RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

艾地骨化醇通过抑制CYR61的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移

目的 探讨艾地骨化醇(eldecalcitol, ED-71)对骨肉瘤细胞增殖、转移和富含半胱氨酸蛋白61(CYR61)表达的影响。方法 首先，使用Lipofectamine 2000将CYR61过表达重组pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-CYR61组)及阴性对照pcDNA3.1质粒(pcDNA3.1-NC组)转染到人骨肉瘤细胞系(U2OS)中，通过RT-PCR和Western blot验证转染效率。然后，将U2OS细胞分为对照组、ED-71组、ED-71+pcDNA3.1-NC组和ED-71+pcDNA3.1-CYR61组，对照组和ED-71组细胞未进行转染，ED-71+pcDNA3.1-NC组细胞转染pcDNA3.1-NC,ED-71+pcDNA3.1-CYR61组细胞转染pcDNA3.1-CYR61。转染后，对照组细胞不做药物处理，其余3组细胞用含有5 nmol/L艾地骨化醇的1640培养基培养24 h。CCK-8法和集落形成实验测定U2OS细胞的增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡，Transwell实验检测细胞迁移和侵袭，RT-PCR检测细胞中CYR61 mRNA水平，We...     

pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒的构建及其在人神经胶质瘤U251细胞中的稳定过表达

目的建立稳定过表达pcDNA3.1/连接蛋白43(Cx43)重组质粒的人神经胶质瘤U251细胞系。方法设计人Cx43的引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从低表达Cx43的U251细胞中扩增出目的片段,双酶切后定向连入pcDNA3.1载体,构建pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒,经酶切、PCR、测序检测构建的正确性。采用脂质体转染法将重组质粒转入U251细胞,G418筛选出稳定转染的细胞系,采用RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染pcDNA3.1/Cx43重组质粒的U251细胞中Cx43基因、蛋白的表达水平。结果酶切、PCR及测序表明pcDNA3.1/Cx43重组质粒构建成功,筛选获得稳定过表达Cx43的U251细胞。结论构建了pcDNA3.1/Cx43真核表达质粒及稳定过表达Cx43的U251细胞株,为下一步以Cx43为靶标进行人神经胶质瘤的基因治疗研究奠定了实验基础。     

增强Mel 18基因表达抑制U937细胞生长

目的 研究Mel 18基因在急性白血病细胞株U937的表达情况及其对U937细胞生长的影响.方法 RT_PCR方法检测Mel 18在U937细胞中的表达.用亚克隆技术构建真核表达质粒pLenti6/V5-Mel 18,脂质体转染法将重组质粒pLenti6/V5一Mel 18和对照质粒pLenti6/V5一LacZ分别导入U937细胞,以RT-PCR法和流式细胞仪检测U937细胞转染后Mel 18的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖活性.结果 U937细胞中未检测到Mel 18的表达.成功构建了Mel 18的正义真核表达质粒pLenti6/V5-Mel 18,并将其成功导入U937细胞.pLenti6/V5一Mel 18质粒转染U937细胞24 h后,流式检测Mel 18蛋白的阳性表达率为(23.75±2.32)%.相对于亲代细胞,转染pLenti6/V5-Mel 18组与转染pLenti6/V5一LacZ组的24 h增殖活性分别为(70.86±1.08)%和(95.89±1.26)%,48 h增殖活性为(46.93±1.12)%和(95.43±1.63)%,差异均有极显著性意义(P<0.01).结论 U937细胞不表达Mel 18基因,上调Mel 18的表达能明显抑制U937细胞的生长.     

黄芩总黄酮对甲型流感病毒核蛋白表达的影响

目的探讨黄芩总黄酮(Total flavonoids of Scutellaria baicalensis Georgi,TFSB)对甲型流感病毒核蛋白(NP)的干预作用。方法本实验设HeLa细胞组、pcDNA3.1(+)空载体组、pcDNA3.1(+)/NP组、TFSB组,其中pcDNA3.1(+)空载体组、pcDNA3.1(+)/NP组分别通过瞬时转染将重组质粒pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)/NP转染到HeLa细胞中;TFSB组在将重组质粒pcDNA3.1(+)/NP转染到HeLa细胞的同时使用TFSB进行药物干预。转染48 h后,采用胶体金免疫层析试纸法测维持液中NP的表达,荧光定量RT-PCR测NP基因起始核酸量。结果胶体金免疫层析试纸法测NP表达示:pcDNA3.1(+)/NP组、TFSB组为阳性;荧光定量RT-PCR示:pcDNA3.1(+)/NP组和TFSB组NP基因起始拷贝数分别为(8.90±2.53)×106copies/μl、(6.15±1.49)×106copies/μl,采用t检验进行统计学分析:差异无统计学意义(P>0.05)。结论黄芩总黄酮对甲型流感病毒NP基因和NP的表达没有影响。     

PCDH8基因表达对鼻咽癌细胞生物学效应的影响

目的 探讨PCDH8基因表达对鼻咽癌细胞株CNE-1生物学行为的影响.方法 采用脂质体介导质粒pcDNA3.1-PCDH8(实验组)与质粒pcDNA3.1(对照组)转染至鼻咽癌细胞株CNE-1,RT-PCR、Western blot检测转染后CNE-1细胞的PCDH8 mRNA及蛋白表达;通过CCK-8细胞生长曲线、流式细胞技术、Transwell侵袭实验及CCK-8细胞药物敏感实验,进一步对转染PCDH8基因质粒的细胞株CNE-1的增殖能力、生长周期、细胞侵袭能力及对化疗药物的敏感性进行了分析,并与转染对照质粒的细胞株进行比较.结果 RT-PCR、Western blot检测结果表明转染质粒pcDNA3.1-PCDH8的实验组细胞株中PCDH8 mRNA及蛋白成功表达并明显高于转染质粒pcDNA3.1的对照组细胞株.CCK-8细胞生长曲线结果表明实验组细胞株的生长速度明显低于对照组.流式细胞仪检测结果表明实验组细胞株G0/G1期较对照组增加,S期细胞较对照组减少;Transwell侵袭实验结果表明实验组细胞株侵袭能力明显低于对照组;CCK-8细胞药物敏感性实验结果表明PCDH8基因的高表达能显著提高鼻咽癌细胞株CNE-1对顺铂化疗药物的敏感性.结论 PCDH8基因的表达能降低鼻咽癌细胞的增殖、侵袭能力,延缓细胞分裂周期,提高对顺铂化疗药物的敏感性.     

人HIF-1αRNA干扰质粒构建及其转染人急性髓性白血病骨髓基质细胞

目的 构建人HIF-1α的miRNA干扰表达载体并转染人急性髓性白血病骨髓基质细胞.方法 设计合成针对人HIF-1α基因的miRNA前体寡核苷酸,通过退火成为双链DNA片段,以T4 DNA连接酶与线性化pcDNA(tm)6.2-GW/EmGFP-miR质粒连接,构建含HIF-1α前体miRNA的重组质粒.经测序鉴定后,通过脂质体介导转染人急性髓性白血病骨髓基质细胞.结果 经测序鉴定针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够成功转染人急性髓性白血病骨髓基质细胞.结论 成功构建针对人HIF-1α基因的miRNA干扰质粒并转染人急性髓性白血病骨髓基质细胞,为后续研究HIF-1α基因在人急性髓性白血病骨髓基质的功能奠定基础.     

过表达CASP1诱导人急性髓系白血病细胞THP-1的G0/G1细胞周期阻滞和NLRP3炎性小体介导的焦亡

目的:探讨半胱天冬酶1(Caspase1,CASP1)对人急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞THP-1的细胞周期和细胞焦亡的影响。方法:培养THP-1细胞,将细胞分为对照组(正常培养的THP-1细胞),pcDNA3.1-null组(过表达CASP1的阴性对照,用5.0μg/mL的pcDNA3.1-null质粒转染THP-1细胞24h)、pcDNA3.1-CASP1组(过表达CASP1,用5.0μg/mL的pcDNA3.1-CASP1质粒转染THP-1细胞24h)。用CCK-8法检测各组细胞的增殖活力。用流式细胞术检测各组细胞凋亡和周期的变化。用qRT-PCR法检测细胞中CASP1、白细胞介素(interleukin, IL)-1β,IL-18的mRNA表达水平。用Western blot法检测细胞增殖相关蛋白Ki67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA),细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(Nod-like receptor heat prot...     

转基因法建立膀胱癌多药耐药细胞株

目的:建立高效、稳定的人膀胱癌多药耐药性细胞模型。方法:采用基因重组技术构建真核表达载体pcDNA3.1( )/bcl-2,通过脂质体将人bcl-2基因转染膀胱癌细胞BIU-87,RT-PCR检测基因转录水平,应用MTT比色法进行耐药性检验。结果:酶切鉴定和基因测序证明真核表达载体pcDNA3.1( )/bcl-2构建成功;RT-PCR分析表明,转染bcl-2基因的BIU-87/bcl-2细胞的bcl-2基因表达水平较BIU-87细胞和转染空载体的BIU-87/neo细胞显著提高;与BIU-87细胞和BIU-87/neo细胞相比,BIU-87/bcl-2细胞具有较高的耐药性。结论:基因转染法是建立人膀胱癌多药耐药细胞模型的理想方法。     

PINK1在人卵巢癌细胞系SKOV3增殖 及顺铂诱导细胞死亡中的作用

目的 研究线粒体丝苏氨酸蛋白激酶PINK1(PTEN induced putative kinase 1)在卵巢癌细胞生长增殖中的作用,及其表达在顺铂诱导细胞死亡中的作用.方法 转染并用G418筛选稳定表达pcDNA3.1-PINK1及pcDNA3.1的SKOV3细胞系,细胞设3组:正常培养组、转染空质粒pcDNA3.1组,过表达PINK1组.采用实时定量PCR检测各组细胞PINK1 mRNA的表达,MTT和流式细胞仪检测各组细胞生长增殖及细胞周期分布情况.观察PINK1在顺铂(DDP)诱导卵巢癌细胞死亡中的作用,并检测耐药基因MDR1、MRP1以及ABCG2在各处理组中的表达水平.结果 过表达PINK1的SKOV3细胞系PINK1 mRNA的表达水平显著高于正常培养组及转染空质粒pcDNA3.1组细胞(P＜0.05).过表达PINK1组较其他两组细胞增殖率显著提高,细胞进入S和G2/M期比例增加(P＜0.05).过表达PINK1显著抑制了10 μmol/L和20 μmol/L顺铂诱导细胞死亡,并诱导了耐药基因MDR1、MRP1和ABCG2的表达升高.结论 上调PINK1的表达可促进卵巢癌细胞增殖,降低细胞对顺铂作用的敏感性并诱导耐药基因的表达.     

Inhibitory activity of nuclear factor-κB potentiates cisplatin-induced apoptosis in A549 cells

Whether inhibiting the activity of nuclear factor （NF）-κB potentiates cisplatin-induced apoptosis in non-small cell lung cell line A549 cells was investigated. The recombinant plasmid pcDNA3.1（＋）/IκBα expressing IκBα was constructed. The in vitro cultured A549 cells were transfected with pcDNA3.1 （＋）/IκBα alone, or pcDNA3.1（＋）/IκBα combined with cisplatin. The mitochondrial membrane potential （△ψm） was determined by rhodamine 123, the activity of caspase-3 was tested by colorimetric assay, and cell apoptosis was detected by flow cytometry with the annexin V/propidium iodide assay. The results showed that the activity of NF-κB in A549 cells was inhibited by transfecting pcDNA3.1（＋）/IκBα. Transfection of pcDNA3.1（＋）/IκBα alone did not promote apoptosis. Treatment of cisplatin alone had a little effect on cell apoptosis. Transfection of pcDNA3.1（＋）/IκBα combined with cisplatin treatment significantly induced apoptosis of A549 ceils. It was concluded that inhibiting the activity of NF-κB potentiated cisplatin-induced apoptosis of A549 cells.     

外源性FHIT基因对人胶质瘤细胞U87增殖与凋亡的影响

目的探讨外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达对胶质瘤细胞系U87增殖和凋亡作用的影响。方法通过脂质体介导将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B-FHIT和空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B分别转染胶质瘤细胞系U87。实验细胞分U87-FHIT组(转染FHIT基因的U87细胞)、U87-vector组(转染空载体质粒的U87细胞)和空白对照组(亲本U87细胞)。Western blot和免疫荧光染色检测外源性FHIT蛋白的表达;MTT法及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果U87-FHIT组细胞的生长抑制率和凋亡率明显高于U87-vector组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外源性FHIT基因表达能诱导U87细胞凋亡,抑制其生长,具有抗胶质瘤作用。     

日本血吸虫组织蛋白酶B2在小鼠抗血吸虫再感染中的作用

目的 构建日本血吸虫组织蛋白酶B（Sjcb2）真核表达载体,检测日本血吸虫组织蛋白酶B2单独和联合吡喹酮（PZQ）在小鼠抗血吸虫再感染中的作用.方法 将60只BALB/c雌性小鼠随机均分为六组,建立日本血吸虫感染动物模型：感染组、感染攻击组、空质粒处理组、Sjcb2免疫组、吡喹酮处理组、Sjcb2联合吡喹酮处理组.Sjcb2免疫组和Sjcb2联合吡喹酮组分别在初次尾蚴感染前第21天、14天及7天接种pcDNA3.1（＋）/Sjcb2重组质粒,空质粒处理组接种pcDNA3.1（＋）空质粒.初次尾蚴感染后第六周,对吡喹酮处理组和Sjcb2联合吡喹酮处理组小鼠给予PZQ治疗.除感染组外其它各组在第八周再次进行尾蚴攻击感染.分别于第8周和第14周取各组小鼠肝脏组织做病理切片,观察虫卵肉芽肿大小;采用间接ELISA法检测血清中特异性IgE和IgG亚型（IgG1,IgG2和IgG3）;检测各组小鼠荷成虫数,计算抗血吸虫再感染率.结果 Sjcb2免疫组、联合组与其它组分别比较,小鼠荷虫数显著性减少,抗血吸虫再感染率显著升高,虫卵肉芽肿直径显著减小,IgG1水平显著下降和IgE水平显著升高（P〈0.01）.结论 Sjcb2在小鼠模型中具有抗日本血吸虫再感染作用,抗血吸虫再感染率为70.3%,抗再感染作用机制可能与特异性IgE水平升高和IgG1水平下降有关.     

冬凌草甲素诱导人脑胶质瘤U251细胞的凋亡及其机制

目的 研究冬凌草甲素对人脑胶质瘤U251细胞体外生长抑制及诱导凋亡的作用及其机制。方法 MTT法检测冬凌草甲素对U251细胞的生长抑制作用;倒置显微镜法和荧光显微镜Annexin V-FITC/PI双染色法观察细胞的形态学变化;流式细胞仪Annexin V FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率;Realtime PCR法检测冬凌草甲素作用U251细胞后的bcl 2、bax及caspase-3基因表达水平的变化。结果 冬凌草甲素对U251细胞有明显的生长抑制作用（P<0.05）,呈明显的时间和浓度效应关系。冬凌草甲素作用U251细胞24h后出现明显的细胞凋亡形态学改变。随着冬凌草甲素作用浓度增加,凋亡和坏死细胞数均增加,浓度越高,诱导细胞凋亡的作用越明显（P均 <0.05）。随着冬凌草甲素作用时间延长,U251细胞的bax和caspase-3基因的表达逐渐增强,bcl-2基因的表达逐渐减弱（P均<0.05）。结论 冬凌草甲素能诱导人脑胶质瘤U251细胞凋亡,其凋亡机理可能与bax和caspase 3基因表达的上调,bcl-2基因表达的下调相关。     

刺梨汁促人急性单核细胞白血病U937细胞凋亡作用的研究

目的：探讨刺梨汁（RRTJ）促U937细胞凋亡作用和可能的机制。方法：不同浓度RRTJ在体外作用于人急性单核细胞白血病U937细胞株。应用光学显微镜观察细胞形态变化；细胞计数测定细胞生长情况；流式细胞仪分析细胞生长周期的变化；逆转录聚合酶链反应法（RT—PCR）观察凋亡相关基因bcl-2、bax表达的变化；硝酸还原酶法测定细胞一氧化氮（NO）分泌量；并通过测定细胞上清液乳酸脱氢酶（LDH）活性分析RRTJ对细胞的毒性作用。结果：刺梨汁显著抑制U937细胞生长，并表现出剂量依赖性。随RRTJ浓度增加，U937细胞凋亡率增高，baxmRNA表达量上升，而bcl-2mRNA表达水平明显下降。U937细胞NO释放量也随RRTJ浓度增加而增加。结论：RRTJ可能是通过影响细胞生长周期、降低bcl-2／bax比值，同时诱导NO分泌，促进U937细胞凋亡。     

DNA氧化损伤修复基因hOGG1高表达细胞株的建立

目的联合pcDNA3.1(+)/Myc-HisA-hOGG1和pGL3promoter荧光质粒稳定转染人肺腺癌A549细胞获得hOGG1基因高表达细胞株,并初步探讨转染细胞生物学特性的变化。方法成功构建pcDNA3.1(+)/Myc-His A载体后,大量抽提阳性重组子并在Fu GENE6的介导下联合pGL3promoter荧光质粒转染A549细胞(转染组),同时设空白对照组(A549)和阴性对照组[PGL3+pcDNA3.1(+)/Myc-HisA转染的A549细胞]。生物荧光检测转染细胞hOGG1mRNA表达的改变,蛋白质免疫印迹法检测转染细胞hOGG1蛋白表达水平。将3组细胞于不同高氧条件下培养,相差显微镜观察形态学变化,彗星试验比较各组细胞对抗损伤和修复能力的情况,同时测定DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的变化。结果转染细胞荧光素酶稳定表达,蛋白印迹检测转染组hOGG1蛋白明显高于两对照组细胞,提示hOGG1基因高表达细胞株建立成功。相同高氧条件下,转染组形态学变化明显减轻,彗星细胞率和olive tail moment明显低于空白组和阴性对照组,修复完成率高,修复时间缩短(P<0...