姜黄素和干扰素γ抑制慢性髓系白血病STAT5基因表达的研究

目的探讨姜黄素和干扰素γ(IFN-γ)对慢性髓系白血病(CML)K562细胞STAT5基因表达的抑制作用及其作用机制.方法运用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性.运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞STAT5 mRNA的变化.运用激光共聚焦显微镜和免疫印迹法检测STAT5蛋白的表达.结果①姜黄素或1FN-γ作用K562细胞24 h,K562细胞增殖活性明显受到抑制,STAT5 mRNA和STAT5蛋白表达降低.②姜黄素与IFN-γ联合干预K562细胞24 h,细胞增殖活性、STAT5 mRNA和蛋白的表达均显著低于姜黄素组(均P＜0.01).结论姜黄素和IFN-γ联用能明显抑制慢性髓系白血病细胞增殖以及STAT5基因表达.     

Chk1在K562/A02细胞耐药中的作用机制

目的 研究检测点激酶1(Chk1)对K562/A02细胞周期及凋亡的影响,探讨Chk1在肿瘤细胞耐药中的作用机制.方法 以人红白血病细胞系K562及其耐药细胞株K562/A02为研究对象,与阿霉素共同孵育后,RT-PCR检测Chk1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白质的表达及磷酸化水平,MTT法检测药物敏感性,流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡.结果 Chk1 mRNA及蛋白表达水平在两种细胞间无显著差异(均P>0.05);Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为 (0.79±0.56),K562细胞为(0.27±1.47),其差异有显著性意义(P<0.05).阿霉素作用6 h后,致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为(54.12±0.57)%,显著高于K562细胞的(36.99±1.28)%(P<0.05),K562/A02细胞凋亡率为(6.25±0.81)%,显著低于K562细胞的(66.47±1.26)% (P<0.05).阿霉素对K562/A02和K562细胞的IC50值分别为(109.65±0.26)mg/L、(1.08±0.74)mg/L, 耐药倍数为102倍.结论 由于G2/M期阻滞是导致白血病细胞耐药的机制之一, Chk1磷酸化水平与G2/M期阻滞和细胞凋亡密切相关,提示Chk1的活化状态可能参与K562/A02细胞的耐药机制.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA联合伊马替尼对K562细胞的协同杀伤作用

目的:观察组蛋白去乙酰化酶( HDAC)抑制剂SAHA联合伊马替尼(imatinib,IM)对人慢性髓系白血病(CML)细胞株的协同杀伤作用,并探讨其分子学机制.方法:将不同浓度的SAHA和IM分别或联合作用于对数生长期的K562细胞,MTT比色法检测药物对细胞的生长抑制作用;应用Hoechst荧光染色法和流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡,Western blot法检测药物处理后Bcr-Abl及其下游信号途径蛋白的表达、Caspase途径活化和凋亡相关蛋白表达的改变.结果:SAHA和IM单独作用K562细胞呈剂量依赖性抑制细胞生长(SAHA:F=433.8,P＜0.001;IM:F =54.14,P＜0.001);两药联合对细胞的生长有协同杀伤作用,联合指数CI＜1.FACS分析和Hoechst荧光染色证实,SAHA和IM两药联合能加速K562细胞的凋亡,激活Caspase-3、Caspase-8和PARP,下调抗凋亡蛋白Mcl-1表达.此外,SAHA和IM联用能抑制Bcr-Abl及其磷酸化水平,下调JAK2和磷酸化STAT5表达.结论:HDAC抑制剂SAHA联合IM能协同杀伤CML细胞、加速细胞凋亡.其作用机制可能是两药联用协同抑制了Bcr-Abl及其磷酸化水平,抑制JAK2/STAT5信号途径和下调下游靶基因Mcl-1.     

基于lncRNA-miRNA-mRNA网络研究慢性髓系白血病的甲磺酸伊马替尼耐药机制

目的 通过对甲磺酸伊马替尼（IM）处理的K562和K562G细胞长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)表达谱进行检测,探究慢性髓系白血病（CML）对IM耐药的分子机制。方法 实验分为K562组、K562G组、K562+IM组、K562G+IM组4组,各组细胞分别培养0,6,12,24 h,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测各组细胞增殖情况;基因芯片技术检测培养最适时间时细胞lncRNA、miRNA、mRNA的表达情况,并采用定量反转录PCR(qRT-PCR)法对差异lncRNAs进行验证;通过组间比较,获得耐药特异性基因并对耐药特异性mRNAs进行基因本体（GO）富集分析及生物学通路分析,然后选取耐药特异性基因用于lncRNA-miRNA-mRNA(ceRNA)网络的构建。结果 加入IM培养24 h时,K562细胞增殖抑制率达90%以上;与K562细胞比较,K562G细胞增殖抑制率较低（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,11个lncRNAs的表达情况和芯片分析的结果一致（P<0.01...     

选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398下调K562/ADM细胞MDR1/P-gp表达

目的 探讨选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对白血病多药耐药K562/ADM细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响.方法 以细胞K562/ADM为NS-398作用的靶细胞,MTT法检测细胞增殖活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因(MDRl)mRNA的表达;流式细胞仪(FCM)测定P-gp蛋白表达水平.结果 NS-398显著抑制K562/ADM细胞增殖,呈时间、剂量正相关效应;下调K562/ADM细胞MDRl基因表达并抑制P-gp合成,呈明显的剂量依赖关系.结论 COX-2抑制剂NS-398可在一定时间和剂量范围抑制白血病多药耐药K562/ADM细胞MDRl/P-gp表达,并能抑制K562/ADM多药耐药细胞增值.     

基于lncRNA-miRNA-mRNA网络研究慢性髓系白血病的甲磺酸伊马替尼耐药机制

目的 通过对甲磺酸伊马替尼（IM）处理的K562和K562G细胞长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)表达谱进行检测,探究慢性髓系白血病（CML）对IM耐药的分子机制。方法 实验分为K562组、K562G组、K562+IM组、K562G+IM组4组,各组细胞分别培养0,6,12,24 h,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测各组细胞增殖情况;基因芯片技术检测培养最适时间时细胞lncRNA、miRNA、mRNA的表达情况,并采用定量反转录PCR(qRT-PCR)法对差异lncRNAs进行验证;通过组间比较,获得耐药特异性基因并对耐药特异性mRNAs进行基因本体（GO）富集分析及生物学通路分析,然后选取耐药特异性基因用于lncRNA-miRNA-mRNA(ceRNA)网络的构建。结果 加入IM培养24 h时,K562细胞增殖抑制率达90%以上;与K562细胞比较,K562G细胞增殖抑制率较低（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,11个lncRNAs的表达情况和芯片分析的结果一致（P<0.01...     

Triad1调节K562细胞增殖、凋亡和耐药研究*

目的：研究Triad1对慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562增殖和凋亡的作用以及与伊马替尼（IM）耐药的关系。方法：将K562细胞进行血清饥饿培养,流式细胞仪检测细胞周期变化,蛋白免疫印迹法检测PCNA等增殖相关蛋白的表达。shRNA干扰K562细胞后细胞周期和凋亡的变化。构建耐药细胞K562R,蛋白免疫印迹法检测K562和K562R细胞中Triad1以及凋亡相关蛋白的表达。结果：（1）血清饥饿培养后K562细胞阻滞在G0/G1期,恢复血清培养后随着K562细胞增殖,Triad1表达减少,而PCNA等蛋白表达增加。（2）干扰Triad1表达后,K562细胞增殖能力增强,G1期细胞减少。（3）K562R细胞Triad1的表达下降,凋亡相关蛋白表达降低。结论：Triad1通过调节细胞周期来调节K562细胞的增殖,干扰Triad1可促进K562细胞增殖,凋亡减少,Triad1表达下降可能与K562细胞耐药相关。     

IFN-γ基因修饰的骨髓基质细胞体外抗白血病作用的实验研究

目的研究重组人IFN-γ腺病毒(Ad/hIFN-γ)在CML病人骨髓基质细胞(BMSCs)中的转染效率、IFN-γ表达,并进一步观察转染Ad/hIFN-γ的骨髓基质细胞体外抗白血病细胞株K562增殖和诱导K562细胞凋亡的作用. 方法以Ad/hIFN-γ重组腺病毒按感染复数(MOI)为50转染CML病人骨髓基质细胞,RT-PCR、ELISA及Western blot分别检测转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFN-γ mRNA和IFN-γ的表达;转染Ad/hIFN-γ的骨髓基质细胞与K562细胞共培养,通过绘制K562细胞生长曲线分析其对K562细胞增殖的影响;并进一步通过流式细胞学分析其对K562细胞周期的影响和诱导凋亡的作用.结果 RT-PCR、Western blot及ELISA方法都分别检测到转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞(BMSCs)中IFN-γ mRNA和IFN-γ的表达;与对照组相比,转染Ad/hIFN-γ的人骨髓基质细胞的实验组具有明显的抑制K562细胞增殖的作用(P=0.000),在细胞周期G1期的K562细胞比例明显增加,而S期K562细胞比例显著下降(P<0.01),并显著诱导K562细胞的凋亡(P<0.01).结论 Ad/hIFN-γ转染人骨髓基质细胞后可获得IFN-γ有效的表达,并在体外能有效地发挥抗白血病细胞作用.     

大黄素甲醚对白血病耐药细胞系K562/ADM耐药性的影响及机制研究

目的 评价大黄素甲醚对慢性粒细胞白血病（CML）耐药细胞系K562/ADM 多药耐药的逆转作 用及其机制。方法 CCK-8、克隆形成实验检测细胞的增殖变化,流式细胞仪、Hoechst 染色检测细胞的凋亡, 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）、Western blot 检测各相关基因的表达,迁移实验检测细胞的侵袭 能力。结果 大黄素甲醚能增强K562/ADM 细胞对ADM 的敏感性,耐药逆转倍数在2 和5 μmol/L 的浓度下 分别为2.03 和5.30 倍。miRNA-146a 在K562 耐药细胞系中低于K562 细胞,而其在K562/ADM 细胞中过 表达能恢复细胞对ADM 的敏感性。大黄素甲醚可以通过诱导miRNA-146a 的表达抑制CXCL12/CXCR4 信 号通路从而能增强ADM 抗肿瘤细胞增殖的作用。结论 大黄素甲醚可以通过上调miRNA-146a 的表达抑制 CXCL12/CXCR4 信号从而逆转K562/ADM 细胞对ADM 的耐药性。     

5,7-二甲氧基黄酮对K562细胞凋亡和livin基因表达的影响

目的:研究5,7-二甲氧基黄酮(DMF)诱导慢性髓性白血病(CML)急变期细胞系K562细胞凋亡和调控livin基因表达作用。方法:体外培养K562细胞系细胞。碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率。RT-PCR检测livin基因mRNA表达。Western blot分析livin蛋白表达。结果:DMF(5、10、20μM)增高K562细胞凋亡率,呈浓度依赖性(P<0.05)。DMF有效降低K562细胞livin mRNA和蛋白表达水平。结论:DMF诱导K562细胞凋亡作用与其下调livin基因表达相关。     

STAT3蛋白表达水平的高低对慢性粒细胞白血病伊马替尼治疗敏感性的影响

目的 升高或者降低信号转导因子与转录激活因子3(STAT3)的表达,分析其变化对于细胞的增殖分化以及敏感性有何意义.方法 构建重组质粒真核表达载体siRNA-STAT3,将重组表达质粒用脂质体Lipofactamine 3000转染人慢性粒细胞白血病K562细胞,通过嘌呤霉素持续单克隆筛选,Western blot法鉴定,进而筛选出稳定低表达组(低表达对照组、低表达1组、低表达2组)和高表达组(高表达对照组、高表达组)STAT3细胞株.将正处于增殖周期的细胞经不同浓度的伊马替尼作用后,MTT法检测细胞生长抑制率,绘制细胞增殖曲线.同时检测转染后细胞株BCR/ABL融合基因相关蛋白的表达变化.结果 与低表达对照组相比,低表达STAT3(低表达1组、低表达2组)的K562细胞组使用伊马替尼治疗有着较高的抑制率,在不同浓度作用下,其抑制率差异有统计学意义(P＜0.05).过表达STAT3后,与高表达对照组相比,在相同浓度梯度伊马替尼作用下,其抑制率差异有统计学意义(P＜0.05).低表达对照组与高表达对照组中伊马替尼抑制率差异无统计学意义.伊马替尼治疗靶向基因BCR/ABL相关蛋白中的P53、HAUSP和PTEN蛋白表达趋势和STAT3基本一致.结论 低表达STAT3蛋白可加强K562细胞对伊马替尼的敏感性,抑制STAT3蛋白有望提高伊马替尼对慢性粒细胞白血病的疗效.     

慢性粒细胞白血病细胞株伊马替尼耐药与MDR1基因表达相关性探讨

目的 探讨慢性粒细胞白血病细胞株伊马替尼耐药与MDR1基因表达相关性.方法 采用Real-time PCR检测MDR1 mRNA表达,Western-blot检测P-gp蛋白表达,MTS法检测细胞药物敏感性.结果 耐伊马替尼细胞株K562/G01MDR1的mRNA表达明显上调,P-gp表达明显上调,维拉帕米能部分逆转K562/G01细胞株对伊马替尼的耐药.结论 MDR1基因参与伊马替尼耐药机制,P-gp抑制剂能改善伊马替尼临床疗效.     

体外诱导K562细胞伊马替尼耐药及其机理的初步探讨

目的 体外诱导K562细胞伊马替尼(imatinib)耐药并对其耐药性进行检测.方法 以浓度递增的方法诱导K562对伊马替尼产生耐药, MTT法确定其耐药性.RT-PCR方法半定量测定耐药细胞中BCR/ABL基因水平,并进行BCR/ABL基因序列测定.流式细胞术测定P-gp表达.高效液相色谱仪(HPLC)测定耐药细胞内药物浓度.结论 ①浓度递增法成功诱导K562细胞伊马替尼耐药(K562R),K562R细胞能长期在含5.0 μmol/L的伊马替尼的培养液中生长.②细胞生长曲线显示5.0 μmol/L伊马替尼作用于K562R细胞120 h,其活细胞数量与0 h无明显差别.6个浓度梯度的伊马替尼(0、0.25、0.50、0.75、1.00、2.00 μmol/L)作用于K562细胞24 h,发现所有浓度(除0 μmol/L外)伊马替尼均可抑制K562细胞的生长,24 h细胞活力几乎为零.③MTT法抑制率测定K562细胞半数抑制浓度约为0.75 μmol/L,K562R细胞约为7.5 μmol/L,耐药倍数约为10倍.④HPLC细胞内药物浓度测定显示K562R胞内伊马替尼药物浓度低于K562细胞(P＜0.01),流式细胞检测未发现P-gp表达.⑤374 bp的BCR/ABL基因序列分析未发现常规热点区域基因突变.结论 体外成功诱导出伊马替尼耐药细胞--K562R细胞.K562R耐药主要环节为胞内药物浓度降低,而胞内药物浓度降低与P-gp无关.耐药机理需要进一步研究.     

硫利达嗪增强伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞 K562的抑制作用及机制

目的：观察硫利达嗪（THZ）、伊马替尼（IM）单药及联合对人慢性粒细胞白血病（CML）细胞 K562的诱导作用,并探讨其机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定THZ、IM单药及联合对细胞的抑制作用,计算两药协同指数（CI）。检测 THZ、IM单药及联合对细胞凋亡的影响。West-ern blot 法检测凋亡蛋白 Cleaved-Bid、Procaspase 3,凋亡调节蛋白 Bcl-2、Bax、pPI3K、pAKT 表达的变化。结果 THZ 16μmol／L 作用24 h 后 K562细胞增殖明显抑制,低剂量细胞毒性作用不明显。IM低剂量即有较强的细胞毒性作用,两药联合后经计算有较好的协同作用。根据 CI 值选定药物浓度作用 K562细胞24 h,流式细胞术结果显示,THZ 单药组无明显细胞凋亡,IM单药组、IM联合 THZ 组均存在不同程度的细胞凋亡,与对照组比较差异有统计学意义（P ＜0．01）。Western blot 法结果显示各实验组细胞胞内 Cleaved-Bid 表达量增加,Procaspase 3表达量下降。抗凋亡蛋白 Bcl-2、pPI3K、pAKT 下调、促凋亡蛋白 Bax 表达明显上调,各实验组与对照组比较,差异有统计学意义（P ＜0．01）。结论低剂量 THZ 联合 IM对 CML 细胞 K562具有显著的增殖抑制作用,其作用较 IM单用作用强,THZ 有明确增敏 IM的作用。与 IM、THZ 单药组比较,IM联合 THZ 组 Cleaved Bid 表达量上调、Procaspase 3表达量下降,其杀伤机制可能与线粒体通路及抑制 PI3K-AKT 通路均有关。     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562的凋亡作用及机制

目的 探讨硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562(K562R)的诱导凋亡作用及机制.方法 采用浓度梯增法建立耐伊马替尼K562细胞系.应用CCK-8法检测不同浓度硼替佐米分别作用K562和K562R细胞24 h、48 h后,对细胞的增殖抑制的效果.使用流式细胞术方法分别检测硼替佐米单独或联合伊马替尼作用于K562R细胞48 h后的细胞凋亡.应用Western blotting检测不同浓度硼替佐米作用K562R细胞48 h后,Mcl-1、Bcl-2、Bcr/Abl蛋白表达的异同.结果 成功将对伊马替尼敏感的K562细胞诱导为K562R,耐药倍数为31.8;硼替佐米对K562及K562R细胞的增殖抑制呈浓度、时间依赖(P均<0.05);随着硼替佐米浓度增加,对K562R细胞的诱导凋亡作用增强,且硼替佐米与伊马替尼联合具有协同作用(P<0.05);硼替佐米可抑制K562R细胞Mcl-1,Bcr/Abl蛋白的表达,Bcl-2无变化.结论 硼替佐米具有对K562R细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与下调K562R细胞Bcr/Abl和MCL-1的表达以及促进MCL-1发生切割有关.     

三氧化二砷逆转甲磺酸伊马替尼对K562/MDR1耐药的实验研究

目的研究三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对蛋白酪氨酸激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(imatinib mesy-late,IM)K562/MDR1耐药的逆转作用。方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分别检测IM对K562和K562/MDR1细胞的药敏性,计算半数抑制浓度(IC50)及IM对K562/MDR1的耐药倍数;检测ATO对K562/MDR1细胞的药敏性,计算IC50;将非细胞毒作用浓度的ATO与IM联合应用于K562/MDR1,计算此时IM的IC50以及ATO应用后的逆转倍数。应用流式细胞术比较IM单用以及与非细胞毒作用浓度的ATO联合应用后,对K562/MDR1凋亡率的影响,分析ATO对IM敏感性的影响。结果IM存在对K562/MDR1耐药的现象,与亲本K562细胞比较,其耐药倍数为2.51,采用非细胞毒作用的ATO对IM的逆转倍数为1.86,并可提高IM对K562/MDR1的凋亡率。结论IM存在对K562/MDR1的耐药现象,ATO可有效逆转IM耐药,并可增强IM对K562/MDR1细胞的诱导凋亡作用。     

伊马替尼敏感及耐药K562细胞P-糖蛋白、缺氧诱导因子和鞘氨醇激酶表达的比较

目的:比较伊马替尼敏感及耐药K562(K562/Ima)细胞P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶表达的差异。方法:取对数生长期的K562和K562/Ima细胞,采用不同质量浓度的伊马替尼分别处理48h,应用MTT法计算耐药倍数;另取上述2种细胞,分别采用Western blot、RT-PCR及同位素掺入等方法检测2种细胞中P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶的表达。结果:相对于K562细胞,K562/Ima细胞的耐药倍数为24。在K562/Ima细胞中,P-糖蛋白、缺氧诱导因子1α和鞘氨醇激酶的表达均高于K562细胞。结论:K562/Ima的耐药机制与P-糖蛋白、缺氧诱导因子、鞘氨醇激酶等基因的表达上调有关。     

尿多酸肽诱导慢性粒细胞白血病伊马替尼耐药细胞生长抑制及分化的体外观察

目的观察尿多酸肽（CDA-2）在体外对慢性粒细胞性白血病（CML）伊马替尼（IM）耐药细胞株K562R生长抑制及诱导分化的作用。方法MTT和集落形成实验观察CDA-2对CML细胞株K562、IM耐药细胞株K562R、IM耐药和非耐药CML患者骨髓细胞生长抑制作用。吉姆萨染色观察细胞形态,膜联蛋白-V（Annexin-V）／碘化丙啶（PI）染色分析细胞凋亡,流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b、CD14的表达,反转录PCR（RT-PCR）检测细胞分化相关基因、细胞周期调节基因及DNA甲基化转移酶基因的表达。结果CDA-2均可抑制K562、K562R、IM耐药和非耐药CML患者骨髓细胞的生长,且对K562R细胞和IM耐药CML患者骨髓细胞的生长抑制更明显;CDA-2改变了K562和K562R细胞形态,诱导细胞向成熟分化,并引起细胞周期在G1期的停滞;这种停滞可能与CDA-2抑制DNA甲基转移酶活性,逆转细胞周期调节基因的甲基化状态有关。结论CDA-2在体外对K562R细胞株有很强的生长抑制和诱导分化的作用,提示CDA-2可能成为治疗IM耐药的CML患者的一种新药。     

Glut5在Ph+急性淋巴细胞白血病伊马替尼耐药中的机制研究

目的采用费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ALL）伊马替尼耐药细胞株SUP-B15/R研究伊马替尼耐药的可能机制。方法通过基因芯片分析法对比找出伊马替尼耐药株SUP-B15/R与敏感株SUP-B15/S之间表达差异的基因,筛选出可能与耐药相关的基因SLC2A5,分别采用实时荧光定量PCR（qPCR）和Western blot进一步验证SLC2A5及其编码蛋白葡萄糖转运体5（Glut5）在SUP-B15/R与SUP-B15/S之间表达的差异。采用MTT实验检测果糖对SUP-B15/S细胞伊马替尼敏感性的影响,以及qPCR检测相关信号通路的改变,探究Glut5表达增加在SUP-B15细胞伊马替尼耐药中的作用。结果基因芯片结果发现,与细胞代谢相关的SLC2A5基因在SUP-B15/R中高表达,qPCR和Western blot实验进一步验证了上述结果。而果糖处理后SUP-B15/S细胞对伊马替尼的敏感性下降,IC50由（44.50±2.38 ）μmol/L增加到（64.71±1.69） μmol/L,同时Glut5、PI3K、AK mRNA表达增强。结论SUP-B15/R细胞高表达SLC2A5,Glut5高表达促进细胞对果糖的吸收,激活伊马替尼作用下受到抑制的PI3K/AKT信号通路,导致SUP-B15细胞对伊马替尼耐药。