大鼠肺泡巨噬细胞原代培养技术的改良措施

目的改良原代肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage,AM）培养技术,提高AM培养效果。方法SD大鼠,在体支气管灌洗肺获取AM,通过预先注射空气、14号注射器针头回收灌洗液、低速离心、种板前多次吹打等改良措施分离和培养AM。倒置显微镜连续观察AM的形态变化,台盼蓝拒染实验鉴定AM存活率,瑞氏-姬姆萨染色鉴定AM纯度。结果AM体外培养后40 min即见细胞贴壁;2～3天时,细胞形态多样,呈圆形、不规则形、梭形等形态,胞体变大,胞质丰富。台盼蓝拒染实验示AM存活率≥95%,瑞氏-姬姆萨染色示AM纯度≥95%。结论本实验改良了原代AM培养的技术方法,提高了原代AM培养效果。     

猪肝细胞的Gerlach分离法

目的 :探讨猪肝细胞分离收获率、存活率。方法 :取本地杂种小猪作为肝细胞供体 ,采用Gerlach五步胶原酶灌流法分离猪肝细胞 ,血细胞计数板计数细胞产量 ,TrypanBlue拒染法计算细胞活率。结果 :每只猪肝平均可获得 (12 .2 2± 1.5 7)× 10 9个肝细胞 ,平均活力为 95 .4 %± 2 .4 1%。结论 :采用Gerlach五步胶原酶灌流法分离猪肝细胞 ,获得较高产量和活力的游离肝细胞     

脂质体介导Bcl-2反义寡核苷酸对胆管癌细胞株QBC939的作用

目的：观察Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胆管癌QBC939细胞的作用及对Bcl-2蛋白表达的影响。方法：脂质体LipofectamineTM2000介导Bcl-2 ASODN转染QBC939细胞,应用台盼篮拒染实验检测细胞存活率、克隆形成实验检测克隆形成率、Western blot检测Bcl-2蛋白表达。结果：Bcl-2 ASODN转染后Bcl-2蛋白免疫印迹条带光密度显著低于对照组（P<0.01）;台盼篮拒染实验和克隆形成实验均显示Bcl-2 ASODN可以部分抑制QBC939细胞增殖,经ASODN作用,细胞的存活率和克隆形成率均显著低于对照组（P<0.05）。结论：Bcl-2 ASODN通过封闭人胆管癌QBC939细胞bcl-2基因表达抑制人胆管癌QBC939细胞的增殖。     

当归多糖对脐血造血细胞的抗冷冻损伤作用

目的：探讨当归多糖（APS）对脐血造血细胞的抗冷冻损伤作用.方法：采用细胞计数法比较羟乙基淀粉（HES）、明胶、淋巴细胞分离液（Ficoll）分离脐血单个核细胞（MNC）的回收率.应用细胞计数法、台盼蓝拒染法、集落形成实验和流式细胞术,检测冻存1,3,6mo脐血MNC的生物学活性,将脐血MNC与不同浓度APS共培养24h后冻存,1mo后复苏,观察APS对脐血MNC抗冷冻损伤的作用.结果：HES法、明胶法的MNC回收率均大于85%,显著高于Ficoll法（50.00±4.00）%（P〈0.05）;冻存1,3,6mo组MNC,CFU-Mix,CD34＋细胞回收率及台盼蓝拒染率差异均无显著性,且脐血MNC的损伤与冻存时间不相关.APS50,100,200,400mg/L不同浓度APS组MNC,CFU-Mix回收率和台盼蓝拒染率除APS400mg/L组下降外,其余各组明显上升（P〈0.05）;各组组间CD34＋细胞回收率差异无显著性.结论：APS可有效提高脐血造血细胞的抗冷冻损伤能力.     

大鼠肝星状细胞的分离、培养与鉴定

目的:改进大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,提高其分离质量。方法:取成年雄性Wistar大鼠,用链蛋白酶、胶原酶体内门静脉灌注消化大鼠肝脏细胞,经Nycodenz密度梯度离心分离肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力,Desmin免疫细胞化学染色鉴定细胞纯度。结果:肝星状细胞得率为2.8×107/肝。肝星状细胞存活率在90%以上。Desmin阳性细胞原代培养达90%以上,传代培养达95%以上。结论:改良大鼠肝星状细胞的分离、培养方法,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学性质

目的：建立人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分离培养方法,观察细胞形态,探讨BM-MSCs生物学特征。 方法：从人骨髓中利用Percoll分离有核细胞,培养于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中,台盼蓝拒染法测定细胞增殖状态。应用流式细胞仪测定细胞周期及细胞表面抗原特征。 结果;BM-MSCs具有纤维样细胞形态特征,独特的表型,即CD29、CD44、CD166和HLA-ABC阳性,CD34、CD45和HLA-DR阴性;细胞周期分析显示：12.8%处于S期,76.4%处于G₀/G₁期;细胞生长倍增时间为2~3 d。 结论：BM-MSC_S是一群均一的单克隆细胞,具有独特的增殖特征及表面标记。     

100例次外周血干细胞低温冷冻保存效果分析

目的：探讨血细胞健康机分离的外周血造血干细胞经程序降温冷冻保存，复温后ＮＣ、ＭＮＣ、台盼兰拒染的回收效果。方法；应用ＣＳ－３０００ＰＬＵＳ血细胞分离机时５２例成人、儿童急性、非急性淋巴细胞性白血病、非何杰金氏淋巴瘤等患者进行了１００例次分离，采集的外周血造血干细胞悬液用二步降温法进行程序降温冷冻保存。结果：在液氮中保存６－７８天的外周血经４０－４５℃水浴中快速复温ＮＣ、ＭＮＣ、台盼兰拒染回率分别为     

蟾蜍灵诱导人急性淋巴白血病细胞凋亡的实验研究

目的研究蟾蜍灵对人急性淋巴白血病(CEM)细胞的作用。方法台盼蓝拒染法观察蟾蜍灵对细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测蟾蜍灵作用后细胞凋亡情况。结果10~80nmol/L蟾蜍灵于24h开始明显抑制CEM细胞生长(P<0.01)。24,48和72h抑制细胞增殖50%的药物浓度分别为15.13,9.59和6.57nmol/L;20nmol/L,40nmol/L蟾蜍灵作用24h后出现典型的细胞凋亡形态学改变;20nmol/L蟾蜍灵处理12,24和48h凋亡细胞百分率分别为2.46%、17.92%和66.26%;40nmol/L蟾蜍灵处理12,24和48h凋亡细胞百分率分别为5.19%、32.71%和80%以上;凋亡细胞百分率呈剂量和时间依赖性。结论蟾蜍灵以时间、剂量依赖方式抑制CEM细胞生长、诱导凋亡。     

-80℃条件下自体造血干细胞保存时间的探讨

目的 观察在-80℃条件下长期保存自体造血干细胞，对细胞数量及活性的影响，确定一个合适的保存期限。方法 采用常规计数法计数单个核细胞，台盼蓝拒染法计数存活细胞，甲基纤维素法观察CFU—GM集落生长情况。结果 -80℃低温冰箱中保存造血干细胞1—4年，单个核细胞的回收率分别为85％、79％、64％、58％。台盼蓝拒染细胞的回收率分别为89％、78％、71％、35％。CFU—GM集落生长的回收率分别为65％、50％、0％、0％。结论 -80℃条件下保存自体造血干细胞的时间最好不超过2年。     

去甲斑蝥素诱导肝癌细胞凋亡的实验观察

目的 观察去甲斑蝥素(NCTD)诱导肝癌细胞凋亡的分子学机制,为合理应用NCTD治疗肝细胞肝癌提供理论基础.方法 对肝癌细胞株SMMC-7721,BEL-7402进行体外培养,应用不同浓度的NCTD(3、10、30μg/ml)处理肝癌细胞,采用MTT方法检测细胞生存率,锥虫蓝拒染法检测细胞的死亡率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,Western印迹检测半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(caspase)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白,以及Bcl-2家族蛋白的表达.结果 MTT检测显示NCTD处理24、48和72 h后SMMC-7721细胞IC50分别为12、6和1.6μg/ml,BEL-7402细胞IC50分别为10、4和2 μg/ml;锥虫蓝拒染法结果显示,浓度为3、10、30 μg/ml的NCTD处理24 h后,SMMC-7721细胞的死细胞率分别为16.89%、46.16%、72.13%,均显著高于未处理对照组的死细胞率3.34%(P＜0.01);BEL-7402细胞的死细胞率分别为19.59%、50.10%、90.31%,均显著高于未处理对照组的死细胞率2.88%(P＜0.01).流式细胞仪检测显示,NCTD 10 μg/ml处理12 h,SMMC-7721细胞凋亡率达到27%,较未处理对照组(7%)升高20%,BEL-7402细胞凋亡率达到30%,较未处理对照组(8%)升高22%;Western印迹结果显示,NCTD 10μg/ml处理8、14和24 h后,在两株肝癌细胞均检测到caspase-9,-3活化,PARP蛋白裂解,以及Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1蛋白的表达下调.结论 结果提示NCTD具有较强的抑制肝癌细胞生存和诱导肝癌细胞凋亡作用.NCTD的抗肝癌作用机理可能是通过诱导多个Bcl-2抑凋亡家族蛋白表达下调,激活内源性线粒体凋亡通路,诱导肝癌细胞发生凋亡.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定及BrdU标记的体外研究

目的：拟在体外建立一种分离纯化、培养扩增、标记兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。方法：密度梯度离心和贴壁培养相结合,台盼蓝染色观察离心后细胞活性,绘制BMSCs生长曲线,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。诱导传代细胞向成软骨细胞分化,2周后免疫组化检测Ⅱ型胶原的表达和阿尔新蓝染色检测蛋白多糖的表达。BrdU标记BMSCs,观察最佳标记率及标记时间,并予四甲基偶氮唑盐方法测定标记后细胞活性。结果：密度梯度离心结合贴壁法能分离培养出纯度较高的BMSCs,分离后细胞活性均大于99%,BMSCs表面标记CD90、CD45、CD34阳性细胞表达分别为99.24%、0.03%、1.37%,BMSCs的生长曲线呈S形。成软骨诱导2周后Ⅱ型胶原免疫组化阳性,阿尔新蓝染色细胞基质被蓝染。BrdU标记后,MSCs标记率〉95%,BrdU细胞标记最佳时间为48 h,最佳浓度为10 mg/L,标记后细胞活性高。结论：采用密度梯度离心和贴壁培养相结合,可获得纯度较高BMSCs;BrdU是一种简单、有效的标记BMSCs的方法,BrdU对细胞标记率高。     

免疫磁珠法及密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的比较

目的比较免疫磁珠法和密度梯度离心法分离纯化人外周血中性粒细胞的可靠性。方法用免疫磁珠法和密度梯度离心法分别分离中性粒细胞,使用血球计数仪结合显微镜鉴定细胞纯度、回收率,以台盼蓝检测细胞活力。结果免疫磁珠法与密度梯度离心法分离中性粒细胞纯度分别为（98．76±0．53）％,（92．34±1．57）％,回收率分别为（90．01±2．24）％和（82．20±2．17）％,两种方法分离后中性粒细胞活力分别为（95．60±2．30）％,（94．20±3．11）％。结论免疫磁珠法分离人中性粒细胞纯度及回收率均好于密度梯度离心法,但分离后细胞活性二者差异不大。     

改良的大鼠肝星状细胞分离方法

目的：探讨一种简便、高产的大鼠肝星状细胞（HSC）分离方法,为研究肝细胞相关实验提供细胞原材料。方法：应用悬浮缓冲液校正Nycodenz密度梯度分离液,使其浓度为11．3％（w／v）,采用单层一步梯度离心法分离HSC。采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin免疫细胞化学染色法鉴定HSCs纯度。结果：肝星状细胞得率每只大鼠约（4．0±0．5）×10^7个,细胞活力达到90％,细胞纯度达到95％。结论：本法简便、高产,是一种理想的分离肝星状细胞的方法,值得推广。     

大鼠肝星状细胞的简易分离法

目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上,探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。结果肝星状细胞的得率为4.0×107以上,肝星状细胞纯度为96%左右,肝星状细胞存活率为(95.0±1.2)%。结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法,结果稳定,细胞纯度较高,有利于进一步的生物学研究。     

大鼠A型精原干细胞的分离和纯化

目的摸索完善A型精原干细胞分离、纯化的方法与技术。方法选用9d的SD大鼠,不连续Percoll梯度液分离纯化精原干细胞,应用选择性贴壁法进一步纯化精原干细胞;台盼蓝排斥实验确定精原干细胞的活力;HE染色法观察细胞形态;c-kit细胞免疫组化鉴定细胞类型并进行细胞纯度分析。结果台盼蓝实验显示细胞活力维持于88.73%±0.85%;c-kit细胞免疫组化结果显示分离得到细胞为精原干细胞;细胞纯度为90.48%±1.78%。结论应用梯度离心及选择性贴壁法获得了纯度较高的A型精原干细胞。     

两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较

目的比较Ficoll-Paque梯度离心法与免疫磁珠法分离T淋巴细胞的效果差异,筛选有效的、优异的分选小鼠脾原始T淋巴细胞方法。方法分别采用Ficoll-Paque梯度离心法及Miltenyi Biotec免疫磁珠进行小鼠淋巴细胞分离。血小板计数器统计单核淋巴细胞数,苔盼蓝染色判断细胞存活率,流式细胞术鉴定CD4＋CD62＋T淋巴细胞纯度,并进行统计学分析。结果免疫磁珠法CD4＋CD62＋T淋巴细胞纯度较高为（66.27±3.52）%,Ficoll-Paque梯度离心法细胞纯度为（15.27±4.16）%,两者比较差异有统计学意义（P〈0.01）;但Ficoll-Paque梯度离心法获取淋巴细胞数（1.47±0.35）×10^8较免疫磁珠法的（0.67±0.26）×10^8多,两者比较差异有统计学意义（t=8.199,P〈0.01）,且Ficoll-Paque梯度离心法细胞存活率（93.9±2.6）%较免疫磁珠法的（89.9±2.9）%高,两者比较差异亦有统计学意义（P〈0.05）。结论免疫磁珠法适合分离小鼠脾原始T淋巴细胞并用于细胞纯度要求高的免疫学实验,但细胞得率需进一步优化。     

改良的小鼠原代肝细胞分离纯化方法

目的:建立一种简便、经济、高效的小鼠肝细胞分离和纯化方法。方法:对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,缩短消化时间和改变灌注方式;分离的小鼠肝细胞,采用低速离心(300 r/min,1min,3～5次)纯化,台盼兰染色检测活率,糖原染色鉴定肝细胞,并与单密度梯度离心纯化法进行比较。结果:原代肝细胞经低速离心纯化后,活率达到90%左右,纯度达95%以上,与密度梯度离心法效果相近。结论:建立了一种新的小鼠原代肝细胞的分离纯化方法。     

人离体子宫内膜细胞培养方法的建立

目的：建立分离培养人在位及异位子宫内膜间质及腺上皮细胞的方法，为进一步探讨子宫内膜异位症发生，发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：对36例在位子宫内膜及19例异位内膜随机分为离心分离组及筛网分离组进行体外培养。通过光镜观察及S－P免疫组化染色法，对间质及上皮细胞进行鉴定。结果：离心分离法培养的在位和异位内膜细胞中，成功率分别为61．1％和30％；筛网分离法培养的在位和异位内膜细胞中，成功率分别为83．3％和77．8％。结论：采用筛网分离法及离心分离法均能获得纯度较高的间质与上皮细胞。人子宫内膜细胞分离体外培养的成功，有助于揭示子宫内膜异位症的发病机制，为临床治疗提供重要的理论依据。