表达幽门螺杆菌hpaA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建和鉴定

目的：构建表达幽门螺杆菌（H.pylori)hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门低 疫苗菌。方法：用基因工程的方法将hpaA基因克隆入原核表达质粒pTrc99A,并进行了基因测序。重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261,提取重组疫苗菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆。用SDS－PAGE电泳和Western blot进行HpaA表达和鉴定。结果：经PCR和酶切证实,构建了含hpaA的重组原核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌。HpaA能在疫苗菌中以二聚体形式表达,HpaA量约占全菌体蛋白量的17％,Westem blot证实其有免疫原性。结论：构建了表达H.pylori hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门氏疫苗菌,为探索制备H.pylori口服活疫苗尊定了基础。     

幽门螺杆菌微球疫苗免疫诱导的免疫应答

目的通过对幽门螺杆菌微球免疫后Balbc小鼠血清IgG、IgA、胃肠sIgA的检测及脾脏IL4、IFNγ的mRNA表达水平、IgGASC、IgAASC数量的比较观察,探求疫苗的免疫保护机理。方法取Balbc小鼠口服免疫疫苗,剂量为150μg/(只·次),免疫时间为0、14、30d。2周后取血清及胃肠洗液进行抗体检测,同时取脾脏检测细胞因子mRNA表达水平及ELISPOT检测抗体分泌细胞数量变化。结果免疫后小鼠以上检测指标与对照组比较均有不同程度的升高。结论微球疫苗所诱发的免疫保护是细胞免疫、体液免疫两者共同作用的结果。     

UreA/KatA双价减毒沙门菌疫苗株抗幽门螺杆菌的免疫保护作用

目的探讨由2种幽门螺杆菌(Hp)抗原组合的双价疫苗在防治Hp感染中的作用以及减毒鼠伤寒沙门菌作为传递Hp抗原的活疫苗载体的可行性.方法PCR技术扩增尿素酶A亚单位(ureA)和过氧化氢酶(katA)基因片段,构建表达UreA/KatA融合蛋白的重组质粒,重组质粒宿主菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Westernblot分析UreA/KatA的表达情况.将该重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261株中构建重组口服活疫苗株,经口服免疫C57BL/6小鼠,再用Hp悉尼株进行攻击,用快速尿素酶试验和细菌定量培养对胃粘膜中Hp的定植及生长情况进行观察.结果SDS-PAGE电泳图上显示1条相对分子质量(Mr)约108×103的新生蛋白带,占细菌总蛋白的5%,并能与抗GST抗体发生特异性反应.动物实验结果显示,经UreA/KatA双价疫苗免疫的小鼠能有效防御Hp的感染.结论表达UreA/KatA融合蛋白的双价减毒沙门菌疫苗株能诱导抗Hp保护性免疫反应,有望在Hp感染及其相关性疾病的防治中发挥积极作用.     

幽门螺杆菌疫苗免疫机制的研究进展

幽门螺杆菌(H.pylori)是定植于人体胃粘膜的重要致病菌,而粘膜疫苗以其有效的保护性免疫成为防治H.pyiori的热点,但对相应的免疫机制的认识目前尚不明确.故本文对H.pyiori疫苗的保护性免疫机制中的抗原递呈机制,抗体的作用以及TH细胞反应的作用等研究进展做一概要介绍.     

幽门螺杆菌oipA DNA重组质粒的构建及免疫保护作用

目的:探讨幽门螺杆菌(Hp)oipADNA重组质粒在防御Hp感染中的作用。方法:将HpoipA基因的开放读码框架定向克隆入pVAX1载体,获得的重组子pVAX1oipA转染SGC7901细胞,用RTPCR及ELISA方法检测细胞oipA转录及翻译水平的表达。抽提纯化重组质粒pVAX1oipA,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠(100μg/只)每周1次,共3次,以质粒pVAX1(空载组)和生理盐水(空白组)做对照,分别于末次注射1个月和2个月后ELISA法检测血清中相应抗体。在证实有免疫应答的基础上,以HpSS1攻击小鼠(0.5×1090.5ml/只)3次,于末次攻击4周后,取胃黏膜组织作细菌学(包括胃黏膜快速尿素酶试验、细菌培养鉴定)和组织学检测。结果:pVAX1oipA转染的SGC7901细胞在转录水平和翻译水平均有相应的表达;免疫小鼠产生抗oipA抗体。免疫小鼠经细菌攻击后,实验组、空载组和空白组胃黏膜组织快速尿素酶实验阳性率分别为0(0/10)、90%(9/10)和100%(5/5),细菌培养阳性率分别为20%(2/10)、90%(9/10)和100%(5/5),组织学检测结果:空载组和空白组小鼠胃黏膜均出现轻度或重度糜烂,而实验组小鼠胃黏膜80%(8/10)正常,显示oipADNA重组子具有免疫保护作用。结论:oipADNA重组子能有效诱导抗Hp保护性免疫反应。     

幽门螺杆菌与Th细胞应答的研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是慢性胃炎、消化性溃疡及胃赫膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)等疾病的重要致病因子,与胃癌的发生密切相关,全世界大约有50%的人感染幽门螺杆菌.目前研究认为CD4+T细胞应答对于幽门螺杆菌感染的致病及免疫保护都具有重要的作用.     

表达幽门螺杆菌NAP基因的减毒沙门菌疫苗株的建立

目的：建立表达幽门螺杆菌(H．pylori)中性粒细胞活化蛋白(Hp—NAP)的减毒沙门菌疫苗株。方法：用PCR扩增Hp—NAP基因，并克隆至原核表达质粒pTrc99A中，经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列，并与GenBank中相关序列的同源性进行比较。以重组质粒pTrc99A—NAP转化减毒伤寒沙门菌SL3261，培养后筛选阳性菌落，抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的Hp—NAP蛋白用SDS—PAGE进行鉴定，用薄层扫描分析蛋白含量。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实，克隆的Hp—NAP基因与GenBank中相关序列的同源性为98％(397／402)，氨基酸序列的同源性为98％(131／133)。以重组质粒pTrc99A—NAP转化的减毒沙门菌，可表达Mr约15000的Hp—NAP蛋白，表达量约占菌体蛋白量的37．5％。结论：建立了可表达Hp—NAP基因的减毒鼠伤寒沙门疫苗株，为进一步研制Hp口眼疫苗奠定了基础。     

OipA DNA疫苗抗螺旋形和球形幽门螺杆菌免疫保护作用及其机制

目的探讨pcDNA3.1-oipA DNA疫苗在抗螺旋形与球形幽门螺杆菌（Hp）感染中的作用及其机制.方法抽提并纯化可表达OipA蛋白的重组质粒pcDNA3.1-oipA,以金粉包裹后,用基因枪接种BALB/c小鼠,5 μg/只,接种2次,以pcDNA3.1（空载组）作对照.对免疫小鼠进行：（1）免疫保护实验：于末次免疫后8周,分别给予螺旋形及球形Hp SS1攻击4次,于末次攻击4周后取胃组织做细菌学（组织尿素酶试验、细菌培养）及病理学检测.（2）小鼠免疫指标检测：分别于末次免疫后2、8、12周采集小鼠血清,用ELISA法检测其抗Hp OipA IgA、IgG、IgG1抗体.于末次免疫后12周,取脾细胞,用FLISA法检测IFN-γ、IL-2的含量;用流式细胞术检测CD4^＋/CD8^＋T淋巴细胞的比值.结果以螺旋形及球形Hp攻击的免疫小鼠,快速尿素酶实验阳性率分别为20%和10%;细菌培养阳性率分别为60%和50%,与空载组比较P＜0.05.空载组小鼠胃黏膜均出现轻度或重度糜烂,而以螺旋形Hp攻击的实验组小鼠50%胃黏膜正常,以球形Hp攻击的实验组小鼠60%胃黏膜正常,与空载组比较P＜0.05.小鼠免疫指标检测结果：免疫后8周,产生了抗OipA的特异性IgA、IgG、IgG1抗体,抗体滴度比对照组高2倍以上;脾细胞中CD4^＋/CD8^＋T淋巴细胞的比值升高;脾细胞培养上清液IFN-γ、IL-2的含量明显高于对照组（P＜0.05）.结论 pcDNA3.1-oipA DNA疫苗能有效诱导免疫小鼠产生体液与细胞免疫并使小鼠兼具一定的抗螺旋形及球形Hp感染的能力.     

幽门螺杆菌疫苗相关研究进展

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是定植于人胃内的革兰氏阴性螺形杆菌,为微需氧菌,营养要求较高。幽门螺杆菌感染是人类最常见的传染病之一。在发展中国家,近80%未满10岁的儿童和[1,2]     

以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌蛋白抗原对幽门螺杆菌感染的免疫保护作用

目的探讨以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌（脚）抗原对脚感染的免疫保护作用。方法BALB／c小鼠随机分为9组：（1）空白对照组：PBS溶液；（2）壳聚糖酸溶液组；（3）壳聚糖颗粒组；（4）印抗原组；（5）np抗原＋壳聚糖酸溶液组；（6）Hp抗原＋壳聚糖颗粒组；（7）Hp抗原＋CT组；（8）脚抗原＋壳聚糖酸溶液＋CT组；（9）Hp抗原＋壳聚糖颗粒＋CT组。各组于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次，免疫后4周给予109CFUIml的SSlnp菌液0．5ml／只进行攻击，隔日1次，共2次。4周后，采用定量砌培养和病理改良Giemsa染色法检测胃黏膜内伽感染情况。结果（1）以壳聚糖为佐剂的印抗原的免疫保护率达60％，与以凹为佐剂的伽抗原的免疫保护率（58．33％）相似，显著高于单纯印抗原组及其他不含印抗原组（P〈0．05），同时以凹＋壳聚糖为佐剂的坳疫苗的保护率为84．62％、85．71％，高于CT或壳聚糖单独作佐剂组。（2）病理组织学检测含佐剂组的铷定植计分显著低于无佐剂组和无抗原组（P〈0．05），壳聚糖和CT联合应用组的跏定植计分最低，显著低于单以CT为佐剂组（P〈0．05）。（3）砌定量培养脚定植密度在佐剂中含壳聚糖组均显著低于对照组和单纯脚抗原组（P〈0．05），而单以CT为佐剂组脚定植密度与对照组和单纯坳抗原组差异无统计学意义（P〉0．05）。结论以壳聚糖为佐剂的坳抗原对Hp感染具有免疫保护作用，并且与CT有协同作用。     

携带幽门螺杆菌ureB和IL-2质粒DNA的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗构建

目的　构建编码幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,H .pylori)尿素酶B亚单位 (ureB)基因和小鼠IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,体外转染Cos 7细胞 ,鉴定其表达蛋白的免疫性。方法　应用聚合酶链式反应 (PCR)技术从H .pylori标准菌株CCUG1 7874基因组DNA扩增ureB基因 ,从重组质粒 pCIneo IL 2扩增小鼠IL 2基因 ,通过T A克隆分别插入 pUCmT载体 ,检测ureB及IL 2的核苷酸序列 ,通过酶切、连接反应分别克隆入真核表达载体 pIRES ,PCR和酶切反应进行鉴定 ;重组载体 pIRES ureB和 pIRES ureB IL 2转入减毒鼠伤寒沙门菌LB50 0 0 ,抽提质粒 ,再次转入SL72 0 7,反复传代 ,鉴定核酸疫苗载体菌的稳定性。通过脂质体法将重组载体 pIRES ureB和pIRES ureB IL 2转染Cos 7细胞 ,SDS PAGE及Westernblot法检测表达蛋白的免疫性。结果　扩增出长约 1 70 0bp的ureB基因和 51 0bpIL 2 ,测序结果表明 ,扩增出的ureB基因与基因库H .pyloriureB序列一致 ,IL 2序列和小鼠的IL 2序列一致 ,PCR和酶切鉴定结果证实ureB和IL 2基因克隆入真核表达载体 pIRES ,并成功构建了稳定的幽门螺杆菌ureB和IL 2基因以减毒鼠伤寒沙门菌为载体的核酸疫苗 ,并且以Westernblot检测到特异性的相对分子质量 (Mr)为 6 6× 1 0 3的UreB蛋白     

幽门螺杆菌ureB及ureB-hspA融合基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达及小鼠的免疫应答

目的　构建H .pyloriureB单基因及ureB和hspA融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗候选株 ,并进行初步的免疫原性分析。方法　将H .pyloriureB单基因及ureB和hspA融合基因分别克隆入pTrc99A asd质粒的多克隆位点之内。挑取单菌落质粒鉴定后 ,分别将其电击经中间宿主X3730转入最终宿主X4 0 72 ,SDS PAGE和Westernblot检测蛋白表达。将疫苗候选株经口或鼻免疫BALB c小鼠。结果　疫苗候选株能够分别表达出相对分子质量 (Mr)为 6 4× 10 3的UreB蛋白及 77× 10 3的UreB HspA融合蛋白。在免疫BALB c小鼠的肠液和血清中可以分别检测到针对H .pylori的特异性分泌型IgA和IgG抗体。结论　构建了能够表达幽门螺杆菌UreB及UreB HspA融合蛋白的活菌疫苗候选株 ,为探索制备H .pylori口服活菌疫苗奠定了基础。     

Effect of antioxidants on the immune response of Helicobacter pylori

Antioxidants are substances capable of inhibiting oxidation. In chronic diseases, inflammatory response cells produce oxygen free radicals. Oxygen free radicals cause DNA damage, and this may lead to gene modifications that might be carcinogenic. Chronic Helicobacter pylori infection causes the production of DNA-damaging free radicals. In recent years, various groups have studied the effects of antioxidants, especially on H. pylori -associated gastric cancer. In most of the studies, it has been shown that H. pylori infection does affect the level of antioxidants measured in the gastric juice, but there are also controversial results. Recent experimental studies, both in vivo and in vitro, have shown that vitamin C and astaxanthin, a carotenoid, are not only free radical scavengers but also show antimicrobial activity against H. pylori. It has been shown that astaxanthin changes the immune response to H. pylori by shifting the Th1 response towards a Th2 T-cell response. Very few experimental studies support the epidemiologic studies, and further studies are needed to describe the effect and the mechanism of antioxidants in the H. pylori immune response.     

Helicobacter pylori and the innate immune system

Since its discovery, Helicobacter pylori surprises us by its ability for life-long chronic persistence, proliferation, and probably active adaptation in the unfavourable niche of the human stomach, without being eliminated by the defence systems of the human body. This minireview highlights recent developments about the interaction of H. pylori with the innate immune system, and makes a case that evasion and possibly suppression of innate immune responses play an important role for the active survival in its local mucosal environment.     

幽门螺杆菌相关抗原及宿主免疫应答的研究进展

幽门螺杆菌与多种胃肠道疾病诸如慢性胃炎,胃肠溃疡,胃腺瘤及胃癌等密切相关的结论已得到证实,预防和治疗幽门螺杆菌感染是控制其广泛传播的有效途径,此项工作虽早已开始,但至今未找到可行的方案.近来对幽门螺杆菌相关毒素的研究越来越多,这可作为研究幽门螺杆菌菌苗的重要依据;幽门螺杆菌诱发的宿主免疫应答以TH1反应为主,幽门螺杆菌感染者可出现系统和局部的抗体反应,这些抗体反应对机体不具保护作用且自身抗体对宿主上皮细胞还可能带来不良影响,阐明宿主免疫应答的机制对预防和治疗幽门螺杆菌感染具特殊意义.因此,本文主要介绍了脲素酶、空泡细胞毒素、cag相关基因蛋白,中性粒细胞蛋白等几种毒素及宿主免疫应答的研究现状,并对幽门螺杆菌的研究前景进行综述.     

Immune response to Helicobacter pylori and its association with the dynamics of chronic gastritis in the antrum and corpus

The aim of the study was to establish possible factors which play a role in progression of gastritis to atrophic gastritis in long-term follow-up among the Estonian population, to assess the association between the host immune response and different Helicobacter pylori antigens and autoantigens in relation to the histological parameters of gastritis in the antrum and corpus. ELISA and immunoblot were used for detection of IgG to H. pylori acid glycine-extracted cell surface proteins, CagA protein, and H. pylori HSP60. Anticanalicular autoantibodies (ACAB) in the serum were evaluated according to Faller et al. (1996). Apoptosis was evaluated using the TUNEL method. Study subjects were 1958 persons from an unselected Estonian population, and 70 persons from a sample from Saaremaa Island, who had been investigated over a period of 18 years. Seropositivity for CagA was a sign of gastritis activity [OR=14.8 (4.5-50.3)] and atrophy [OR=7.0 (2.1-23.1)] and might predict development of atrophy, particularly in the corpus [OR=7.1 (1.8-27.7)]. The prevalence of ACAB increased significantly with duration of H. pylori gastritis from 22% in 1985 to 46% in 1997 (p=0.004). Immune response to H. pylori HSP60 indicates chronic inflammation in the antrum (p=0.003). Apoptosis of gastric epithelial cells is largely dependent on grade of activity of gastritis, and, particularly in the antrum, on grade of H. pylori colonization (p=0.01; p=0.02), but is not associated with development of atrophy. Seropositivity for different H. pylori antigens (CagA, HSP 60) serves as a marker of different histological manifestations in the antrum and corpus mucosa.     

Th免疫反应在以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌疫苗免疫保护中的作用

目的：探讨以壳聚糖为佐剂的脚疫苗的免疫保护作用及其机理。方法：BALB／c小鼠随机分为7组：空白对照组、壳聚糖酸溶液组、壳聚糖颗粒组、却抗原组、脚抗原＋壳聚糖酸溶液组、却抗原＋壳聚糖颗粒组和脚抗原＋CT组，各组于第0、7、14和21天灌胃各免疫1次，末次免疫后4周给予SS1Hp菌攻击，隔日1次，共2次。在攻击前后分批处死小鼠，取胃黏膜检测坳和Th1、Th2细胞因子含量，同时检测血清中抗Hp IgG2a和IgG1含量。结果：①以壳聚糖为佐剂的坳疫苗的免疫保护率达60％，与以CT为佐剂的印疫苗的免疫保护率（58．33％）相似，显著高于单纯脚抗原组及其他不含Hp抗原组（P〈0．001～0．05）。②却攻击后胃黏膜内IFN-γ、IL-2和IL-12含量在含佐剂组显著高于无抗原和无佐剂组（P〈0．001～0．05）；③坳攻击后胃黏膜内IL-4含量在以壳聚糖颗粒为佐剂组显著高于以CT为佐剂组（P〈0．05），以壳聚糖溶液为佐剂组显著高于对照组、无佐剂组及佐剂中含CT组（P〈0．001～0．05）。结论：以壳聚糖为佐剂的坳疫苗对脚感染具有免疫保护作用，同时可促进Th1和Th2的混合免疫反应。