IRE1α 通过UPR 影响非洲爪蟾胚胎发育

目的:探讨IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中是否介导未折叠蛋白反应(UPR),并在衣霉素(tunicamycin,TM)诱导的胚胎发育畸形中发挥挽救作用?方法:利用TM处理胚胎激发内质网应激;应用显微注射mRNA方法实现基因过表达,通过注射特异的反义寡核苷酸morpholino(MO)实现基因封闭;RT-PCR检测XBP1 剪切情况?结果:XBP1 剪切随IRE1α过表达及封闭而增加或减少;TM处理导致胚胎发育畸形,XBP1剪切增加,封闭XBP1可部分挽救发育畸形;封闭IRE1a可明显挽救发育畸形,XBP1剪切恢复?结论:IRE1α在非洲爪蟾胚胎发育中介导UPR,封闭IRE1α可逆转TM诱导的胚胎发育畸形,部分通过XBP1途径发挥作用?     

IRE1α-JNK通路对早期非酒精性脂肪性肝病作用研究

目的 探讨IRE1α-JNK通路对早期非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型作用。方法 将20只C57/B6小鼠分为对照组、高脂饮食组、空白载体组、IRE1α-shRNA组;饮食干预前空白载体组,IRE1α-shRNA组分别腹部肝区注射空白慢病毒载体和IRE1α-shRNA慢病毒载体。对照组小鼠正常饮食,其余组小鼠高糖高脂饮食诱导NAFLD。HE染色观察肝内脂肪变性情况;透射电镜观察肝组织自噬相关结构;Western blot法检测IRE1α-JNK通路蛋白、凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax;自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1的表达。结果 与对照组比较,高脂饮食组IRE1α-JNK通路激活,与空白载体组比较,IRE1α-shRNA组IRE1α-JNK通路被抑制。油红O染色显示与空白载体组比较,IRE1α-shRNA组肝脏脂肪变性加重。电镜观察提示与对照组比较,高脂饮食组自噬相关结构增加,与空白载体组比较,IRE1α-shRNA组自噬相关结构减少。Western blot法检测提示与对照组比较, 模型组中肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表达无明显变化,而Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ明显增加, P62明显降低 (P均<0.05),注射IRE1α-shRNA慢病毒载体后Bax、caspase-3、P62蛋白表达均增加,而Bcl-2、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ减少(P均<0.05)。结论 IRE1α-JNK通路通过调节自噬和凋亡对早期NAFLD起保护作用。     

双氧化酶2在5-羟色胺加重的小鼠结肠炎模型中的表达及作用

目的 探讨5-羟色胺(5-HT) 对双氧化酶2 (Duox2) 在小鼠结肠组织中的表达情况及其在炎症中的意义.方法 选取6~8周龄的健康清洁级C57BL/6J(B6)雄性小鼠,随机分为5组(n=8):对照组自由饮用无菌蒸馏水;葡聚糖硫酸钠(DSS)(1.0%、2.5%)组自由饮用相应浓度的DSS溶液;5-HT组采用直肠灌药方式(1.0 mg/kg)给药,每3 d 1次;DSS+5-HT组同时给予1.0% DSS和5-HT.于造模第6天处死小鼠取结肠组织.通过结肠长度、疾病活动指数(DAI)评分和HE染色等方法评估肠道炎症程度,采用实时定量PCR(RT-PCR)检测小鼠结肠组织中白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和 Duox2 mRNA表达水平,应用免疫组化检测结肠组织中Duox2蛋白的表达情况.结果 对照组和5-HT组小鼠无肠炎表现;DSS (1.0%) 组小鼠表现为轻度肠炎;DSS+5-HT组和DSS (2.5%) 组有严重急性肠炎表现.IL-1β、IL-6和TNF-α等表达量随炎症程度加重而增加.Duox2 mRNA在5-HT组和DSS (1.0%) 组表达增高(均P<0.05),在DSS+5-HT和DSS (2.5%) 组表达下调(均P<0.05).免疫组化结果显示Duox2蛋白主要表达于小鼠结肠上皮刷状缘及上皮细胞胞质中,与mRNA表达一致.结论 5-HT可能通过影响Duox2的表达在小鼠结肠炎的发生发展中发挥作用.     

游离脂肪酸通过IRE1/XBP1通路调控高甘油三酯血症性急性胰腺炎肾损伤的机制研究

目的：探讨游离脂肪酸通过IRE1/XBP1通路调控高甘油三酯血症性急性胰腺炎肾损伤的机制。方法：将48只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组（CON组）、重症急性胰腺炎组（SAP组）、高甘油三酯血症性急性胰腺炎组（HTGP组）和CD36抑制剂组（SSO组）。在给予各组小鼠相应处理24 h后,获取小鼠血标本和胰腺、肾组织进行血清学检测、病理学分析及免疫荧光染色。结果：相比SAP组,HTGP组有着较高的甘油三酯和游离脂肪酸水平,且HTGP组的胰腺炎及肾损伤更严重。在HTGP组肾组织中,内质网应激相关的IRE1、XBP1蛋白及介导游离脂肪酸摄取的CD36蛋白的表达水平比在SAP组更高。此外,当给予HTGP组小鼠CD36抑制剂SSO后,SSO组小鼠较HTGP组胰腺及肾损伤减轻,炎症因子水平降低,且肾组织中IRE1、XBP1的表达水平也明显降低。结论：高甘油三酯血症性急性胰腺炎中,CD36介导的游离脂肪酸可激活内质网应激IRE1/XBP1通路调控相关肾损伤。     

低剂量辐射诱导小鼠睾丸细胞中IRE1α和XBP1 mRNA及其蛋白的表达

目的：检测小鼠睾丸细胞中肌醇需求酶1α（IRE1α）和X盒结合蛋白1（XBP1）mRNA和蛋白的表达,探讨IRE1-XBP1通路激活在低剂量辐射（LDR）诱导小鼠睾丸细胞内质网应激中的作用。方法：50只健康雄性ICR小鼠,随机分为10组,经75 mGy X射线全身照射后不同时间（0、3、6、12和24h）及不同剂量（0、50、75、100和200 mGy）X射线照射后12 h处死,分别采用实时定量PCR法和Western blotting法检测小鼠睾丸细胞中IRE1α、Total-XBP1（T-XBP1）和Spliced-XBP1（S-XBP1）mRNA表达水平及蛋白表达强度。结果：75 mGy X射线照射后0~24 h,小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA（除了3 h时T-XBP1和S-XBP1 mRNA）表达水平均随时间延长而升高,并在6 h时达到峰值,而后逐渐降低;与0 h组比较,6、12和24 h组IRE1α mRNA、6和12 h组T-XBP1 mRNA及S-XBP1 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05或P<0.01）。与0 h组比较,不同时间组IRE1α和S-XBP1蛋白表达强度升高,6和12 h组IRE1α蛋白表达强度升高最明显,24 h组S-XBP1蛋白表达强度升高最明显,而T-XBP1蛋白表达强度稍有降低。0~200 mGy照射后12 h,小鼠睾丸细胞中IRE1α、T-XBP1和S-XBP1 mRNA表达水平升高,75 mGyX射线照射后升高达峰值后逐渐降低,甚至降至0 mGy以下;与0 mGy组比较,75和200 mGy组小鼠睾丸细胞中IRE1α、75 mGy组小鼠睾丸细胞中T-XBP1和S-XBP1mRNA表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。与0 mGy组比较,75 mGy组IRE1α和S-XBP1蛋白表达强度升高,75和200 mGy组小鼠睾丸细胞中S-XBP1蛋白表达强度升高最明显,而T-XBP1蛋白表达强度无明显变化。结论：LDR可诱导小鼠睾丸细胞中IRE1α和S-XBP1 mRNA表达水平和蛋白表达强度增加,从而激活内质网应激中的IRE1-XBP1信号通路。     

IRE1α-XBP1通过上调IL-6表达促进黑色素瘤细胞增殖的分子机制

 目的  阐述内质网应激中IRE1α-XBP1信号通路在黑色素瘤细胞增殖中的作用及分子机制。方法  收集61例来自复旦大学附属中山医院的黑色素瘤患者的临床资料并进行分析,病理组织切片行XBP1s免疫组化染色并测定XBP1s的mRNA水平。过表达IRE1α和XBP1s,检测正常黑色素细胞系(HEMn-MP)及黑色素瘤细胞系(Mel-RMu)中IL-6和XBP1s的表达。在黑色素瘤细胞系中过表达IRE1α和XBP1s,联合使用IL-6中和抗体,检测黑色素瘤细胞增殖。结果  人黑色素瘤组织中XBP1s表达显著升高,在正常黑色素细胞系HEMn-MP和黑色素瘤细胞系Mel-RMu中,过表达IRE1α和XBP1s均可上调IL-6表达,且在黑色素瘤细胞系Mel-RMu可促进其增殖,给予IL-6的中和抗体后可部分抵消其促增殖作用。结论 IRE1α-XBP1s-IL-6信号通路通过分泌IL-6介导黑色素瘤细胞的增殖,最终效应由分泌IL-6来实现。     

IRE1α 影响非洲爪蟾胰腺发育

目的:探讨肌醇依赖性激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)对非洲爪蟾胰腺发育的影响?方法:通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降;利用整体胚胎原位杂交方法检测基因表达? 结果:IRE1α表达于爪蟾发育中的胰腺;利用基因特异性反义寡核苷酸敲降IRE1α后,非洲爪蟾肠道明显异常,胰腺内外分泌标志性基因胰岛素?淀粉酶表达显著减少;胰腺前体细胞的标志基因pdx1和p48表达明显减少;敲降IRE1α下游基因X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)后,非洲爪蟾的胰岛素?淀粉酶表达也明显减少?结论:IRE1α影响非洲爪蟾胰腺发育,可能通过XBP1发挥作用?     

HMGB1对炎症性肠病中氧化应激损伤的调控作用及其机制

目的 探究高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)小鼠模型中氧化应激的影响及其机制。方法 将小鼠分为对照组、DSS组、HMGB1重组蛋白(rhHMGB1)组和甘草酸组,每组6只。对照组小鼠正常饲养,DSS组小鼠自由饮用5%的DSS溶液6 d诱导IBD模型,rhHMGB1组和甘草酸组小鼠在IBD模型构建前,分别腹腔注射50μg/kg rhHMGB1和50μg/kg甘草酸。HE染色观察小鼠结肠病理形态,qRT-PCR和Western blot检测小鼠结肠组织HMGB1的表达,试剂盒检测小鼠结肠组织中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量,Western blot检测小鼠结肠组织核因子红细胞相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的蛋白表达。结果 与对照组比较,DSS组小鼠结肠出现病理损伤,HMGB1 mRNA和蛋白表达均上调(P<0.01),MDA水平增加(P<0.01),GSH水平下降,Nrf2、HO-1和GPX4表达下调(P<...     

IRE1α促进人牙周膜成纤维细胞增殖

目的 研究内质网跨膜蛋白IRE1α对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLFs)增殖的影响.方法 将成功构建的人IRE1α基因重组质粒染入hPDLFs细胞,采用免疫印迹法检测IRE1α重组基因在真核细胞内的表达情况,XTT法和流式细胞仪(FCM)检测转染后hPDLFs细胞增殖和细胞周期变化.结果 酶切及测序结果证实IRE1α重组质粒构建成功;免疫印迹分析结果证实,IRE1α重组质粒能在hPDLFs细胞内正确表达;在内质网应激(ERs)状态下,与衣霉素(tunicamycin,TM)对照组相比,XTT检测结果显示:IRE1 α实验组hPDLFs细胞增殖率明显增高(P＜0.01);FCM结果分析显示:IRE1α实验组hPDLFs细胞s期比例增加而G1期减少(P＜0.05).结论 在ERS状态下,IRE1α促讲hPDLFs细胞增殖,促进hPDLFs细胞从G1期进入S期.     

NADPH氧化酶Nox-4在DSS诱导的小鼠肠炎中的表达及作用

目的 研究Nox-4及抗氧化物在葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium,DSS）诱导的小鼠炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）模型中的表达水平,探讨氧化应激及NADPH氧化酶在IBD发病机制中的作用。方法 将16只SPF级雄昆明小鼠随机分为正常组和DSS组,每组8只,正常组正常饮水,DSS组饮用2.5% DSS溶液,7天建立小鼠肠炎模型。通过结肠长度、HE染色组织病理学评分、疾病活动指数（disease activity index,DAI）评估肠道炎症程度;免疫组织化学法检测结肠组织中Nox4蛋白含量,并分别采用实时定量PCR与生化方法检测组织中Nox-4的mRNA表达水平及血清浓度,评价机体氧化应激程度;利用实时定量PCR法分析小鼠肠道组织中Mn-SOD、GSH和CAT mRNA的表达情况,评价机体抗氧化功能;实时定量PCR法检测结肠组织中MCP-1、IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平、ELISA法检测上述3种炎性因子血清浓度以反应机体炎症程度。结果 与正常组相比,DSS组小鼠体质量明显下降（P<0.01）,DAI评分明显增高（P=0.000）,结肠长度明显缩短（P<0.01）,肠道呈现中至重度炎症状态; DSS组结肠组织中Nox-4蛋白表达明显上调,Nox-4 mRNA含量显著升高（P=0.000）,血清Nox-4浓度在DSS组较正常组更高（P<0.01）;结肠组织中抗氧化物Mn-SOD、GSH和CAT mRNA的表达在DSS组中均明显增高（P=0.000）;比较机体炎症指标,DSS组小鼠血清中MCP-1、IL-1β、TNF-α浓度较正常组均呈不同程度上升（P均=0.000）,结肠组织中3种炎性因子的mRNA相对表达量较正常组显著升高（P均=0.000）。结论 Nox-4通过氧化应激途径参与了肠道黏膜炎性反应的进程,并可能在IBD的转归中发挥着更为重要的作用。     

TRPV1、TRPM8通道在实验性结肠炎小鼠肠道和脊髓背根神经节中的表达及相关性研究

目的 研究瞬时通道蛋白V1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1,又称辣椒素受体)、瞬时通道蛋白M8(transient receptor potential melastatin member 8,TRPM8)在葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodiμm, DSS)诱导下的实验性结肠炎小鼠肠道和脊髓背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)中的表达,进一步探讨两者间的联系及相关通路。方法 选取C57BL/6雄性小鼠20只,随机分为空白对照组和DSS组,每组各10只。DSS组使用质量浓度为30g/L的DSS共7天构建结肠炎模型,每天同一时刻观察记录小鼠的毛发、体质量、粪便性状(颗粒状、稀便、血便等)、肛周情况(红肿、便血等),给予疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分,根据病理切片进行组织病理学评分,Western blot法检测结肠组织TRPV1、TRPM8、Gαq蛋白的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测结肠组织白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的mRNA表达水平,免疫荧光检测结肠组织和DRG中TRPV1、TRPM8及Gαq的定位及表达。结果 与空白对照组比较,DSS组结肠病理下可见明显损伤,DAI评分明显上升(P＜0.05),炎性细胞因子IL-6、IL-1β及TRPV1、Gαq蛋白上调(P＜0.05),TRPM8表达下调(P＜0.05)。同时结肠黏膜及黏膜下层可见TRPV1与TRPM8、TRPV1与Gαq的共表达,TRPV1与TRPM8共表达于DRG,相较于空白对照组,DSS组结肠组织TRPV1表达增加,TRPM8表达减少。结论 实验性急性结肠炎小鼠结肠组织TRPV1表达升高,TRPM8表达降低,TRPV1/TRPM8可共表达于结肠组织及DRG,两者之间可能存在某种平衡机制以维持肠道功能稳定。     

IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能

目的 探究肌醇依赖性激酶1α（IRE1α）通过调控内质网钙稳态蛋白（CHERP）影响软骨细胞自噬功能的相关机制。方法 衣霉素（TM）处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标。4μ8c、雷帕霉素（Rapa）处理C28/I2（分为：NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组）,Western blot检测自噬相关蛋白指标。分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠（ERN1 CKO）和对照小鼠（Control）软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA 水平,Western blot 检测 IRE1α/p- IRE1α、CHERP 表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量。巴佛洛霉素 A1 （Bafilomycin A1）处理原代软骨细胞（分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1 组）,Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达。自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流（分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组）。C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平。结果 TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）,p62表达下调（P<0.05）。相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（P<0.001）,4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P<0.05）。相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1（P<0.01）、ATG5（P<0.001）、ATG7（P<0.001）mRNA水平显著下调。IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调（P<0.01）,CHERP蛋白表达上调（P<0.05）,胞内钙离子含量显著上升（P<0.001）。巴佛洛霉素 A1 处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1 组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.01）,ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调（P<0.05）、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降（P<0.05）。自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强（P<0.05）。C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况。结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损。     

前列腺素E1对急性肺损伤小鼠水通道蛋白1、5基因表达的影响

目的研究急性肺损伤(ALI)小鼠肺组织中水通道蛋白1(AQP1)、水通道蛋白5(AQP5)基因的表达变化,探讨前列腺素E(PGE1)治疗ALI的机制,为临床治疗ALI提供新的选择靶点和方法。方法 32只昆明小鼠随机分成4组(每组8只),即空白对照组(NS组)、造模组(ALI组)、前列腺素E1治疗组(PGE1组)、地塞米松治疗对照组(Dex组),观察6h后测定肺湿干重比值(W/D),并采用HE染色观察炎症变化,RTPCR检测AQP1mRNA、AQP5 mRNA、TNF-αmRNA、IL-1βmRNA的表达变化。结果 ALI组小鼠的肺部炎症反应显著,以中性粒细胞浸润为主,伴明显的肺泡充血、水肿。前列腺素E及地塞米松治疗后,肺组织炎症、充血明显改善,ALI组的W/D的比值与其他3组比较,差异有统计学意义(P均<0.05);与NS组相比,ALI组AQP1mRNA的表达显著降低(P<0.05),而PGE1组、Dex组的AQP1 mRNA的表达显著高于ALI组(P<0.05)。AQP5 mRNA表达的变化与AQP1mRNA的变化相似。与NS组相比,ALI组TNF-αmRNA的表达显著升高(P<0.05),而PGE1组、Dex组的TNF-αmRNA的表达显著低于ALI组(P<0.05)。IL-1βmRNA表达的变化与TNF-αmRNA的变化相似,肺损伤炎症减轻。结论PGE1可通过上调AQP1、AQP5的表达减轻肺损伤时肺水肿。可能是通过抑制炎症因子TNF-α、IL-1β的表达实现的。     

冬凌草甲素对小鼠溃疡性结肠炎内质网应激的作用研究

目的 探讨冬凌草甲素对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的结肠上皮组织内质网应激(ERS)的影响.方法 利用葡聚糖硫酸钠(DSS)建立小鼠UC模型组,设置冬凌草甲素及柳氮磺胺吡啶干预组;测定疾病活动指数(DAI),对结肠组织速行病理形态学评分(HPS),RT-qPCR检测结肠上皮组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)、环氧合酶-2(COX-2)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录因子EBP同源蛋白(CHOP)、激活性转录因子6(ATF6)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)及肌醇酶1α (IRE1α)mRNA表达变化.结果 与健康小鼠相比,模型组结肠上皮组织中TNF-α、IL-6、COX-2、GRP78、ATF6、CHOP、PERK及IRE1α mRNA表达均明显上调(P＜0.05,P＜0.01);与模型组比较,冬凌草甲素干预组DAI与HPS均明显下降(P＜0.05,P＜0.01),疗效与柳氮磺胺吡啶干预组相当(P＞0.05,P＜0.01),除IER1α mRNA外,TNF-α、IL-6、COX-2、GRP78、CHOP、ATF6及PERK mRNA表达水平均明显下调(P＜0.05,P＜0.01).结论 冬凌草甲素能减轻DSS诱导小鼠结肠炎症,其机制可能与其调节结肠上皮组织ERS有关.     

Syndecan-1在急性结肠炎小鼠模型中的表达

目的探讨Syndecan-1(Sdc-1)在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎中的表达及其在肠道炎症中的作用。方法54只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组和模型组,每组27只。模型组自由饮用5%DSS溶液10天,建立急性结肠炎模型。正常对照组饮用蒸馏水10天。于实验第4、7、10天分别处死两组各9只小鼠。HE染色评价小鼠结肠组织学改变;RT-PCR检测小鼠肠黏膜Sdc-1 mRNA表达;免疫组化检测小鼠肠黏膜Sdc-1蛋白的表达。结果模型组小鼠结肠组织学评分均高于对照组(均p<0.01),以第7天评分最高(3.05±1.65)。模型组小鼠肠黏膜Sdc-1 mRNA表达水平均明显低于对照组(p<0.05),第7天最低(1.35±0.16)。模型组小鼠肠黏膜细胞表面Sdc-1蛋白水平均明显低于对照组(p<0.01),第7天最低(1.29±0.12)。结论小鼠结肠炎症的严重程度可能与肠黏膜Sdc-1 mRNA及Sdc-1蛋白表达水平减低有关,可能成为结肠炎诊治和病情监测的指标之一。     

绿原酸调控巨噬细胞极化治疗溃疡性结肠炎的机制研究

[目的] 探讨绿原酸(chlorogenic acid，CGA)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)的治疗作用及分子机制。[方法] C57BL/6小鼠50只，用3%DSS腹腔注射7 d，建立UC动物模型并随机分为5组，除UC模型组外，其余4组分别给予柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SZ)100 mg/kg·d和CGA 30、60、120 mg/kg·d灌胃10 d，另以C57BL/6小鼠10只设为正常对照组。检测小鼠疾病活动指数(disease activity index，DAI)；以苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察结肠组织病理变化；酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测结肠组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10、IL-1β水平；定量实时聚合酶链式反应(quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测结肠组织中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)的mRNA表达；免疫印迹检测结肠组织小鼠无翅型乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员5a(wingless type 5a，Wnt5a)、C1型尼曼-匹克蛋白(Nieman-Pick type C1，NPC1)的蛋白表达；流式细胞术检测结肠组织M1型及M2型巨噬细胞比例。[结果] 与正常对照组比较，UC模型组DAI评分显著增高，结肠组织出现明显炎症病理改变，M1型巨噬细胞比例，TNF-α、IL-6、IL-1β水平，iNOS mRNA表达，Wnt5a及NPC1蛋白表达均显著增高，M2型巨噬细胞比例、IL-10水平及Arg-1 mRNA表达均显著降低(P<0.01)。与UC模型组比较，CGA可显著降低小鼠DAI评分，减轻结肠组织炎症病理改变，降低结肠组织M1型巨噬细胞比例，TNF-α、IL-6、IL-1β水平，iNOS mRNA表达，以及Wnt5a和NPC1蛋白表达，增加M2型巨噬细胞比例、IL-10水平及Arg-1 mRNA表达(P<0.05，P<0.01)。[结论] CGA可通过减少巨噬细胞向M1型极化，从而减轻由DSS诱导的炎症反应以治疗UC，其机制与抑制Wnt5a/NPC1信号通路活化有关。     

IRAK1/4抑制剂对结肠炎小鼠肠道屏障功能的影响

目的 研究白细胞介素受体相关激酶1/4(interleukin receptor-associated kinase 1/4,IRAK1/4)抑制剂对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium, DSS)诱导结肠炎小鼠肠道屏障功能的保护作用。方法 30只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白组、DSS组、IRAK1/4抑制剂组,每组10只。DSS组与IRAK1/4抑制剂组小鼠使用质量浓度为30g/L的DSS共7天构建结肠炎模型,每组分别给予相应药物试剂处理。每天同一时间观察记录小鼠生命活力、体质量变化、粪便性状及粪便隐血情况,进行疾病活动指数(disease activity index, DAI)评分,并根据病理切片计算组织病理评分,ELISA法检测结肠组织炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ)活性表达水平,Western blot法检测结肠组织屏障功能相关蛋白的表达水平。结果 与空白组比较,DSS组结肠组织DAI评分明显增高(P<0.01),炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ)、屏障功能相关蛋白(ZO-1、occlud...     

DCAMKL-1在小鼠结肠急性及慢性黏膜损伤中的表达

【摘要】 目的 探讨微管相关蛋白-1(DCAMKL-1)在结肠上皮的表达,同时分析DCAMKL-1阳性细胞在急性结肠黏膜损伤〔葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎〕及慢性结肠黏膜损伤（结肠炎相关结直肠癌）中的表达变化。方法 取60只健康雌性C57 BL/6J 小鼠,其中40只用于DSS结肠炎模型实验,20只用于结肠炎相关结直肠癌模型实验。DSS结肠炎模型实验中小鼠分为4组,每组10只,其中3组饮用2.5%DSS溶液7 d,再分别自由饮用自来水不同天数后处死,对照组小鼠仅自由饮用自来水,7 d后处死;结肠炎相关结直肠癌模型实验中小鼠分为2组,每组10只,其中实验组小鼠腹腔内注射氧化偶氮甲烷(AOM)后给予3个周期DSS溶液和自来水饮用,对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水,始终自由饮用自来水,两组小鼠均61 d后处死。采用免疫组化观察DCAMKL-1、Musashi-1、增殖细胞核抗原(PCNA)和β-Catenin的表达,Westem blot分别检测2种模型实验中小鼠结肠上皮DCAMKL-1的表达。结果 正常小鼠结肠上皮存在DCAMKL-1的表达,多数位于结肠隐窝的基底部。所有DCAMKL-1阳性细胞均表达Musashi-1。在DSS结肠炎模型中,DCAMKL-1阳性细胞在DSS 作用7 d后明显减少,停用DSS 3 d后逐渐恢复正常;DCAMKL-1在结肠炎相关结直肠癌小鼠结肠上皮中表达明显增加,除隐窝底部以外,部分DCAMKL-1阳性细胞位于隐窝的中部,且部分 DCAMKL-1阳性细胞胞浆内出现β-Catenin表达。结论 DCAMKL-1可能是结肠干细胞的标志物之一。使用DCAMKL-1作为结肠干细胞的标记物,我们能够描述结肠干细胞在急慢性结肠黏膜损伤中的表达变化情况。     

雌二醇通过上调IRE1α-XBP1信号轴抑制小鼠腹腔巨噬细胞的分化

目的 研究雌二醇其通过内质网应激通路影响巨噬细胞免疫特性的可能机制。方法 提取C57小鼠腹腔巨噬细胞,IFN-γ60 ng/mL作用下体外培养巨噬细胞,分组检测雌激素对巨噬细胞影响：实验组为雌二醇（1.0 nmol/L）处理;抑制剂组为雌二醇（1.0 nmol/L）和雌激素受体拮抗剂（Acolbifene, 4 nmol/L）同时作用;对照组加等量PBS处理,培养48 h后通过Western blot法检测比较巨噬细胞极化蛋白MHC-II、iNOS和内质网应激标志性蛋白IRE1α、eIF2α和ATF6的表达水平,通过RT-PCR法检测巨噬细胞TGF-β、IL-6、IL-10、TNFα mRNA水平变化。随后分组检测内质网应激对巨噬细胞的影响：雌激素处理组;雌激素和内质网IRE1α信号抑制剂（4 μ 8 C,50 μmol/L）处理组;IRE1α激动剂组（TG,0.2 nmol/L）处理组;对照组加等量PBS处理,随后检测巨噬细胞的分化情况。结果 和对照组比较,雌激素处理后巨噬细胞M1相关蛋白MHC-II （P=0.021）和iNOS（P<0.001）表达显著降低,促炎细胞因子TNF-α（P=0.003）和IL-6 mRNA（P=0.004）表达下调,抗炎的M2型细胞因子TGF-β（P=0.002）和IL-10（P=0.008）mRNA表达上升,同时发现内质网相关的IRE1α（P<0.001）蛋白活化水平升高,其下游转录因子XBP-1（P<0.001）表达上调,加入雌激素受体阻断剂能够改变这种变化。和单纯雌激素处理组比较,在培养基中加入雌激素的同时加入IRE1α抑制剂4 μ 8 C会导致巨噬细胞 M1 相关蛋白 MHC-II（P=0.002）和 iNOS（P=0.003）表达显著上调,促炎细胞因子 TNF-α（P=0.003）和 IL-6mRNA（P=0.024）表达上调,抗炎的M2型细胞因子TGF-β（P<0.001）和IL-10（P<0.001）mRNA表达下调,而激动IRE1α通路会矫正这种变化。结论 雌激素能够通过上调IRE1α-XBP-1信号轴抑制巨噬细胞促炎表型的分化,从而对炎症反应发挥抑制作用。     

IRE1-XBP1通路调控肝巨噬细胞极性的机制研究

目的：分离、培养 LEWIS 大鼠肝脏肝巨噬细胞（KCs），观察肌醇酶1-X 盒连接蛋白1（IRE1-XBP1）通路活性改变对KCs 功能的调控的作用机制。方法（1）采取Ⅳ型胶原酶消化肝脏联合非连续梯度离心法分离 Lewis 大鼠 KCs ；（2）鉴定后的KCs 分为4组：XBP1沉默组（XBP1-shRNA 组）、错义序列沉默对照组（Ctrl-shRNA 组）；Adv-XBP1过表达组（AdV-XBP1组）、错义序列过表达对照组（Ctrl-AdV 组）；（3）实时荧光定量 PCR（RT-PCR）检测各组 KCs 中 XBP1、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17转录水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 JAK1、JAK2、STAT1及 STAT3的蛋白表达水平；（4）流式细胞术（FCM ）及激光共聚焦检测各组 KCs 表型的变化情况；（5）分离大鼠脾脏淋巴细胞，尼龙毛柱过滤纯化 T 细胞，与上述各组 KCs 共培养，Brdu 渗入法检测T 细胞增殖情况；（6） Annexin V ／PI 法 FCM 观察 T 淋巴细胞凋亡情况；（7）酶联免疫吸附测定（ELISA）检测上清液中 IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17及 IL-10水平。结果（1）RT-PCR 结果显示，XBP1-shRNA 组中 XBP1的表达量较对照组显著降低，而在 Adv-XBP1组则明显上调（P＜0．05）；（2）FCM 发现，XBP1-shRNA 组中 M HC-Ⅱ、CD86、CD40的表达明显低于对照组，而 CD204和CD206的表达则显著高于对照组；而在 Adv-XBP1组，则呈相反趋势；（3）Western blot 检测发现 XBP1-shRNA 组中 JAK1、JAK2、STAT1和 STAT3的蛋白表达及其磷酸化水平均受到抑制，而在 Adv-XBP1组则上述蛋白的表达及磷酸化水平得到显著增强；（4）Brdu 发现抑制 KCs 中 IRE1-XBP1活性后 T 细胞增殖受到明显抑制，凋亡增加，促炎细胞因子分泌减少，抗炎细胞因子分泌增加（P＜0．05），而上调 KCs 中 IRE1-XBP1活性后 T 细胞增殖则明显增强，凋亡明显减少，促炎细胞因子分泌增加，抗炎细胞因子分泌减少（P＜0．05）。结论 KCs 中 IRE1-XBP1通路活性变化可以转化 KCs 的极性状态，并通过调节 JAK-STAT 家族成员表达，调控 KCs 自分泌细胞因子的组成成分；KCs 中 IRE1-XBP1通路活性变化可以影响共培养初始 T 淋巴细胞的增殖分化、凋亡及相关细胞因子的分泌。