人microRNA-339慢病毒载体的构建及其对结肠癌细胞SW620迁移的影响

目的 构建人microRNA-339(has-miR-339)慢病毒载体,并探讨miR-339-5p/3p对结肠癌细胞SW620迁移能力的影响.方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-339前体序列(pre-miR-339)及其侧翼序列,将pre-miR-339和PLVTHM载体经双酶切后连接,产生PLVTHM-pre-miR-339慢病毒载体,并经测序鉴定;以PLVTHM-pre-miR-339、psPAX2和pMD2.G三质粒包装系统共同转染293FT细胞,包装产生慢病毒.流式细胞仪筛选建立稳定过表达pre-miR-339的SW620细胞株,实时荧光定量RT-PCR检测miR-339-5p及miR-339-3p表达.利用细胞划痕实验进行细胞迁移能力检测.结果 成功构建PLVTHM-pre-miR-339慢病毒载体,测序证实所插入基因序列完全正确.倒置荧光显微镜下观察可见转染后的293FT细胞及SW620细胞均表达绿色荧光.在过表达pre-miR-339的SW620亚细胞系中,miR-3396p及miR-339-3p表达水平显著高于空载对照组.划痕实验结果显示:与SW620/PLVTHM-NC组相比,SW620/PLVTHM-pre-miR-339组细胞迁移减缓,划痕较宽.结论 成功构建了PLVTHM-pre-miR-339慢病毒载体和稳定过表达miR-3396p及miR-339-3p的SW620亚细胞系,并证实miR-339-5p/3p可抑制结肠癌细胞SW620的迁移能力.     

绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建及活性检测

【目的】构建绿色荧光蛋白(GFP)示踪的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(HSV1-tk)的重组慢病毒载体,并检测该系统对人皮肤黑色素瘤细胞株A375的感染活性。【方法】构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒表达载体p LV-tk-GFP,并使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定;用该重组质粒与辅助质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染A375,以嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株;使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,更昔洛韦(GCV)杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。【结果】重组质粒p LV-tk-GFP经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,tk基因已连接到载体正确位置,序列无突变;包装病毒并感染细胞后,荧光显微镜下观察显示tk-GFP基因在A375中表达;筛选得到稳定表达细胞株A375/tk-GFP,GCV能显著杀伤A375/tk-GFP细胞,表明tk基因活性正常。【结论】成功构建了重组p LV-tk-GFP慢病毒载体,该载体能包装产生活病毒且在感染的人黑色素瘤细胞株A375中tk-GFP具有生物活性。     

人microRNA-338-3p慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

目的构建人microRNA-338-3p(has-miR-338-3p)慢病毒表达载体并初步筛选鉴定miR-338-3p的靶基因。方法由miRBase数据库查找获得miR-338-3p前体序列,设计目的基因片段并人工合成;将miR-338-3p前体序列和pLV-THM载体经双酶切后连接,产生pLV-THM-miR-338-3p慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆;以pLV-THM-miR-338-3p、psPAX2和pMD2.G质粒共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒并测定滴度。流式细胞仪筛选建立稳定过表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系,利用Real-time RT-PCR检测miR-338-3p表达,Western-blot检测SMO蛋白表达水平,Transwell小室穿透实验检测肿瘤细胞转移能力。结果经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-338-3p的慢病毒表达载体pLV-THM-miR-338-3p,倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293T表达绿色荧光。稳定过表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系中,miR-338-3p表达水平显著高于阴性对照组和未处理组,SMO蛋白表达水平明显下降,且肿瘤细胞表现出侵袭转移能力的减弱。结论成功构建了has-miR-338-3p慢病毒表达载体和稳定过表达miR-338-3p的SW-620亚细胞系,初步证实miR-338-3p可通过抑制结直肠癌细胞中SMO蛋白表达而抑制肿瘤细胞转移,此为进一步深入研究miR-338-3p在结直肠癌中生物学功能奠定了基础。     

S100A11慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 构建S100A11基因慢病毒表达载体,建立Huh-7 S100A11稳定细胞株,并鉴定其表达. 方法 RT-PCR扩增S100A11基因片段,与pWPT载体经Mlu Ⅰ和Not Ⅰ同时酶切后连接,构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11;将表达载体pWPT-GFP和pWPT-S100A11与慢病毒包装质粒pMD2.G和psPAX2共同感染293T细胞,获得携带GFP和S100A11基因的慢病毒,将两种慢病毒分别感染Huh-7细胞,获得Huh-7 S100A11和Huh-7GFP稳定细胞株;利用Real-Time PCR和Western Blotting实验方法检测感染后S100A11的过表达情况. 结果 成功构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11;慢病毒感染Huh-7细胞株后,阳性对照Huh-7GFP经荧光镜检测传染率达95％;感染Huh-7细胞后S100A11的mRNA和蛋白表达量均增加. 结论 成功构建慢病毒表达载体pWPT-S100A11,并建立了Huh-7S100A11稳定细胞株,为进一步研究S100A11基因在肝癌中的生物学功能和机制奠定了基础.     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

改建型STAT1-CC基因慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建携带STAT1基因和突变型STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,转染肺癌A549细胞并检测STAT1和STAT1-CC基因在肺癌A549细胞内的表达.方法:采用PCR技术从质粒模板中扩增得到目的基因STAT1和STAT1-CC,将其接入含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体中,构建慢病毒载体表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,双酶切和测序鉴定.分别将重组子Lenti-STAT1、LentiSTAT1-CC和包装质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,感染非小细胞肺癌细胞株A549.荧光显微镜观察A549细胞EGFP表达,Western Blotting验证STAT1在A549细胞株中的表达.结果:酶切及测序结果显示成功构建重组慢病毒表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,将慢病毒颗粒感染A549细胞48 h后,观察到宿主细胞内EGFP表达,Western Blotting证实STAT1蛋白在A549细胞中过表达.结论:本实验成功构建了携带STAT1基因和STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,并在A549细胞中过表达STAT1基因.     

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD(Bcl-2-associated death protein)重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen 1),应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低(P<0.05)。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。     

核糖体蛋白S6 shRNA慢病毒载体的构建及其对肺腺癌A549细胞株增殖的影响

目的 探讨靶向抑制核糖体蛋白S6（rpS6）表达的短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）慢病毒载体的构建方法及抑制rpS6表达对肺腺癌A549细胞株增殖的影响。方法 合成针对rpS6基因的双链寡核苷酸序列,插入质粒载体pGCsil-GFP,转化大肠杆菌细胞,测序鉴定插入片段;再通过293T细胞转染和慢病毒包装,收集浓缩病毒并感染肺腺癌A549细胞株。流式细胞技术分选强阳性表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞克隆,荧光定量PCR及Western blot检测rpS6基因的mRNA和蛋白干扰效率。体外利用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析抑制rpS6表达对肺腺癌A549细胞株增殖能力的影响。结果 重组pGCsil-sh-rpS6-GFP质粒经测序鉴定示：插入序列与rpS6干扰序列完全符合,证实pGCsil-sh-rpS6-GFP质粒构建成功。sh-rpS6慢病毒稳定感染A549细胞株后,流式细胞技术分选GFP强阳性表达的细胞克隆比率为86.80%。荧光定量PCR与Western blot检测示： sh-rpS6组的mRNA和蛋白干扰效率分别为(79.72±6.83)%、（83.77±12.13)%。体外增殖实验示：与A549细胞相比,sh-rpS6组在各时间点的OD值较对照组均下降（均P<0.05）。结论 构建的sh-rpS6慢病毒载体能稳定、有效地抑制肺腺癌A549细胞株rpS6的表达,并有效减慢A549细胞株的增殖速度。     

MALAT1调控 miR-19b-3p/HIF-1α分子轴参与非小细胞肺癌的发生发展

摘要:目的 探讨 MALAT1调控 miR-19b-3p/HIF-1α影响非小细胞肺癌(NSCLC)的发病机制。方法 采用实时 荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测 MALAT1、miR-19b-3p在 NSCLC 肺癌组织和 NSCLC 细胞系中的表达水平。过表达 miR-19b-3p和敲除 MALAT1后,采用qRT-PCR和 Westernblot检测 A549细胞中 MALAT1、miR-19b-3p、缺氧诱导因 子-1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达水平的变化。采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)和流式细胞术检 测细胞增殖、细 胞 周 期 和 凋 亡 情 况。采 用 Transwell实 验 检 测 细 胞 迁 移 及 侵 袭 能 力。结 果 在 NSCLC 癌 组 织 及 NSCLC细胞系中 MALAT1表达升高、miR-19b-3p表达降低,并且 MALAT1与 miR-19b-3p表达水平呈负相关(r= -0.8969,P<0.01);过表达 miR-19b-3p及敲除 MALAT1可使 A549细胞中 miR-19b-3p基因表达升高,MALAT1、 HIF-1α及 VEGF基因表达下降。过表达 miR-19b-3p使 A549细胞增殖能力、分裂能力、侵袭迁移能力下降,凋亡率增 加。结论 MALAT1可能靶向 miR-19b-3p调节 HIF-1α/VEGF参与非小细胞肺癌发生发展。     

RNA干扰技术抑制肺癌细胞外源性绿色荧光蛋白的表达

目的：构建针对绿色荧光蛋白（GFP）基因的发夹结构RNA（small hairpin RNA,shRNA）表达载体（pshRNA-GFP）,观察对肺癌A549细胞的GFP特异性抑制作用。方法：设计针对GFP基因的shRNA序列,构建pshRNA-GFP质粒。与报告基因质粒PEGFP-N1共转染A549细胞,分别用激光共聚焦扫描显微镜（Laser confocal seanning mieroscope,LCSM）和流式细胞术检测干扰效果。结果：瞬时共转染pshRNA-GFP质粒和PEGFP-N1质粒后,荧光显微镜观察结果显示A549细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至32.4％,差异有显著性。结论：靶向GFP的shRNA表达质粒能有效而特异抑制GFP在A549中的表达,A549细胞中存在RNA干扰现象。     

Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。     

利用慢病毒载体系统构建稳定表达癌基因PIN1的鼻咽上皮细胞株

目的利用慢病毒载体系统构建稳定表达癌基因肽脯氨酰异构酶PIN1的鼻咽上皮细胞株,用于后续生物学功能方面研究。方法将病毒载体p CDH-PIN1用Lipofectamine转染到293TN细胞,收集含有PIN1病毒颗粒的培养液加入NP69细胞进行培养。荧光显微镜观察慢病毒载体GFP发光率、RT-q PCR、Westernblot验证PIN1的表达情况。结果荧光显微镜观察发现PIN1基因已整合到94%±2.09%的NP69细胞中,转染效果稳定。RT-q PCR、Westernblot检测发现NP69-PIN1组中PIN1的mRNA和蛋白水平明显高于对照组和空白组。结论课题组利用慢病毒载体系统成功在鼻咽上皮细胞构建PIN1过表达株。     

慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建

目的 利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法 以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-HIF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论 慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.     

microRNA-149在顺铂耐药非小细胞肺癌细胞中的表达变化及相关机制研究

目的探讨microRNA-149(miR-149)在顺铂耐药A549细胞(A549/DDP)中的表达规律及作用机制。方法生物信息学方法分析顺铂耐药A549细胞中的microRNA表达变化。体外培养A549细胞并诱导对顺铂耐药的A549/DDP细胞系,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-149在两种细胞系中的表达差异。CCK-8试验及流式细胞术检测单纯miR-149过表达以及miR-149和ABCC1同时过表达对细胞顺铂敏感性的影响。qRT-PCR及Western blot检测A549及A549/DDP细胞中ABCC1的表达差异,双荧光素酶报告试验检测miR-149以ABCC1之间的靶向关系,并利用qRT-PCR及Western blot加以证实。结果 A549/DDP细胞中的miR-149表达较低,与A549细胞相比,差异具有统计学意义(t=-4.65,P0.05)。miR-149过表达可以降低顺铂处理后A549/DDP细胞的活力但增加其凋亡率,与阴性转染对照细胞相比,差异具有统计学意义(P均0.05)。与A549细胞相比ABCC1在A549/DDP细胞中存在mRNA及蛋白水平的高表达,差异具有统计学意义(t=8.44、5.14,P均0.05)。过表达miR-149可以降低A549/DDP细胞中ABCC1的mRNA及蛋白水平,与阴性转染对照细胞相比,差异具有统计学意义(t=-3.14、-4.54,P0.05)。双荧光报告酶分析显示miR-149可直接与ABCC1 mRNA的3’UTR结合。miR-149与ABCC1同时过表达的A549/DDP细胞与单纯miR-149过表达的细胞相比,顺铂处理后细胞活力增加,凋亡减少,差异具有统计学意义(P均0.05)。结论 miR-149表达不足可能引起A549细胞对顺铂的耐药,该机制与miR-149对ABCC1的抑制作用有关。     

建立慢病毒介导的miR-145稳定过表达的鼻咽癌细胞株

目的 构建过表达miR-145的慢病毒载体,建立稳定过表达miR-145的鼻咽癌细胞株.方法 构建慢病毒表达质粒pLVTHM/miR-145;293FT细胞进行慢病毒包装,生产的慢病毒感染鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,经流式细胞仪筛选后,建立稳定表达miR-145的鼻咽癌细胞株;最后应用荧光定量PCR检测病毒感染后鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2中miR-145的表达水平.结果 荧光定量PCR结果和测序验证pLVTHM/miR-145重组质粒构建成功;包装生产的慢病毒感染鼻咽癌细胞CNE1和CNE2后,与阴性对照组比较,其表达水平分别升高4000倍和4500倍.结论 成功构建了pLVTHM/miR-145慢病毒重组质粒,建立稳定表达miR-145的鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2,为研究miR-145在鼻咽癌发生发展过程中的基因调控和相应的作用机制提供了有用的细胞模型.     

溪黄草对circ_0091579/miR-515-5p、肺癌细胞A549增殖及凋亡的影响

目的探讨溪黄草对circ_0091579/miR-515-5p及肺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。 方法将肺癌A549细胞分为对照组、溪黄草(20、40、80 mg/L)组、si-circ_0091579组、si-NC组、pcDNA-circ_0091579组、pcDNA组、溪黄草+pcDNA-circ_0091579组。CCK-8、平板克隆实验、流式细胞术检测A549细胞抑制率、克隆形成数以及凋亡率。qRT-PCR检测circ_0091579和miR-515-5p表达。双荧光素酶报告实验验证circ_0091579和miR-515-5p相互作用。 结果溪黄草显著降低A549细胞的增殖和克隆形成能力,促进细胞凋亡,诱导cleaved-Caspase-3表达上调及circ_0091579下调,且呈质量浓度依赖性。下调circ_0091579可降低A549细胞的增殖和克隆形成能力,促进细胞凋亡,诱导cleaved-Caspase-3表达上调。上调circ_0091579可逆转溪黄草对A549细胞的增殖抑制和凋亡促进功能。circ_0091579和miR-515-5p直接特异性结合。 结论溪黄草可抑制肺癌细胞A549增殖,诱导其凋亡,其机制与下调circ_0091579/miR-515-5p途径有关。     

LncRNA MALAT-1靶向microRNA-370-3p调节Akt通路对肺癌细胞生物学行为影响的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子-1(LncRNA MALAT-1)是否能靶向调节microRNA-370-3p(miR-370-3p)的表达,以及对Akt通路和肺癌细胞生物学行为的影响。方法 选用非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞体外培养,分别抑制LncRNA MALAT-1(转染si-MALAT-1)或过表达miR-370-3p(转染miR-370-3p mimic),抑制LncRNA MALAT-1和干扰miR-370-3p(同时转染si-MALAT-1和antimiR-370-3p),观察A549细胞的生物学行为和Akt通路蛋白的表达。qRT-PCR检测LncRNA MALAT-1、miR-370-3p mRNA的表达;MMT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Transwell实验检测细胞迁移与侵袭;Western blotting检测Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K蛋白相对表达量。构建MALAT-1野生型(MALAT-1^WT＿1uc)与突变型(MALAT-1MUT＿1uc)荧光素酶报告基因质粒并分别与miR-370-3...     

miR-149-5p在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的分析miR-149-5p在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达及其临床意义。方法应用qRT-PCR方法检测40对HCC癌组织和癌旁肝组织中miR-149-5p的表达,并分析miR-149-5p的表达与肝癌患者临床病理之间的关系,进一步将以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)为报告基因的miR-149-5p慢病毒(LV-miR-149-5p)感染MHCC97-H肝癌细胞,以过表达miR-149-5p,采用MTT检测感染后细胞增殖的变化,采用流式细胞仪测定感染后细胞周期的变化,并采用Transwell侵袭实验检测感染后细胞的体外侵袭能力的变化。结果 qRT-PCR结果提示miR-149-5p在HCC癌组织中的相对含量(5.522±1.104)低于癌旁肝组织(9.279±1.594)(P<0.05),统计分析表明miR-149-5p在癌和癌旁肝组织中相对含量的比值与AFP含量负相关(P<0.05)。体外实验证实,miR-149-5p过表达不能影响细胞周期但能抑制细胞增殖(P<0.05),而在Transwell侵袭实验中,LV-miR-149-5p感染MHCC97-H细胞后,对照细胞组透膜细胞数为(86.3±11.8)/视野,对照慢病毒组透膜细胞数为(83.7±4.0)/视野,LV-miR-149-5p组透膜细胞数为(50.6±3.4)/视野,实验组细胞侵袭能力较对照组细胞显著降低(P<0.05)。结论 miR-149-5p的过表达可抑制MHCC97-H细胞的增殖和侵袭,因此,miR-149-5p可作为一种抑癌基因在HCC的诊断及治疗中发挥作用。