日本血吸虫双价DNA疫苗pVIVO2-Sj14-Sj23免疫方案的研究

目的研究双价DNA疫苗pVIVO2-Sj14-Sj23在不同免疫剂量、免疫次数、免疫有效时间及不同免疫途径的最佳免疫方案。方法构建和制备双价DNA疫苗pVIVO2-Sj14-Sj23;110只雄性BALB/c小鼠随机分成11组,每组10只,按照四因素三水平分成2个对照组和9个实验组。各组统一在末次免疫后30d每鼠感染(40±2)条日本血吸虫尾蚴,感染后45d剖杀,计数成虫虫荷。结果双价DNA疫苗9个实验组获得40.14%～62.68%的减虫率。通过SPSS12.0进行正交设计的统计分析:F值0.05。免疫剂量,免疫次数,免疫途径和免疫有效时间几个因素间差异无统计学意义。结论实验结果提示该疫苗的较好免疫方案为:50μg/只,免疫2次,采取皮内注射,免疫有效时间至少为12周。     

日本血吸虫双价DNA疫苗的构建及其免疫保护性研究

目的 研究防治日本血吸虫病的双价DNA疫苗的免疫保护效果。 方法 构建共表达双价DNA疫苗pVI-VO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP，并用BamHI/EcoRI和BspHI/AvRⅡ进行双酶切和测序鉴定。通过免疫荧光法（IFAT）检测质粒在BALB/c小鼠骨骼肌细胞的表达。70只小鼠随机分为7组，每组10只，分别肌肉注射生理盐水、pVIVO2-mcs、pVIVO2-mcs-Sj23、pVIVO2-mcs-SjFABP、pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP、pVIVO2-mcs-SjFABP-Sj23和pVIVO2-mcs-Sj23-SjFABP+多糖佐剂，免疫1次。免疫后4周用40±2条尾蚴攻击感染，感染后45 d剖杀，计数各组小鼠成虫数和肝虫卵数。 结果 双酶切反应和测序分析证明成功构建双价质粒DNA。IFAT结果提示双价质粒DNA可在小鼠骨骼肌细胞胞膜和胞浆中表达。双价DNA疫苗免疫小鼠后获得41.2%～53.8%的减虫率和47.0%～53.8%肝减卵率；pVIVO2-Sj23-SjFABP+多糖佐剂组获得68.9%的减虫率和84.0%肝减卵率，保护力显著高于单价疫苗和双价疫苗（P＜0.05﹚。结论 共表达的双价DNA疫苗在小鼠体内可产生较好的抗血吸虫感染的免疫保护效果。多糖佐剂组保护效果明显高于单价和双价疫苗组。     

不同方式构建的日本血吸虫双价DNA疫苗保护力的比较

目的寻求高效抗血吸虫感染的双价核酸疫苗。方法以共表达和融合表达两种方式构建两种日本血吸虫双价核酸疫苗pVIVO2-mcs-Sj23/SjFABP、pVIVO2-mcs-Sj23·SjFABP,以鸡尾酒式混合获得混合双价疫苗(pVIVO2-mcs-Sj23/SjFABP与pVIVO2-mcs-Sj23·SjFABP)。大量制备质粒,50只BALB/c小鼠随机分为5组:混合疫苗组、双价共表达疫苗pVIVO2-mcs-Sj23/SjFABP组、双价融合表达疫苗pVIVO2-mcs-Sj23·SjFABP组、空质粒对照组及生理盐水对照组。免疫后4周攻击感染,感染后45天剖杀,计数各组小鼠成虫数、肝虫卵数和免疫保力超过50%实验组的虫卵肉芽肿面积。结果与对照组比较,实验组小鼠成虫数、虫卯数和虫卵肉芽肿面积有显著性差异(P<0.05);融合表达组和共表达组无显著性差异(P>0.05);混合DNA疫苗组免疫保护力优于单一双价组;与混合DNA疫苗组比较,pVIVO2-mcs-Sj23·SjFABP组的肝脏肉芽肿面积有显著性减小(P<0.05)。结论血吸虫混合双价DNA疫苗诱导小鼠对血吸虫的保护力优于单一双价DNA疫苗。     

日本血吸虫Sj23DNA突变体疫苗的构建与鉴定

目的对日本血吸虫Sj23DNA进行缺失突变,构建Sj23DNA突变体疫苗,为寻求更佳免疫效果的疫苗奠定基础。方法利用重叠PCR技术将Sj23DNA上与ME491同源的部分碱基缺失,获得Sj23DNA的突变体,将其克隆入真核表达载体pcDNA3的多克隆位点上,构建重组质粒pcD-NA3-Sj23突变体,进行酶切和测序鉴定,并用CLUSTALX和primerpremier软件将测序的结果与Sj23DNA序列进行分析。结果序列分析显示pcDNA3-Sj23突变体缺失序列与原设计一致,双酶切pcDNA3-Sj23突变体获得预期大小的DNA片段。结论成功构建了缺失与ME491同源部分碱基的质粒pcDNA3-Sj23突变体。     

日本血吸虫Mr 23 000抗原与白细 胞介素-12多价DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

目的 研究能共同表达日本血吸虫Mr 23 000膜抗原（Sj23）与白细胞介素-12(IL-12)的多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23诱导BALB/c小鼠免疫保护作用。 方法 　在多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23和PV-IL12的基础上，构建空白质粒PV和仅表达Sj23的质粒PV-Sj23。50只BALB/c小鼠分为5组，每组10只，分别注射多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23、表达Sj23的质粒PV-Sj23、表达IL-12质粒PV-IL12、空白质粒PV和生理盐水，100 μg/只，免疫1次。4周后每只鼠攻击感染40±2条尾蚴，42 d后剖杀，计数成虫及肝内虫卵数。 结果 成功地构建了空白质粒PV和只表达Sj23的质粒PV-Sj23及多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23。PV-IL12-Sj23组和PV-Sj23组分别获得了45.5%和27.2%的减虫率，两组比较差异有显著性（P<0.05），减卵率分别为58.4%和33.9%。 结论 多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23可诱导BALB/c小鼠产生较显著的抗血吸虫免疫保护作用，且保护性效果比单价DNA疫苗PV-Sj23好。     

白细胞介素-12在日本血吸虫脂肪酸结合蛋白诱导小鼠保护性免疫力中的佐剂作用

目的 研究白细胞介素-12（IL-12）对日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sj14FABP）DNA疫苗的免疫增强效果。方法　 分别构建pVIVO2-Sj14FABP 和pVIVO2-IL12-Sj14FABP疫苗，鉴定构建成功后免疫小鼠。48只雄性BALB/c小鼠随机分为A、B、C和D等4组, 分别用0.9% NaCl（对照组）、pVIVO2、pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP肌注免疫1次（100 μg/只）。免疫后30 d各组小鼠感染40±2条尾蚴, 感染后45 d剖杀, 计数成虫及肝内虫卵；同时用ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体水平，用双夹心ELISA法检测脾淋巴细胞经伴刀豆球蛋白A（ConA）和可溶性虫卵抗原（SEA）刺激后培养上清中白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）含量。 结果 经PCR和酶切鉴定，成功构建pVIVO2-Sj14FABP和pVIVO2-IL12-Sj14FABP重组质粒；C、D组免疫后分别获得24.1%和39.4%的减虫率、27.2%和32.8%的减卵率；细胞因子检测结果，D组经ConA和SEA诱生的IL-2和IFN-γ水平显著增高（P　<　0.01），而IL-4水平显著降低，差异有统计学意义（P　<　0.01）；免疫后30 　d小鼠血清IgG水平无明显升高，各实验组间差异也无统计学意义(P　>0.05)。 结论 Sj14FABP DNA疫苗可诱导BALB/c小鼠产生部分抗血吸虫感染保护作用, 细胞因子IL-12能够诱导机体免疫反应向Th1型优势分化，并增强血吸虫病DNA疫苗免疫保护性效果。     

日本血吸虫Sj23DNA疫苗的增效研究

目的 探讨缺失肿瘤转移有关基因ME491同源序列的日本血吸虫Mr23 000膜蛋白基因（Sj23DNA）突变体疫苗的免疫效果。 方法 将Sj23DNA中与人黑素瘤细胞膜上的ME491同源序列进行基因缺失突变，再将突变基因转染真核细胞人胚肾HEK293细胞，通过间接荧光抗体试验（IFAT）检测其表达情况。将pcDNA3-Sj23突变体经股四头肌注射免疫小鼠（100 μg/只），免疫后4周取注射部位肌肉作冰冻切片，IFAT检测目的基因的表达。40只BALB/c小鼠随机分成4组（每组10只），分别经股四头肌注射pcDNA3-Sj23突变体、pcDNA3-Sj23、空白质粒pcDNA3（均100 μg/只）和生理盐水（30 μl/只）免疫1次。免疫后4周用尾蚴攻击感染（40±2条/只）。第42天剖杀，肠系膜静脉灌注法及挤压法计数成虫，取肝脏计算每克肝组织虫卵数（EPG）。以减虫率和减卵率评价其免疫保护力。 结果 pcDNA3-Sj23突变体疫苗可在真核细胞HEK293中瞬时表达。pcDNA3-Sj23突变体在小鼠注射部位骨骼肌细胞上出现较强荧光，空白对照组未见特异性荧光。pcDNA3-Sj23突变体获得40.3%减虫率和42.8%减卵率，pcDNA3-Sj23获得33.1%减虫率和28.9%减卵率。两组差异均有统计学意义（P值均<0.05）。 结论 与pcDNA3-Sj23相比，缺失ME491同源序列的cDNA3-Sj23突变体疫苗能诱导BALB/c小鼠产生更好的免疫保护效果。     

日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的免疫保护作用

目的 探讨日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)-SjP14)对小鼠血吸虫感染的免疫保护作用.方法 制备无内毒素pcDNA3.1 (+)-SjP14及纳米微球DNA疫苗,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-Sj P14组及纳米微球-DNA疫苗组.各组小鼠分别肌肉注射生理盐水和pcDNA3.1(+)-Sj P14、纳米微球DNA疫苗100μg/鼠·次,每2周免疫一次,共3次.末次免疫后2周,尾蚴攻击,6w后处死小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率.结果 pcDNA3.1(+)-Sj P14p核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6％和61.6％;纳米微球-DNA疫苗免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2％和73.5％.结论 pcDNA3.1(+)-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用,pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球复合物疫苗免疫能增强小鼠对血吸虫感染的免疫保护作用.     

编码完整膜蛋白Sj23质粒DNA核酸疫苗免疫小鼠及其保护力的研究

目的 探讨用编码完整膜蛋白(Sj23)核酸疫苗诱导BALB/c小鼠抗日本血吸虫病保护力的作用.方法 大量制备DNA疫苗,BALB/c小鼠被分成3组,肌肉内注射进行免疫.免疫小鼠3次,间隔2周,末次免疫后2周,用ELISA法和Western Blotting法检测免疫鼠血清特异性抗体效价.结果 编码Sj2-pcDNA质粒免疫的小鼠产生了针对Sj23的特异性IgG,而peDNA对照组免疫小鼠血清则无此作用.Sj23-pcDNA疫苗对日本血吸虫攻击感染有一定的保护力.结论 Sj23-pcDNA疫苗能够诱导小鼠产生抗日本血吸虫攻击感染的保护力.     

Genetic immunization of mice with DNA encoding the 23 kDa transmembrane surface protein of Schistosoma japonicum (Sj23) induces antigen-specific immunoglobulin G antibodies

The 23 kDa transmembrane surface protein of schistosomes is of recognized interest in studies of immune responsiveness in schistosomiasis. To examine the immunogenicity of the 23 kDa antigen of Schistosoma japonicum, Sj23, when delivered by genetic immunization, mice were immunized using a DNA construct containing the Sj23 cDNA under the control of a CMV promotor. Serological analysis of peripheral blood from immunized mice demonstrated that this construct was able to induce the production of antigen-specific IgG antibodies that recognized a schistosome antigen of 23 kDa in Western blots. Despite inducing antigen-specific antibodies, the Sj23 DNA vaccine was unable to confer protection in immunized mice subjected to challenge with S.japonicum cercariae. Appropriate engineering of the unique structure of the Sj23 kDa transmembrane protein of schistosomes may provide a novel vehicle for expressing foreign epitopes from other infectious agents or, possibly, cancer antigens, anchored to the surface of transfected cells.     

Sj26和Sj23基因转染树突状细胞联合抗血吸虫感染的研究

目的探讨Sj26和Sj23基因转染树突状细胞(DC)联合抗日本血吸虫感染保护性免疫机制。方法BALB/c小鼠耳廓分别注射Sj26和Sj23基因转染DC(A组)、Sj26基因转染DC(B组)、Sj23基因转染DC(C组)、pcDNA3转染DC(D组)、未处理DC(E组)和RPMI-1640(F组),免疫3次,间隔2周,末次免疫后2周,每鼠经皮肤感染40条日本血吸虫尾蚴。ELISA法检测血清特异性IgG抗体、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)水平,双夹心ELISA法检测脾淋巴细胞经ConA和可溶性虫卵抗原(SEA)刺激后培养上清中IFN-γ和IL-4水平,噻唑蓝(MTT)法检测脾淋巴细胞增殖情况。结果末次免疫后第2周,A组小鼠血清IgG抗体水平显著升高(P<0.001)。血清IL-4的水平,各组免疫前、后无明显变化。血清IFN-γ水平,A组小鼠免疫后明显升高(P<0.01)。经ConA和SEA刺激后,A组小鼠脾淋巴细胞诱生的IFN-γ水平显著增高,而IL-4水平显著降低(与F组比较,P<0.001)。A组小鼠脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激后的刺激指数均高于其他各组(与F组比较,P<0.001)。结论体液免疫和细胞免疫共同参与了Sj26和Sj23基因转染DC诱导的保护性免疫作用,其中Th1型免疫应答在抗日本血吸虫感染的保护性免疫中起主要作用。     

植物多糖对日本血吸虫DNA疫苗pVIVO2-IL12-Sj23增效作用的研究

目的 以提取天然香菇菌多糖和茶叶多糖混合物为佐剂，探讨混合型植物多糖对血吸虫疫苗的保护性免疫增效作用。 方法 构建日本血吸虫重组质粒pVIVO2-IL12?鄄Sj23。BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只。A组每鼠股四头肌注射生理盐水100 μl 为对照，B组每鼠注射pVIVO2-IL12-Sj23 100 μg，C组每鼠注射pVIVO2-IL12-Sj23 100 μg加等量多糖混合物。小鼠接种后第4 周以日本血吸虫尾蚴40±2条经皮肤攻击感染，感染后6周剖杀，计算减虫率及每克肝组织减卵率，同时用ELISA测定血清中特异性抗体水平。 结果 C组减虫率和每克肝组织减卵率分别为64.3%和79.9%，B组则分别为45.5%和58.3%， B、C两组的差异有统计学意义（P＜0.05）。B、C两组IgG水平均较A组显著升高（P＜0.05），但B、C两组IgG抗体水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论 以天然香菇菌多糖和茶叶多糖混合物为佐剂，对日本血吸虫重组质粒pVIVO2-IL12-Sj23的免疫效果有一定的增效作用。     

日本血吸虫混合DNA疫苗pBK-CMV-Sj26/Sj32诱导小鼠的免疫应答

目的　观察含日本血吸虫候选疫苗分子谷胱甘肽S -转移酶 (Sj2 6 )和天冬酰胺肽链酶 (Sj32 )的真核载体 pBK-CMV -Sj2 6 /Sj32诱导小鼠的免疫应答情况。 方法　将质粒按 5 0 μg/只在 0w ,3w ,5w免疫小鼠股四头肌 ,第一次免疫后取小鼠脾细胞作T淋巴细胞转化实验 ;在 0w、3w和 6w经小鼠尾静脉取血 ,ELISA检测血清中抗体效价及阳性反应率。结果　淋巴细胞转化实验示血吸虫成虫抗原能特异性刺激免疫鼠脾细胞 ;第一次免疫后特异性抗体效价开始升高。抗体最高效价为 1∶2 0 ,3次免疫后有 91.7%小鼠血清呈阳性反应。结论　真核载体 pBK -CMV -Sj2 6 /Sj32可诱导小鼠体液及细胞免疫应答     

树突状细胞DNA多价疫苗抗日本血吸虫感染作用机制的研究

摘 要：目的 探讨树突状细胞（DC）DNA混合多价疫苗抗日本血吸虫感染保护性免疫作用机制。方法 BALB/c小鼠耳廓分别注射Sj26、Sj23和Sj14基因转染DC（A组）、Sj26基因转染DC（B组）、Sj23基因转染DC（C组）、Sj14基因转染DC（D组）、pcDNA3转染DC（E组）、未处理DC（F组）和RPMI-1640（G组）,共免疫3次,间隔2周,末次免疫后第2周,每鼠经皮肤感染40条日本血吸虫尾蚴。ELISA法检测血清特异性IgG抗体、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）水平,双夹心ELISA法检测脾淋巴细胞经ConA和可溶性虫卵抗原（SEA）刺激后培养上清中IFN-γ和IL-4水平,噻唑蓝（MTT）法检测脾淋巴细胞的增殖。结果 A组小鼠末次免疫后第2周血清特异性IgG抗体水平显著升高（与G组比较,P<0.001）。A组小鼠免疫后血清IFN-γ水平明显升高(P<0.01),而血清IL-4的水平,各组小鼠免疫前、后无明显变化。A组小鼠脾淋巴细胞经ConA和SEA刺激后诱生的IFN-γ水平显著增高,而IL-4水平显著降低(与G组比较,P<0.001)。A组小鼠脾淋巴细胞的刺激指数高于其他各组（与G组比较,P<0.001）。结论 体液免疫和细胞免疫共同参与了DC DNA混合多价疫苗诱导的保护性免疫作用,其中Th1型免疫应答在抗日本血吸虫感染的保护性免疫中起主要作用。 关键词：日本血吸虫;树突状细胞;DNA疫苗;保护性免疫     

日本血吸虫新基因Sj Dad1的DNA免疫动物保护性实验研究

目的　观察日本血吸虫未知基因SjDad1的DNA免疫保护动物实验效果 ,探讨其作为疫苗候选分子的可能性。方法　构建SjDad1的真核表达载体 pEGFP -N3 -SjDad1,两次质粒DNA免疫BALB/c小鼠后给予小鼠日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,设置生理盐水对照组 (NS)和pEGFP -N3 对照组 ,攻击感染后 4 2天处死小鼠 ,计算减虫率和减卵率。结果　双酶切和PCR反应以及测序结果证实重组真核表达载体 pEGFP -N3 -SjDad1构建成功 ,DNA免疫动物的保护实验证明 pEGFP -N3 -SjDad1与生理盐水组相比对小鼠没有显著的减虫作用 (P >0 0 5 ) ,减卵效果具有显著性意义 (P <0 0 1) ,减卵率是6 5 74 %。结论　日本血吸虫 pEGFP -N3 -SjDad1有抗血吸虫生殖作用 ,具有疫苗研究开发价值。     

日本血吸虫混合DNA疫苗pBK-CMV-Sj26/Sj32诱导小鼠的免疫应答

目的　观察含日本血吸虫候选疫苗分子谷胱甘肽S -转移酶 (Sj2 6 )和天冬酰胺肽链酶 (Sj32 )的真核载体 pBK-CMV -Sj2 6 /Sj32诱导小鼠的免疫应答情况。 方法　将质粒按 5 0 μg/只在 0w ,3w ,5w免疫小鼠股四头肌 ,第一次免疫后取小鼠脾细胞作T淋巴细胞转化实验 ;在 0w、3w和 6w经小鼠尾静脉取血 ,ELISA检测血清中抗体效价及阳性反应率。结果　淋巴细胞转化实验示血吸虫成虫抗原能特异性刺激免疫鼠脾细胞 ;第一次免疫后特异性抗体效价开始升高。抗体最高效价为 1∶2 0 ,3次免疫后有 91.7%小鼠血清呈阳性反应。结论　真核载体 pBK -CMV -Sj2 6 /Sj32可诱导小鼠体液及细胞免疫应答     

Immunogenicity and immunolocalization of the 22.6 kDa antigen of Schistosoma japonicum

The 22.6 kDa tegumental-associated antigens of Schistosoma mansoni (Sm22.6) and Schistosoma japonicum (Sj22.6) are of recognized interest in schistosomiasis vaccine development, although no direct vaccination/challenge experiments using either Sm22.6 or Sj22.6 had been previously described. We report that Escherichia coli-expressed reSj22.6 failed to protect mice or water buffaloes against subsequent challenge with S. japonicum cercariae. This was despite the fact that specific IgG (buffaloes) and IgG and IgE (CBA mice) antibodies were generated against the 22.6 kDa molecule, observations consistent with some of our earlier findings. We could find no evidence from immunolocalization studies that Sj22.6 is expressed or exposed on the surface of the adult parasite since it appears to be restricted to the apical cytoplasm of the tegument and is not associated with the apical or basal membrane or any membrane-bound structures in the apical cytoplasm. Nevertheless, Sj22.6 must be released to the immune system during the course of infection because specific anti-Sj22.6 IgG antibodies were present in the sera of nonvaccinated but challenged mice. We conclude that it may be necessary to produce reSj22.6 in a more relevant expression system, such as baculovirus, to further establish its vaccine potential and that detailed immunochemical and immunolocalization studies of early developmental stages may be necessary to determine how Sj22.6 is released or shed in S. japonicum infections.