不同剂量STAg滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用

目的观察不同剂量可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫感染作用,确定STAg滴鼻免疫最佳剂量。方法BALB/c小鼠50只随机分为5组,实验组分别用5μg、10μg、20μg、30μg STAg/只滴鼻免疫小鼠2次,间隔2周,对照组用PBS滴鼻。末次免疫后第14d,用4×104个速殖子/只灌胃攻击全部小鼠,观察小鼠健康和死亡情况,记录体重。攻击后第30d检测粪便IgA和血清IgG,计数脾、脑组织内弓形虫速殖子,分离并计数小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)。结果20μg和30μg组小鼠存活率高于5μg、10μg及对照组。攻虫后对照组小鼠体重逐渐降低,而5μg组,10μg组(P<0.05),20μg组(P<0.05)和30μg组(P<0.05)小鼠体重仍呈增高趋势。20μg和30μg组脾、脑组织内虫荷(速殖子数)显著低于5μg、10μg组和对照组(P<0.05),实验组粪便IgA,血清IgG及IEL数量高于对照组。结论不同剂量STAg滴鼻免疫小鼠均可诱导抗弓形虫感染,20μg或30μgSTAg滴鼻免疫可诱导更有效的抗弓形虫感染保护作用     

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠的抗弓形虫感染保护作用

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)联合IFN-γ鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用。方法将6~7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只。分别用PBS 10μl、20μg TSo、500 U IFN-γ和20μg TSo+500 UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后第10 d,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。分别于攻击后第7、10、13、161、9 d处死小鼠,计数脑、肺、肝组织内弓形虫速殖子,观察其动态变化。结果TSo+IFN-γ鼻内免疫组可使受攻击小鼠脑、肺、肝组织内弓形虫速殖子数减少,攻击后第13和19 d TSo+IFN-γ组小鼠脑内速殖子数比PBS组分别减少63.92%和58.39%(P均<0.05)。结论TSo+IFN-γ鼻内免疫小鼠可产生有效的保护性免疫,可减少脑、肺、肝组织内弓形虫速殖子数。组织内速殖子计数可以作为抗弓形虫感染保护力的重要评价指标。     

经口灌胃感染弓形虫诱导的BALB/c小鼠肠道粘膜免疫应答

目的 研究BALB/c小鼠经口感染(灌胃)弓形虫速殖子后肠液IgA抗体分泌的动态变化及肠道粘膜组织诱导与效应部位T淋巴细胞亚群的变化,探讨肠道粘膜免疫应答机制.方法 将6～8周龄BALB/c小鼠100只随机分为对照组和感染组.感染组经口感染(灌胃)弓形虫RH株速殖子5×104个/只,对照组给予等量PBS.于感染后第2、4、6、8、10、13、16、19、22、25 d处死小鼠,每次5只.收集各时间点肠道冲洗液,用ELISA法测定肠液IgA水平;分离第2、4、6、8、10 d Peyer's Patches(PP)、肠系膜淋巴结(MLN)及小肠上皮内淋巴细胞(IEL),制备悬液并涂片,用免疫细胞化学方法测定CD4+、CD8+T细胞亚群水平.结果 在感染后第4、6、8、13 d实验组的肠液IgA抗体分泌显著高于对照组(P＜0.01).实验组PP结CD4+T细胞水平在6、8、10 d显著高于对照组(P＜0.05);CD8+T细胞水平与对照组无显著性差异,CD4+/CD8+比值在6、8、10 d显著升高(P＜0.05).肠系膜淋巴结的CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值各时间点均无显著变化.感染后第6、8、10 d,效应部位小肠上皮内淋巴细胞CD8+T细胞增高显著(P＜0.01)、CD4+/CD8+比值倒置(P＜0.05).结论 经口感染弓形虫BALB/c小鼠的肠道产生高水平的IgA抗体,作为局部首道屏障,发挥着重要的抗虫作用.诱导部位PP CD4+T细胞水平明显增高,诱导对弓形虫抗原的处理提呈作用;效应部位IEL CD8+T细胞亚群增殖明显,在清除虫体的过程中起主导作用.     

RNA原位杂交法检测灌胃接种弓形虫速殖子小鼠体内虫体的早期动态分布

目的观察经灌胃接种弓形虫RH株速殖子后,虫体在小鼠体内的早期动态分布。方法弓形虫RH株速殖子经灌胃接种BALB/c小鼠20只(2×104/只),用RNA原位杂交法观察感染后1、2、4、6和8d小鼠的肠系膜淋巴结(MLN)、肝、脾、肺和脑组织内速殖子的数量及分布趋势。同时设PBS空白对照组(5只)。结果感染后1d,在MLN、肝和脾组织内均检测到速殖子,分别于感染后4d和6d在肺和脑组织内检测到速殖子。感染后6～8d,各组织间虫荷差异均有统计学意义(P值均0.05),组织内虫荷依次为MLN肝脾肺脑,各组织内虫体数量呈时间依赖性。结论弓形虫RH株速殖子经灌胃接种后,首先侵入MLN、肝和脾,其次为肺,最后为脑,且虫体在MLN内增殖较快。     

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫脾淋巴细胞免疫应答

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)和IFN-γ鼻内免疫小鼠经口感染弓形虫速殖子后,脾T细胞亚群的动态变化。方法将6~7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只。分别用10μlPBS、20μgTSo、500UIFN-γ和20μgTSo 500UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。分别于攻击后第7、10、13、16、19天处死小鼠,制备脾淋巴细胞悬液并涂片,免疫细胞化学法检测脾CD4 、CD8 T细胞亚群。结果攻击后第16、19天TSo IFN-γ组脾CD4 T细胞比率较第10天升高(P<0.05);脾CD8 T细胞第10、13、16、19天呈现较高水平;CD4 /CD8 比值第10、13天出现倒置。结论TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠可激发系统免疫反应,提高其细胞免疫应答水平,增强脾CD8 T细胞的细胞毒作用,抵抗弓形虫感染。鼻黏膜免疫是一种安全有效的免疫接种途径。     

可溶性弓形虫速殖子抗原联合蜂胶和IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

目的比较蜂胶、IFN-γ佐剂以及两种佐剂混合鼻内免疫辅助STAg增强机体细胞免疫应答的水平,探讨两种佐剂联合应用的免疫效果。方法将5~6周龄雌性BALB/c小鼠60只随机分为4组:20μg STAg组,20μg STAg+40μg蜂胶组,20μg STAg+1 000 U IFN-γ组和20μg STAg+40μg蜂胶+1 000 U IFN-γ组。将抗原和佐剂溶于20μl PBS中,双侧鼻孔(10μl/鼻孔)滴鼻免疫。免疫2次,间隔14 d,末次免疫后第10 d用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。逐日观察小鼠存活情况。攻击后第43 d处死全部存活小鼠,免疫细胞化学(ICC)法检测小鼠PP结、IEL和脾T淋巴细胞亚群水平。结果与STAg组相比,各佐剂组小鼠T淋巴细胞亚群比例有升高的趋势,其中IFN-γ、蜂胶+IFN-γ佐剂组小鼠PP结CD4+、CD8+T淋巴细胞,IEL、脾CD8+T淋巴细胞数显著高于STAg组,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值倒置。结论在抗弓形虫感染中,IFN-γ的佐剂作用优于蜂胶,有效激发机体细胞免疫应答,可用作鼻内免疫抗弓形虫感染的粘膜佐剂。IFN-γ+蜂胶佐剂鼻内免疫效果优于单独蜂胶、IFN-γ佐剂,应用联合佐剂是抗弓形虫感染免疫的一个新思路。     

经口感染弓形虫诱导的小鼠肠道粘膜T细胞亚群变化

目的 研究经口感染弓形虫速殖子小鼠肠道粘膜组织诱导部位与效应部位T细胞亚群的变化,探讨肠道粘膜免疫应答机制。 方法 将6~7周龄BALB／c小鼠100只随机分为对照组和感染组。感染组灌胃接种RH株弓形虫速殖子5×104个／只,对照组给予等体积PBS。于感染后第2、4、6、8、10 d分别处死小鼠,分离Peyer's patches(PP结)、肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞、小肠上皮内淋巴细胞(IEL),用免疫细胞化学法检测CD4 、CD8 T细胞亚群。 结果感染组小鼠PP结CD4 T细胞有随感染天数增加呈升高趋势,第6、8、10 d显著高于对照组(P<0.01);CD8 T细胞亦有增高趋势,但与对照组相比差异无显著性(P>0.05);CD4 ／CD8 比值第6 d起增高(P<0.05),第8 d最大(P<0.01),第10d回落(P<0.05)。MLN中T细胞亚群有较弱增高趋势,无统计学意义(P>0.05)。IEL CD4 、CD8 T细胞在第6、8、10 d均增高,其中CD8 T细胞增高显著(P<0.01);CD4 ／CD8 比值第6 d开始下降,两组间差异有显著性(P<0.05)。 结论 诱导部位PP结CD4 T细胞明显增高,诱导对弓形虫抗原的处理、提呈作用;效应部位IELCD8 T细胞增殖明显,在清除虫体的过程中起主导作用。     

经口感染弓形虫诱导小鼠黏膜免疫动物模型的建立

目的建立经口感染弓形虫速殖子诱导黏膜免疫的动物模型。方法BALB/c小鼠分别灌胃接种5×103、5×104、5×105、5×106个RH株速殖子,观察小鼠的体况、病理变化;检测肠道分泌型IgA(SIgA)和Peyer’spatches(PP)淋巴细胞及小肠上皮内淋巴细胞(IEL)T细胞亚群的变化。结果经口接种5×104个弓形虫RH株速殖子可使小鼠出现临床症状和病理改变;SIgA水平升高;黏膜诱导部位的CD4 T亚群及效应部位的CD8 T亚群水平升高。结论5×104个弓形虫RH株速殖子灌胃接种小鼠可以诱导机体黏膜免疫应答。     

弓形虫主要表膜抗原SAG2 DNA疫苗的免疫保护作用研究

目的观察弓形虫pVAX1-SAG2真核重组质粒的免疫保护作用,为弓形虫病的免疫预防提供理论及实验依据。方法大量制备重组质粒,免疫小鼠,3周后同量加强免疫1次,5周后无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞,用MTT法测定淋巴细胞转化率;用免疫荧光法测定CD4+、CD8+细胞。用弓形虫RH株速殖子经皮下注射攻击感染,每只鼠接种0.1 ml(约含1000个虫体),观察小鼠存活情况。结果对小鼠的脾脏T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+进行分析,与对照组比较,免疫组小鼠CD4+细胞显著增多(P<0.05);而CD8+细胞数各组之间差异无显著性(P>0.05);淋巴细胞转化率各组间差异无显著性(P>0.05);攻击感染后,pVAX1-SAG2免疫组小鼠平均存活(7.8±1.8)d,与对照组比较显著延长(P<0.05)。结论弓形虫pVAX1-SAG2真核重组质粒能在组织内表达,并诱导小鼠产生细胞免疫反应。     

RNA 原位杂交法检测弓形虫对BALB/c小鼠睾丸及附睾侵入的实验研究

目的 探讨刚地弓形虫能否通过血睾屏障侵入小鼠的睾丸及附睾组织.方法 选用9～10周龄雄性BALB/c小鼠20只,随机分为感染组(16只)和正常对照组(4只),其中感染组小鼠每只腹腔注射含2.5×103 个弓形虫速殖子的PBS 0.2 ml,建立弓形虫致小鼠感染的动物模型,对照组给予等量的无菌PBS.分别于攻击感染后第1、3、5、7天各处死4只感染组小鼠、1只正常对照组小鼠,取睾丸及附睾,应用RNA原位杂交法检测睾丸及附睾组织中的弓形虫.结果 对照组及感染后第1天的感染组小鼠睾丸及附睾中未检出速殖子;实验组在感染后第3天小鼠睾丸及附睾内偶尔可见弓形虫速殖子,以后随着感染时间的延长睾丸及附睾中的弓形虫速殖子数量逐渐增多,且不同感染时间点同一组织内的弓形虫速殖子的数目差别具有显著的统计学意义.结论 刚地弓形虫可通过血睾屏障侵入小鼠的睾丸及附睾组织中.