体外培养的肠上皮细胞株IEC 6 ,检测转染细胞HSP70的基因表达水平。对照组 (转染空载体组 )、转染HSP70 2 4h、48h及72h组IEC 6细胞经缺氧再复氧处理后 ,分别对细胞的活力、凋亡及死亡水平进行检测分析。结果AdCMVHSP 70转染组细胞HSP70基因表达为阳性 ,对照组无表达。经缺氧再复氧处理后 ,AdCMVHSP70转染组细胞活力较对照组明显增强 (P <0 0 1 ) ,Annexin V Flous试剂盒检测死亡细胞明显减少 (P<0 0 1 ) ,凋亡有一定水平的抑制 (P <0 0 5)。结论　重组腺病毒介导的HSP70转染可保护肠上皮细胞抵抗缺氧再复氧损伤 ,具有明确的细胞保护作用。而其具体保护机制可能与抑制细胞凋亡有关     

腺病毒介导的HSP70基因转染对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究热休克蛋白70(HSP70)基因转染对体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)感染体外心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,研究HSP70基因转染对心肌细胞的保护作用。结果:原代培养获得高纯度的乳鼠心肌细胞,随着MOI值升高,Ad.EGFP的感染效率和基因表达增强,在MOI值为50时,Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。免疫组化染色法结果显示,表达的HSP70主要分布于心肌细胞的胞质和胞核中;利用体外的缺氧/复氧损伤模拟在体的缺血/再灌注损伤,结果显示Ad.HSP70感染组的细胞活力、MT...     

Study on the preparation of recombinant human HSP70 and its presenting-antigen function

Heat shock protein 70 (HSP70 ) isolated fromtumor cells is conjunct with antigen- peptides so thatthe complex can activate immune response againsttumors in vivo[1— 3 ] .But this kind of complex can notbe used in tumor therapy because it is difficult toprepare on large scale.A promising solution to thisproblem will be the application of HSP70 ,which canbe prepared on large scale by genetic engineering,totumortherapy by binding antigen peptides in vitro.Inthisstudy,soluble HSP70 wasexpresse…     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…     

大鼠骨形成蛋白4基因重组腺病毒的构建

目的 利用Cre-loxP特异性位点基因重组技术构建大鼠骨形成蛋白BMP4的重组腺病毒.方法 高保真PCR得到大鼠BMP4 cDNA,克隆到质粒pCR-Blunt Ⅱ-TOPO中,然后将目的基因片段连接到中间载体质粒pDNR-CMV,测序后在Cre重组酶作用下,将BMP4 cDNA转移到腺病毒载体pLP-Ade-no-X-CMV.在HEK 293细胞中扩增重组腺病毒,并检测BMP4基因重组腺病毒在细胞中的表达和功能.结果 PCR法和限制性内切酶Xhol I消化法均证实BMP4重组腺病毒的成功构建,RT-PCR和Western Blot检测证实该重组腺病毒显著性增强了CFSC-2G细胞中BMP4的mRNA和蛋白表达水平.结论 Cre-loxP特异性位点基因重组技术是一种快速、高效构建基因重组腺病毒的方法,大鼠BMP4基因重组腺病毒的成功构建为进一步研究BMP4的细胞调控功能和BMP4基因治疗提供了良好的工具.     

细粒棘球蚴重组HSP70基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)热休克蛋白70(Heat shock protein,HSP70)基因的重组质粒并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒HSP70/pGEM-T中酶切HSP70目的片段,亚克隆入表达载体pET-28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达产物。结果成功构建Eg.HSP70/pET-28a/E.coli BL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到14kDaEg.HSP70均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。     

干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。