膀胱癌组织中白细胞介素-12B基因启动子区甲基化的变化及其意义

目的研究膀胱癌组织中白细胞介素-12B基因(IL-12B)启动子区甲基化的变化及其临床意义.方法应用甲基化特异性聚合酶链反应、Western-blot检测膀胱癌及癌旁组织78例,比较IL-12B基因启动子区甲基化及其蛋白质与膀胱癌发生发展的关系.结果 (1)膀胱癌组织IL-12B启动子区甲基化产物明显多于癌旁组织,差异有统计学意义(χ2=14.8,P=0.001);(2)膀胱癌组织和癌旁组织IL-12B启动子区甲基化产物的PMR水平差异有统计学意义(t=3.42,P=0.001);(3)膀胱癌组织IL-12B蛋白的表达水平显著低于癌旁组织(t=2.832,P=0.012).结论 IL-12B基因启动子区甲基化及其编码蛋白质的失活与膀胱癌的发生相关.     

膀胱癌中eya4基因启动子区甲基化状态及其临床意义

目的 探讨膀胱癌细胞系和膀胱移行细胞癌组织中EYA转录共激活磷酸酶4(eya4)基因启动子区CpG岛甲基化状态及在临床病理特征中的意义.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测eya4基因在5株膀胱癌细胞系、1株膀胱永生化上皮细胞系和75例膀胱移行细胞癌组织及癌旁组织,并结合临床病理特征行统计学分析.结果 eya4基因启动子区在5株膀胱癌细胞系中,有4株出现甲基化,其甲基化率为80%;在人正常膀胱细胞系中甲基化阴性.eya4在膀胱癌组织中的甲基化率为70.7%(53/75),显著高于癌旁组织(24%,18/75),差异有统计学意义(x2=32.760,P<0.01).eya4基因启动子区CpG岛甲基化在临床病理特征中如单发膀胱肿瘤与多发膀胱肿瘤相比,直径≤3 cm的膀胱肿瘤与＞3 cm的膀胱肿瘤相比,低级别膀胱肿瘤与高级别膀胱肿瘤相比,浅表性膀胱肿瘤与浸润性膀胱肿瘤相比,差异均有统计学意义(P<0.05),但与年龄和性别无关.结论 基因eya4启动子区甲基化与膀胱癌的发生发展有关,可能作为膀胱移行细胞癌诊断的一个新的标志物.     

PITX2启动子甲基化及其与膀胱癌临床病理的关系

目的:由于近些年表观遗传学的发展,基因启动子甲基化检测在预测癌症诊断预后方面拥有巨大的潜力。PITX2启动子的高CpG岛增加其甲基化程度,其能够成为新的膀胱癌预测因子。方法: QRT-PCR检测永生化膀胱上皮细胞系（SV-HUC）和3种膀胱癌细胞系（EJ、5637、T24）以及癌组织和癌旁组织的差异性表达。通过DNA甲基化测定实验对33例全膀胱切除术切除癌组织进行甲基化程度测定,分为大于50%甲基化,小于50%甲基化建立甲基化程度与肿瘤分期分级的联系。结果:使用实时定量RT-PCR（Q-PCR）证明PITX2在膀胱癌细胞中高表达。癌组织中甲基化程度明显高于癌旁组织。PITX2启动子甲基化与肿瘤大小（P =0.026 7）、高级别（P =0.027 7）和TNM分期（0.016 0）显着相关。在预测肿瘤侵袭（T2-T4肿瘤）中,PITX2启动子甲基化的ROC曲线下面积（AUC）为0.867。 Kaplan-Meier生存分析表明,与低PITX2甲基化表达的肿瘤相比,高PITX2启动子甲基化表达的肿瘤与较短的总体存活相关。结论:PITX2在膀胱癌组织中异常高表达,并且PITX2启动子区域在癌组织中存在高甲基化是患者不良预后的独立危险因素,因此,PITX2启动子甲基化可能成为膀胱癌肿瘤发生进展有效的预测因子。     

膀胱癌组织中白细胞介素-12B 基因启动子区甲基化的变化及其意义

［摘要］目的　研究膀胱癌组织中白细胞介素-12B基因（IL-12B）启动子区甲基化的变化及其临床意义．方法　应用甲基化特异性聚合酶链反应、Western-blot检测膀胱癌及癌旁组织78例,比较IL-12B基因启动子区甲基化及其蛋白质与膀胱癌发生发展的关系．结果 （1）膀胱癌组织IL-12B 启动子区甲基化产物明显多于癌旁组织,差异有统计学意义（χ2＝14.8,P＝0.001）;（2）膀胱癌组织和癌旁组织IL-12B 启动子区甲基化产物的PMR水平差异有统计学意义（t＝3.42,P＝0.001）;（3）膀胱癌组织IL-12B蛋白的表达水平显著低于癌旁组织（t＝2.832,P＝0.012）．结论　IL-12B基因启动子区甲基化及其编码蛋白质的失活与膀胱癌的发生相关．     

5-Aza-dc对宫颈癌细胞系FAM9C基因表达及甲基化影响

目的探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’脱氧胞苷(5-Aza-dc)对宫颈癌细胞系抑癌基因FAM9C表达及甲基化状态的影响。方法常规培养高危型人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌细胞系HeLa、Caski和HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A,分别用5、10、15μmol/L的5-Aza-dc作用3、5、7d,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测FAM9C基因表达,甲基化特异性PCR(MSP)方法检测基因启动子区甲基化状态。结果未经5-Aza-dc处理的HPV阳性宫颈癌细胞系FAM9C基因呈低表达,基因启动子区表现为完全甲基化状态;未经5-Aza-dc处理的HPV阴性宫颈癌细胞系FAM9C基因表达水平较高,基因启动子区呈不完全甲基化和非甲基化状态。10或15μmol/L的5-Aza-dc作用5d时,HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa、Caski的FAM9C基因表达显著上调,基因启动子区由完全甲基化转变为不完全甲基化和非甲基化状态;HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3、C-33A应用5-Aza-dc处理前后FAM9C基因表达及启动子区甲基化状态无明显变化。结论 HPV诱导异常甲基化可能是宫颈癌细胞系FAM9C基因表达降低甚至沉默的主要原因;甲基转移酶抑制剂5-Aza-dc能逆转FAM9C基因甲基化状态,使该基因重新表达。     

死亡相关蛋白激酶启动子区甲基化状态与膀胱癌的关系

目的探讨死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)在膀胱癌中CpG岛的甲基化状态及其意义。方法收集40对新鲜的膀胱癌组织及其癌周正常组织;采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)检测DAPK基因启动子区CpG岛的甲基化状态;并对MSP产物进行TA克隆。结果40对癌组织及其癌周正常组织中,7例癌组织检测到DAPK异常甲基化,1例癌周正常组织检测到异常甲基化(7/40vs.1/40,P>0.05);原发性与复发性膀胱癌中的甲基化阳性率分别为2/15、5/25,二者差异无显著性(P>0.05);在不同分级、分期膀胱癌中的差异均无显著性(P>0.05)。结论DAPK启动子在膀胱癌中的甲基化阳性率较低,并且与膀胱癌的分级、分期无相关性,因而在选择分子学指标辅助膀胱癌早期诊断时,DAPK的甲基化检测需慎用。     

大肠癌组织Runx3基因启动子甲基化的研究

目的:检测大肠癌患者肿瘤组织及其相应的癌旁组织中Runx3基因表达和启动子区域甲基化状态,探讨甲基转移酶抑制剂5-aza-dc对结肠癌细胞系中Runx3表达的作用。方法:将手术切除的37例大肠癌组织和对应癌旁组织提取RNA和基因组DNA,采用RT-PCR检测Runx3基因的表达,甲基化特异PCR方法(MSP)检测Runx3基因启动子区域甲基化状态,用5-aza-dC处理结肠癌细胞系后,RT-PCR方法检测Runx3基因的表达。结果:37例大肠癌和对应癌旁组织中Runx3基因表达阳性率分别为100%(37/37),2.7%(1/37)。癌组织中Runx3基因表达明显降低(P<0.01)。MSP检测发现11例(30%)大肠癌标本及1例(3%)癌旁正常组织中Runx3基因呈甲基化状态。癌组织中Runx3基因甲基化明显高于癌旁组织(P<0.05)。结肠癌细胞系HT29 5-aza-dC处理后Runx3基因表达水平增加。结论:Runx3基因启动子甲基化和Runx3基因表达在大肠癌的癌旁组织和原发癌灶间存在显著性差异,可能与结肠癌的发生发展有关。     

膀胱移行细胞癌组织与尿沉渣细胞WWOX基因启动子甲基化相关性研究

目的探讨膀胱移行细胞癌组织与其对应尿沉渣细胞中氧化还原酶的WW结构域(WWOX)基因启动子区CpG岛的甲基化状态以及二者甲基化的相关性。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测54例膀胱癌患者手术切除的癌组织及尿沉渣细胞中WWOX基因启动子区甲基化状态。结果 54例膀胱癌患者癌组织中WWOX基因启动子区的甲基化率达35.2%,对应的尿沉渣细胞中甲基化率为29.6%,分别与各自对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),且膀胱癌组织WWOX基因启动子区的甲基化和对应的尿沉渣细胞的甲基化存在明显的相关性(r=0.881,P<0.05)。不论是在癌组织还是尿沉渣细胞中,WWOX基因启动子区甲基化率随着癌组织分级的增加逐渐升高(P<0.05)。结论 WWOX基因启动子区的异常甲基化可能是膀胱癌的早期事件,尿沉渣细胞中WWOX基因启动子区的异常甲基化可能是膀胱癌早期诊断的分子标志物之一。     

膀胱移行细胞癌WWOX基因启动子区甲基化及mRNA表达及其临床意义

目的探讨膀胱移行细胞癌组织中WWOX基因启动子区CpG岛的甲基化状态以及WWOX基因表达缺陷的意义及其与CpG岛甲基化的关系。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和实时荧光定量反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)分析WWOX基因启动子区甲基化状态和WWOX mRNA表达量及其二者的相关性。结果 54例膀胱癌组织中,WWOX基因启动子区的甲基化率达35.2%,而对应的癌旁正常组织中甲基化率仅为7.4%,二者差异有统计学意义(χ2=12.43,P<0.05)。WWOX基因启动子区甲基化率随着癌组织分级的增加逐渐升高(P<0.05)。WWOX mRNA在膀胱癌组织中的表达量明显低于对应的癌旁正常组织中的表达量,二者差异有统计学意义(t=9.73,P<0.05)。WWOX mRNA的表达水平与WWOX基因启动子区的甲基化状态密切相关(r=0.377,P<0.05)。结论 WWOX基因表达的缺失与膀胱癌的发生有密切的关联,WWOX启动子区的异常甲基化是导致膀胱癌组织WWOX mRNA转录受阻的重要原因之一。WWOX启动子区甲基化改变在膀胱移行细胞癌的早期发生发展中有重要作用。     

食管癌组织Ras相关区域家族1A基因启动子区甲基化检测

目的:检测食管癌和癌旁正常组织Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因启动子区甲基化变化.方法:采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测79例食管鳞癌患者癌组织及对应的20例癌旁正常组织RASSF1A基因启动子区甲基化,并观察食管癌组织RASSF1A基因启动子区甲基化与临床病理变化的关系.结果:79例食管鳞癌组织RASSF1A基因启动子区甲基化阳性率(67%,53/79)明显高于癌旁正常组织(15%,3/20).食管癌组织中不同年龄、分化程度的RASSF1A基因启动子区甲基化阳性率差异有统计学意义(P＜0.05),而淋巴结转移与否、肿瘤分期间甲基化阳性率差异无统计学意义.20例同一个体癌组织甲基化阳性率明显高于癌旁正常组织(50%(10/20)vs 15%(3/20))(P＜0.05),仅3例同时出现甲基化,一致率为15%.结论:RASSF1A基因启动子区甲基化是食管鳞癌频发的分子事件.食管鳞癌组织RASSF1A基因甲基化明显高于癌旁正常组织,并且和年龄、分化程度有关.     

应用BSP联合TA克隆测序检测胰腺癌中RASSF1A基因启动子区异常甲基化

目的:检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株中的甲基化和表达状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病过程中的作用?方法:采用重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)联合TA克隆测序检测胰腺癌细胞株PANC-1及胰腺癌组织?癌旁组织及正常胰腺组织中RASSF1A启动子区CpG岛的甲基化状态,以甲基化酶抑制剂5-aza-2-deoxycitydine(5-aza-dC)处理PANC-1,观察处理前后甲基化率变化情况,逆转录PCR观察RASSF1A 的mRNA表达情况?结果:在PANC-1细胞中RASSF1A启动子的甲基化率平均为100.00%,在正常胰腺?癌旁及癌组织中平均分别为1.79%?93.75%和100.00%,与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P < 0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P > 0.05)?在PANC-1细胞?胰腺癌组织及癌旁组织中RASSF1A基因无表达,在正常胰腺组织中RASSF1A基因呈阳性表达;PANC-1细胞经5-aza-dC处理后,RASSF1A的甲基化率下降(88.89%,P < 0.05),mRNA表达无变化?结论:胰腺癌细胞株PANC-1及癌组织?癌旁组织RASSF1A基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1中RASSF1A基因的表达沉默?该基因异常甲基化有望成为胰腺癌的早期诊断指标和治疗靶点?     

MicroRNA-34a对尿路上皮癌细胞株5637细胞迁移、侵袭和增殖的影响

目的 研究microRNA-34a （miR-34a）对膀胱肿瘤细胞株5637细胞迁移、侵袭和增殖的影响.方法 在5637细胞株中过表达miR-34a,运用小室迁移实验和小室侵袭实验检测细胞迁移力和侵袭力;运用血球计数板法和新型四唑氮盐（MTS）法检测细胞增殖力.结果 过表达miR-34a后,5637细胞迁移力和侵袭力均下降（P＜0.01）,细胞增殖受抑（P＜0.01）.结论 过表达miR-34能抑制膀胱肿瘤细胞株5637的迁移、侵袭和增殖.     

SOX6在膀胱癌发生发展中的作用及相关机制

目的:研究SOX6在膀胱癌中的表达特征,并探讨其在膀胱癌中发挥的生物学效应及相关机制。方法:利用免疫组化检测膀胱癌组织和癌旁组织中的SOX6的表达,蛋白印记（Western blot）及荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测SOX6在膀胱癌细胞（T24、BIU-87、EJ、5637）和正常膀胱上皮细胞（SV-HUC-1）中表达情况。通过SOX6高表达质粒和空载质粒分别转染膀胱癌细胞（EJ、5637）,使用Transwell方法检测两组细胞的侵袭能力,采用划痕实验检测迁移能力,Western blot法检测E-cadherin和Vimentin的表达,使用CCK-8实验检测两组细胞的增殖能力,流式细胞术检测凋亡情况,并研究对膀胱癌细胞的蛋白酶体活性的影响。结果:与癌旁组织和正常膀胱上皮细胞相比,膀胱癌组织和细胞中SOX6的表达显著下降,在细胞EJ和5637尤其明显。与对照组对比,转染SOX6高表达质粒的EJ 和5637膀胱癌细胞的迁移、侵袭、增殖能力减弱,凋亡增加,上皮间质转化能力减弱,同时蛋白酶体活性显著降低。结论:SOX6在膀胱癌中作为抑癌基因发生作用,通过降低蛋白酶体活性来抑制膀胱癌的发展。     

磷酸酶基因CpG岛甲基化状态及其在膀胱移行细胞癌中的表达

目的探讨磷酸酶基因（PTEN）CpG岛甲基化状态及其在膀胱移行细胞癌（BTCC）中的表达。方法应用甲基化特异性聚合酶链式反应检测32例BTCC和癌旁正常组织标本中PTEN基因启动子区甲基化状态,逆转录聚合酶链式反应和蛋白印迹法检测其mRNA和蛋白表达水平。结果PTEN基因在BTCC组织中甲基化率为65．6％,随着肿瘤分级、分期的增加,甲基化水平逐渐升高,而在正常膀胱组织中未发现甲基化。PTENmRNA和蛋白表达在正常组织和BTCC组织中分别为93．8％、62．5％和15．6％、6．3％,差异有统计学意义（P〈0．01）。在21例启动子异常甲基化的BTCC组织标本中,19例伴有PTEN基因表达缺失或下调,两者之间存在明显负相关（r=--0．564,P〈0．01）。结论PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活,使其mRNA和蛋白表达减少甚至缺失,是膀胱癌发生、发展的原因之一。     

膀胱癌尿沉渣PTEN基因启动子CpG岛异常甲基化研究

目的探讨膀胱癌患者尿沉渣细胞中PTEN基因启动子CpG岛的甲基化状况及其临床意义。方法收集临床病理确诊39例膀胱癌,采用甲基化特异PCR(MSP)的方法,检测膀胱癌肿瘤组织和配对的尿沉渣PTEN基因启动子CpG岛的甲基化异常频率,同时以45例非肿瘤性泌尿系疾病患者及14例健康志愿者作为对照。结果膀胱癌肿瘤组织和配对的尿沉渣PTEN基因启动子甲基化阳性率分别为53.8%(21/39)和48.7%(19/39),两者密切相关(r=0.381,P=0.017)。膀胱癌组尿沉渣PTEN基因启动子甲基化阳性率(48.7%,19/39)显著高于非肿瘤组(11.1%,5/45)(2χ=15.37,P=0.000),非肿瘤组与志愿组间(阳性率为0)并无明显差异(P>0.05);尿沉渣PTEN基因甲基化对膀胱癌诊断的敏感性为48.7%(19/39),特异性为91.5%(54/59)。性别、年龄、病理分级及临床分期与PTEN基因甲基化均无明显相关性(P均>0.05)。结论 PTEN基因启动子异因异常甲基化可能是膀胱癌的早期事件,尿沉渣PTEN基因启动子异常甲基化可能是膀胱癌早期诊断分子标志物之一。     

大肠癌组织白细胞介素-6表达与其甲基化之间的关系

目的:检测大肠癌中白细胞介素-6(IL-6)表达及启动子甲基化状态,进一步阐明大肠癌(CRC)的发病机制。方法:实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测20例CRC癌组织及癌旁组织IL-6mRNA水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-6蛋白浓度,亚硫酸氢盐测序(BSP)检测IL-6启动子甲基化状态。结果:与癌旁组织相比,癌组织中IL-6mRNA及蛋白表达均显著增高(P<0.05),并且其蛋白表达随着Dukes分期逐渐升高,差异具有显著性(P<0.05);癌组织中,IL-6启动子-633、-611、-575、-575bp位点甲基化水平均低于相应癌旁组织(P<0.05),且非甲基化概率随着Dukes分期和分化程度增加而增高(P<0.05)。结论:IL-6在大肠癌中表达增加,并与Duke分期相关,其启动子区低甲基化或去甲基化可能是其表达增高的机制之一;初步筛选出IL-6基因启动子区低甲基化位点,为后续研究奠定基础。     

微纤维相关蛋白5调控上皮-间质转化相关基因促进膀胱癌细胞迁移和侵袭

目的 探讨微纤维相关蛋白5（MFAP5）在膀胱癌中的表达水平及其对膀胱癌细胞的生物学作用。方法 收集上海交通大学附属第一人民医院确诊的膀胱癌患者手术切除标本,通过免疫组织化学染色检测MFAP5的表达情况。分别从膀胱肿瘤组织和正常膀胱组织分离纯化得到肿瘤相关成纤维细胞（CAF）和正常成纤维细胞（NF）,通过qRT-PCR检测CAF、NF及人膀胱癌细胞系（T24、5637、UMUC3、J82）中MFAP5 mRNA的相对表达量。通过美国癌症基因组图谱（TCGA）数据库及基因表达汇编（GEO）数据库GSE13507数据集中的膀胱癌表达谱数据,分析MFAP5表达与膀胱癌进展和恶性程度的相关性。用重组人MFAP5蛋白处理膀胱癌细胞系T24、5637,检测其对细胞迁移和侵袭能力及迁移相关蛋白表达的影响。结果 MFAP5在膀胱癌组织中主要表达于肿瘤间质,其表达水平与膀胱癌T分期和肿瘤分级有关（P均<0.05）,并且CAF中MFAP5 mRNA相对表达量高于NF、T24、5637、UMUC3、J82细胞（P均<0.01）。TCGA和GSE13507数据库分析结果均显示,高表达MFAP5的膀胱癌患者总生存期短于低表达患者（P均<0.05）。基因集差异分析结果显示MFAP5表达水平随肿瘤恶性程度的升高而升高（P<0.01）,并与上皮-间质转化相关基因钙黏蛋白2、Twist1、基质金属蛋白酶9（MMP9）、E盒结合锌指蛋白1（ZEB1）密切相关（P均<0.01）。重组人MFAP5蛋白刺激能促进T24、5637细胞中包括N-钙黏蛋白、MMP9、ZEB1、Twist在内的上皮-间质转化相关蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,同时增强细胞的迁移和侵袭能力（P均<0.01）。结论 MFAP5可能是预测膀胱癌发生侵袭进展的潜在分子标志物。     

内皮素3基因对结直肠癌LoVo细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨内皮素3(endothelin 3,EDN3)基因对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响及其相关机制.方法 实时荧光定量PCR检测EDN3 mRNA在人结直肠癌组织及对应癌旁组织中的表达情况,半定量PCR检测EDN3及内皮素受体B(endothelin receptor B,EDNRB) mRNA在结直肠癌细胞(CaC02、LoVo、HT-29)中的表达情况.将包装过载体pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro-EDN3的病毒感染至结直肠癌细胞LoVo,MTS、克隆形成法、划痕法、Transwell检测EDN3对细胞增殖、克隆、迁移和侵袭能力的改变.Western blot检测LoVo中p-ERK1/2和t-ERK 1/2蛋白改变.结果 EDN3在人结直肠癌组织和细胞中表达降低.表达EDN3基因的重组载体成功感染至LoVo细胞.MTS和克隆实验结果显示,实验组和对照组细胞增殖和克隆形成差异无统计学意义(P＞0.05),划痕实验和Transwell实验提示实验组细胞迁移和侵袭能力明显低于对照组(P＜0.01).Western blot检测结果显示磷酸化的ERK1/2蛋白表达下降(P＜0.01).结论 EDN3在结直肠癌组织和细胞中表达降低,过表达EDN3能抑制结直肠癌LoVo细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与ERK1/2信号通路有关.