腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景:前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化.目的:进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用.方法:取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞.通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白--Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况.结果与结论:从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代.Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达.结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化.     

完全脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程纤维软骨

背景:含有骨形态发生蛋白的完全脱钙骨基质可使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化并维持其软骨细胞的特性,在软骨发生过程中发挥重要作用.目的:将骨髓间充质干细胞与完全脱钙骨基质在体外诱导培养成纤维软骨组织以及观察培养体系与支架材料对细胞凋亡的影响.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞,取第1代骨髓间充质干细胞均匀接种到完全脱钙骨基质上,以含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子、地塞米松、抗坏血酸及体积分数10%FBS的高糖DMEM诱导培养液培养作为实验组,将单层诱导培养、单层基础培养的骨髓间充质干细胞、空白完全脱钙骨基质作为对照,于培养第1,2,3,4周进行大体形态观察以及Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的RT-PCR定性检测;培养4周进行细胞凋亡检测.结果与结论:实验组可检测到Ⅰ型胶原的持续表达,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖表达逐渐增加.单层诱导培养组可检测到Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达及Ⅰ型胶原的持续表达,但表达量远低于实验组;实验组细胞凋亡率高于单层诱导培养组、单层基础培养组.说明转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1体外诱导培养的骨髓间充质干细胞-完全脱钙骨基质可以表达特异性软骨基质,三维环境培养细胞外基质的表达量明显高于单层诱导培养;静态培养系统对三维培养的细胞凋亡有影响.     

大鼠骨髓间充质干细胞与成骨细胞共育环境下Ⅰ型胶原的表达

背景:骨髓间充质干细胞在不同条件下可以分别分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等.目的:与成骨细胞共培养的条件下,观察大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成.材料:3月龄SPF级SD大鼠6只用于骨髓间充质干细胞的分离与扩增,1 d龄以内清洁级SD乳鼠10只用于成骨细胞的分离与扩增.方法:贴壁法分离骨髓间充质干细胞,扩增后以流式细胞仪检测其均一性及细胞表型.采用酶消化法分离培养成骨细胞,以磷酸酶染色观察细胞分泌情况.利用Transwell培养板将成骨细胞和骨髓间充质干细胞在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内培养,以采用普通培养板单独培养的骨髓间充质干细胞为对照.主要观察指标:观察骨髓间充质干细胞的形态学变化及矿化能力,20 d后半定量RT-PCR方法检测骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达,茜素红染色后显微镜下计数钙化结节.结果:流式细胞仪检测结果显示细胞均一性较好,2代细胞均一性在90%以上,CD34、CD45表达为阴性,CD44表达阳性.成骨细胞原代培养20 d时出现不透光的钙化结节,生长期细胞分裂相多见,细胞突起相互连接,汇合时呈铺路石状.茜素红染色矿化结节呈现酒红色,骨碱性磷酸酶染色可见胞质内出现黑色颗粒或块状沉淀.共培养的骨髓间充质干细胞形成的钙化结节数高于对照组(P＜0.05):与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原表达量明显高于对照组(P＜0.01).结论:与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达量高,成骨能力强.     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景:半月板损伤后自行修复能力有限,组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径.骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞.取第3代的骨髓间充质干细胞,实验组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化,对照组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液.在诱导第7,14,21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果.结果与结论:①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d,第4代以后相对延长,为5～9 d.②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变.③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色,尤其细胞密集生长的区域蓝染较深,染色强度随诱导时间延长而增强.对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染.④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性,各期染色无明显差异.对照组未见Ⅱ型胶原表达,实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达.提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质,作为半月板组织工程种子细胞来源可行.     

骨髓间充质干细胞条件培养液对瘢痕成纤维细胞生物活性的影响

背景：间充质干细胞移植可通过多种调节机制促进皮肤创伤修复,抑制瘢痕形成,目前多数学者认为间充质干细胞分泌的生物活性因子起主要作用。 目的：观察骨髓间充质干细胞条件培养液对增生性瘢痕成纤维细胞增殖能力及胶原合成的影响。 方法：分离培养人骨髓间充质干细胞和增生性瘢痕成纤维细胞,制备骨髓间充质干细胞条件培养液。将12,24,48 h收集的条件培养液孵育体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞24 h,并与空白对照组比较,采用CCK-8实验检测增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性,Real-time PCR 检测增生性瘢痕成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达。 结果与结论：与空白对照组相比较,在24 h和48 h收集的骨髓间充质干细胞条件培养液对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用（P〈0.01）,对其胶原的合成也具有显著的抑制作用（P〈0.01）。结果表明骨髓间充质干细胞条件培养液可通过分泌抗纤维化的生物活性因子抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原产生,为细胞疗法策略减轻瘢痕提供了新的理论支持。     

重组碱性成纤维细胞生长因子基因转染对于骨髓源性成骨细胞的生物学特性及对血管生成的影响

背景:碱性成纤维细胞生长因子对来源于中胚层和神经外胚层的细胞具有明显的促进增殖作用,对骨髓间充质干细胞具有间接的成骨作用.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染对骨髓源性成骨细胞生物学特性和血管生成的影响,与骨髓间充质干细胞作对比.设计、时间及地点:对比分析基因转染效果实验,于2007-11-27/2008-12-01在南方医科大学珠江医院中心实验室和动物实验中心完成.材料:2月龄新西兰大白兔用于骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨细胞诱导.5周龄Wistar大鼠用于移植实验.牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒由中山大学中山医学院免疫教研室徐霖博士惠赠.方法:分离兔骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞,采用脂质体介导将牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒分别转染体外培养的兔骨髓间充质干细胞和诱导的骨髓源性成骨细胞,G418筛选.稳定转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓源性成骨细胞与磷酸钙胶原材料复合培养,植于Wistar大鼠后腿肌袋内,正常饲养2,4周后取出植入的复合材料,观察血管新生情况.主要观察指标:碱性成纤维细胞生长因子转染前后骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性参数的比较以及骨髓源性成骨细胞转染碱性成纤维细胞生长因子前后新生血管数目的比较.结果:利用RT-PCR、免疫细胞化学染色分析转染细胞的碱性成纤维细胞生长因子表达情况.从形态、增殖特性和细胞周期、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原等方面分析稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生物学特性.重组牛pcDNA3-bFGF真核表达质粒成功转染目的细胞,经G418筛选稳定表达.转染的细胞有大量目的基因mRNA转录和目的蛋白表达.转染碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞生长均加快,细胞周期中增殖期细胞比例明显增加,细胞形态无明显变化.转染与未转染的骨髓源性成骨细胞比较,碱性磷酸酶的分泌量无明显变化(P＞0.05),转染后骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶分泌量小于骨髓源性成骨细胞(P＜0.01).骨髓源性成骨细胞转染与未转染碱性成纤维细胞生长因子基因组均有Ⅰ型胶原mRNA表达,但是,转染和未转染的骨髓间充质干细胞中均无Ⅰ型胶原基因mRNA转录.转染有外源性碱性成纤维细胞生长因子基因的复合材料部分被增生纤维结缔组织包绕,内有新生血管生成,随着时间的延长而增多.结论:稳定表达碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞和骨髓源性成骨细胞增殖较快,但作为组织工程骨的种子细胞,骨髓源性成骨细胞较骨髓间充质干细胞更理想.外源碱性成纤维细胞生长因子基因转染后稳定表达,对新生血管的形成具有促进作用,可以作为组织工程化人工骨种子细胞转染的目的基因.     

完全脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞体外诱导构建组织工程纤维软骨

背景：含有骨形态发生蛋白的完全脱钙骨基质可使骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化并维持其软骨细胞的特性,在软骨发生过程中发挥重要作用。目的：将骨髓间充质干细胞与完全脱钙骨基质在体外诱导培养成纤维软骨组织以及观察培养体系与支架材料对细胞凋亡的影响。方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞,取第1代骨髓间充质干细胞均匀接种到完全脱钙骨基质上,以含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子、地塞米松、抗坏血酸及体积分数10%FBS的高糖DMEM诱导培养液培养作为实验组,将单层诱导培养、单层基础培养的骨髓间充质干细胞、空白完全脱钙骨基质作为对照,于培养第1,2,3,4周进行大体形态观察以及Ⅰ、Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖的RT-PCR定性检测;培养4周进行细胞凋亡检测。结果与结论：实验组可检测到Ⅰ型胶原的持续表达,Ⅱ型胶原及聚集蛋白聚糖表达逐渐增加。单层诱导培养组可检测到Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达及Ⅰ型胶原的持续表达,但表达量远低于实验组;实验组细胞凋亡率高于单层诱导培养组、单层基础培养组。说明转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1体外诱导培养的骨髓间充质干细胞-完全脱钙骨基质可以表达特异性软骨基质,三维环境培养细胞外基质的表达量明显高于单层诱导培养;静态培养系统对三维培养的细胞凋亡有影响。     

骨髓间充质干细胞成骨方向诱导过程中的基因表达

背景:目前骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化演变中的基因表达模式尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,验证骨髓间充质干细胞是否向成骨细胞成熟分化.方法:抽取2月龄新西兰大白兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞,用矿化诱导培养基(DMEM/F12、地塞米松1×10<'-8> mmol/L、β-磷酸甘油钠0.01 mol/L、维生素C 0.05 g/L)进行成骨诱导培养,用反转录一聚合酶链反应方法检测诱导培养后第一二代骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因的表达情况,并对该骨髓间充质干细胞表面抗原CD44进行鉴定.结果与结论:经矿化诱导培养基诱导培养后,第一二代骨髓间充质干细胞阶段性表达碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素基因;第1代骨髓间充质干细胞抗原CD44阳性率达44.4%.提示兔骨髓间充质干细胞在体外矿化诱导培养中逐渐向成骨细胞分化,分别于诱导后第一二代细胞中阶段性顺序表达成骨细胞特异性基因碱性磷酸酶、骨桥蛋白、I型胶原、碱性成纤维细胞生长因子和骨钙素,该细胞己具备成骨细胞特征,为揭示骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中基因表达机制提供了实验依据.     

骨髓间充质干细胞在诱导液条件下向软骨细胞的定向诱导分化

背景:骨髓间充质干细胞易于从骨髓中分离,来源取材方便,对供体损伤小,具有强大的增殖能力及多向分化潜能,便于自体移植,如能成功诱导为软骨细胞将是软骨组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化,并对分化后细胞进行鉴定.设计、时间及地点:细胞形态学、蛋白质组学的比较观察于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于二三个月龄新西兰健康大白兔,体质量2～2.5 kg.方法:采用全骨髓法分离培养兔骨髓间充质干细胞.取生长良好的细胞第4代细胞消化传代,以1×105密度接种于24孔板中将生长状态良好的细胞在含有地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C及转化生长因子β的培养液中诱导分化. 主要观察指标:采用免疫组化的方法进行细胞鉴定,RT-PCR法检测诱导分化细胞 Ⅱ型胶原的表达.结果:骨髓间充质干细胞经成骨诱导后,由长梭形变为椭圆形及肾形.免疫组织化学方法显示所培养间充质干细胞不表达CD34、CD45,但CD105显阳性.骨髓间充质干细胞在未经诱导时不表达Ⅱ型胶原蛋白,经诱导后在500～750 bp之间可见明显条带.结论:骨髓间充质干细胞经含地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子维生素C及转化生长因子β等培养液诱导后,可以在体外向软骨细胞转化,高表达Ⅱ型胶原,并经细胞形态学及蛋白质组学RNA水平鉴定验证.     

Ⅰ/Ⅲ型胶原膜联合自体骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损

研究表明Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原都有利于骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和分化.目的:观察Ⅰ/Ⅲ型胶原膜联合自体骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损的可行性.方法:取24只新西兰大白兔制作双膝股骨滑车直径3.8 mm、深2 mm关节软骨缺损模型,分为2组:实验组缺损区植入Ⅰ/Ⅲ型胶原膜-自体骨髓间充质干细胞复合物,对照组缺损区植入单纯Ⅰ/Ⅲ型胶原膜.结果与结论:膝关节股骨标本组织学染色显示,实验组植入8周时为类透明软骨修复,12周时接近于正常软骨;对照组植入8周时以纤维样组织修复为主,12周时为纤维软骨修复.实验组植入后8,12周组织学评分均明显高于对照组(P<0.001).表明运用Ⅰ/Ⅲ型胶原膜-自体骨髓间充质干细胞复合物可修复关节软骨缺损.     

应用组织工程化肌腱修复跟腱缺损

背景:间质干细胞或间质祖细胞的非造血细胞可在体内或体外分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪及骨髓基质,这使得它们成为组织工程领域内非常有价值的种子细胞来源.目的:以骨髓间充质干细胞为种子细胞,以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸为支架构建组织工程化肌腱,观察其修复跟腱缺损的效果.设计,时间及地点:随机对照动物实验,于2003年在中南大学湘雅医学院进行.材料:1.5～2.5 kg健康成年家兔由中南大学湘雅医学院动物学部提供,雌雄不限.聚羟基乙酸由威高集团康利达医用制品有限公司提供.SD大鼠由中南大学实验动物学部提供.方法:提取家兔骨髓,通过离心和贴壁法培养获取骨髓间充质干细胞,将骨髓间充质干细胞进行分离、扩增.抽取SD大鼠尾腱,制备鼠尾Ⅰ型胶原溶液,并与聚羟基乙酸缝线混合培养构建胶原-聚羟基乙酸支架.将未经体外诱导的骨髓间充质干细胞接种于胶原-聚羟基乙酸支架中构建组织工程化兔肌腱模型,以不加入细胞的为对照.切开30只家兔踝部皮肤,分离出兔跟腱,造成3cm长缺损,实验组15只以自体骨髓间充质干细胞预制的组织工程化肌腱移植于缺损处,对照组15只以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸支架修复跟腱缺损.主要观察指标:组织工程化肌腱修复兔跟腱缺损的效果.结果:含自体骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原一聚羟基乙酸支架及不含自体骨髓间充质干细胞的Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸支架回植于体内时大体观察呈条形凝胶状.回植于体内4周后实验组和对照组均可见移植处形成条索状组织,聚羟基乙酸缝线已降解.8周时观察可见实验组组织工程化肌腱与受体肌腱组织完好连接,呈条索状.与周围其他组织无粘连,为白色、有光泽的致密腱样组织,对照组所形成的组织较实验组细小、与周围组织有粘连.结论:以骨髓间充质干细胞为种子细胞,以Ⅰ型胶原-聚羟基乙酸为支架构建的组织工程化肌腱可明显促进肌腱损伤的修复.     

胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原细胞相容性比较

背景:因心脏结构高度复杂、心肌组织有很高的机械顺应性,心肌组织工程对材料的要求高.以往研究表明Ⅰ型胶原和胶原海绵材料均适宜心肌细胞生长及分化.目的:拟进一步对比观察胶原海绵和温敏型Ⅰ型胶原与骨髓间充质干细胞的相容性,为心肌组织工程选择更理想的载体材料.设计、时间及地点:在解放军第四军医大学西京医院心血管内科实验室2007-03/10完成对比观察设计的实验.材料:胶原海绵由上海其胜制剂有限公司提供;温敏型Ⅰ型胶原由第四军医大学组织工程中心提供.方法:将体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞分别复合于胶原海绵和温敏型l型胶原材料,共同培养7 d,分别于培养第1,3,5和7天取材.主要观察指标:扫描电镜和苏木精.伊红染色观察骨髓间充质干细胞细胞形态及附着情况;MTT检测骨髓间充质干细胞细胞增殖情况.结果:①扫描电镜检测显示温敏型Ⅰ型胶原材料中骨髓间充质干细胞细胞黏附优于胶原海绵材料,细胞在Ⅰ型胶原材料中生长连接成片,表面有大量分泌颗粒.②MTT检测表明在培养第1,3,5,7天温敏型Ⅰ型胶原材料中骨髓间充质干细胞细胞活性(吸光度值)及细胞分裂增殖速度均高于胶原海绵材料(P＜0.01).结论:温敏型Ⅰ型胶原体外与骨髓间充质干细胞的相容性优于胶原海绵.     

改良小鼠骨髓间充质干细胞培养方法及长效荧光标记的可行性

背景:小鼠骨髓间充质干细胞培养不同于人及大鼠,培养扩展难度高,传代后干细胞活性保持时间短;又鉴于干细胞本身特点,使现有干细胞示踪方法作用时间短,这些因素均影响小鼠骨髓间充质干细胞的实验研究.目的:观察改良小鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法及长效荧光标记干细胞的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2008-06/12在解放军军事医学科学院完成.材料:C57BU6小鼠4～6周龄.体质量20g,雌雄不拘.方法:通过贴壁筛选和Percoll分离法,优化干细胞培养液血清和换液方式,培养扩增小鼠骨髓间充质干细胞.参照以往人和猕猴间充质干细胞培养经验,对小鼠间充质干细胞培养血清选择Hyclone的顶级胎牛血清,控制血清为培养液的10%.用LG-DMEM培养液冲出骨髓细胞后,滤去骨渣和小肌肉碎块.然后加在相对密度1.082的percoll分离液上,以1.5×10~6/cm~2浓度接种75 cm~2培养瓶.对第2代骨髓间充质干细胞进行长效CM-Dil标记.主要观察指标:原代及传代小鼠骨髓间充质干细胞形态变化;对第2代小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原,CD105,CD44,CD25,CD34进行流式细胞仪检测,评价改良方法获取干细胞纯度;通过成脂成骨分化,鉴定小鼠骨髓间充质干细胞的活性;观察多次传代后荧光细胞强度.结果:①小鼠骨髓间充质干细胞原代培养在接种48 h后可见贴壁细胞,培养第7天细胞多数伸展呈梭形,也有三角形,多角形和扁平形.3代后形态趋于统一,融合状态时细胞排列呈束状、漩涡状或放射状.②骨髓间充质干细胞特异性抗原高表达CD105,CD44;造血系抗原低表达CD34和CD45.③骨髓间充质干细胞向成骨分化过程中,纺锤形的突起逐渐消失,胞体增大,培养10 d后,部分细胞呈聚集生长,随细胞生长密度的增长形成多层的结节结构.在脂肪诱导体系中,可见细胞由成纤维样逐渐缩短,9 d后胞浆中出现脂肪滴,油红O染色可见红色的脂肪颗粒.④首次标记,荧光显微镜观察可见长效CM-Dil标记在细胞膜发橙色光,标记率在80%以上.流式细胞仪检测CM-Dil细胞标记率可到47%以上,第4代培养细胞仍可见较多标记细胞.结论:改良方法早期第2代就可获得高浓度干细胞,同时长效CM-Dil标记方法稳定,标记率高,可作体内细胞示踪.     

组织工程肌腱细胞研究模型的构建:SD大鼠尾腱细胞可行吗?

背景:目前常用的动物肌腱研究模型(比如兔,罗曼鸡等)的培养方法存在周期长,细胞获取量少等不足,往往成为制约肌腱组织工程实验研究进程的瓶颈.目的:希望建立SD大鼠鼠尾肌腱细胞培养流程,以期用较短时间获取大量种子细胞,为更高的工程化肌腱构造研究创造模型构建条件.设计、时间及地点:对比观察,于2006-02/11在四川大学生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成.材料:7～10dSD大鼠2只用于获取鼠尾腱细胞;第4代人包皮成纤维细胞由四川大学华西医院干细胞与组织工程研究室提供.方法:选用SD乳鼠,无菌条件下抽取尾腱,体积分数为10%的小牛血清+DF培养基悬浮组织块培养法获得鼠尾肌腱原代细胞,将第3代细胞与人包皮成纤维细胞为对照,行Ⅰ,Ⅲ型胶原免疫细胞化学染色,染色结果用image-pro plus 5.02行吸光度测量,并做统计分析.主要观察指标:SD大鼠尾腱细胞免疫细胞化学染色结果及染色吸光度测量结果.结果:第2代SD大鼠尾腱细胞Ⅰ型胶原染色呈阳性,Ⅲ型胶原染色呈阴性;人成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学皆呈阳性.尾腱细胞和人成纤维细胞Ⅰ型胶原表达吸光度值均明显高于Ⅲ型胶原(P＜0.05).两种细胞Ⅲ型胶原表达吸光度值与空白对照之间差异无显著性意义(P＞0.05).结论:SD乳鼠尾腱源细胞符合肌腱细胞的生物学特性.采用组织块悬浮培养可以在短期内大量获取原代或传代尾腱细胞.     

富血小板血浆体外培养骨髓间充质干细胞的增殖与胶原产生

背景:间充质干细胞是可大量获取的肌腱组织工程种子细胞,但体外如何诱导其分化为功能化腱样细胞成为此项技术的关键.目的:观察富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞分裂增殖和胶原产生的影响.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,并采用自体富血小板血浆对骨髓间充质干细胞进行干预(设立高、中、低剂量富血小板血浆组,并设空白对照组),每日计数细胞并绘制细胞生长曲线,用MTT比色法分析各组骨髓间充质干细胞的存活和增殖能力.以ELISA定量检测细胞的胶原产生,通过RT-PCR反应测定富血小板血浆干预前后细胞Ⅰ型胶原基因的表达.结果与结论:高、中、低浓度富血小板血浆组骨髓间充质干细胞均保持较高的增殖活性,呈快速生长,曲线上升幅度大,与空白对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05).培养时间越长作用越明显,培养一定时间后其作用具有剂量依赖性,较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用较为明显.富血小板血浆能明显促进骨髓间充质干细胞的Ⅰ和Ⅲ型胶原合成,剂量越大,刺激胶原产生的作用越明显.说明骨髓间充质干细胞具备组织工程化肌腱种子细胞的基本条件,富血小板血浆具有促进间充质干细胞向肌腱细胞转化的作用.     

体外共培养大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的影响:CyclinD1与P27表达调控

背景:在肝纤维化发生发展过程中,肝星状细胞起着关键作用.研究证实骨髓间充质干细胞移植可作为治疗肝纤维化的方法,但其逆转肝纤维化的机制不明.目的:探讨体外共培养条件下,大鼠骨髓间充质干细胞对肝星状细胞增殖的调控机制.方法:实验组在半透膜上接种大鼠骨髓间充质干细胞,在6孔塑料培养板上接种肝星状细胞,建立上下双层细胞共培养体系;对照组将大鼠骨髓间充质干细胞更换为成纤维细胞;空白组仅行肝星状细胞单独培养.WST-8法检测肝星状细胞生长抑制率,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR检测肝星状细胞CyclinD1和P27 mRNA的表达,Western blot检测肝星状细胞CyclinD1和P27蛋白的表达.结果与结论:与空白组、对照组比较,实验组共培养24,48,72 h肝星状细胞牛长抑制率均显著升高(P＜0.01):共培养72 h G_0/G_1期细胞显著增加(P＜0.01),S期细胞显著减少(P＜0.01),可阻滞肝星状细胞由G_0/G_1期向S期转换.共培养24 h,实验组CyclinD1 mRNA及蛋白表达开始下调,至72 h时表达量显著低于对照组、空白组(P＜0.01);共培养全过程中各组p27mRNA的表达无明显差异(P＞0.05),共培养24 h时实验组p27蛋白表达较对照组、空白组均显著上调(P＜0.01).结果证实大鼠骨髓间充质干细胞能够抑制肝星状细胞的增殖,其机制可能是通过下调CyclinD1表达,上调P27蛋白表达,使细胞周期停滞于G_0/G_1期实现的.     

胶原支架复合兔骨髓间充质干细胞体外模拟的微重力培养

背景:骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的方法包括体外高密度微团培养、体外单层细胞培养、体外三维支架环境诱导、与软骨细胞体外共培养诱导和基因转染诱导培养等.目的:验证模拟微重力条件下诱导后的兔骨髓间充质干细胞在Ⅰ、Ⅱ型胶原支架上黏附、伸展和增殖情况.方法:对兔骨髓间充质干细胞体外进行原代和传代培养,按加入诱导条件不同分为2组:实验组(转化生长因子β1+ 胰岛素样生长因子1诱导)组、空白对照组.3周后分别作MTT比色试验、糖胺聚糖检测和免疫组织化学染色.将诱导后的实验组细胞分别种植于Ⅰ、Ⅱ型胶原支架,分为4组培养:复合Ⅱ型胶原支架静置培养、复合Ⅱ型胶原支架模拟微重力培养组、复合Ⅰ型胶原支架静置培养、复合Ⅰ型胶原支架模拟微重力培养组,1周后作苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色.结果与结论:实验组MTT吸光度值和糖胺聚糖水平检测结果均大于空白对照组,且Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性.苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色显示,Ⅱ型胶原支架复合细胞的数量明显高于Ⅰ型胶原支架;模拟微重力培养条件下胶原支架复合细胞的数量明显高于静置培养组.结果说明微重力培养环境有利于高密度细胞的黏附、增殖,有利于细胞之间的信号传递,为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境;作为诱导后骨髓间充质干细胞的支架材料Ⅱ型胶原支架优于Ⅰ型胶原.     

转染碱性成纤维细胞生长因子骨髓间充质干细胞复合小肠黏膜下层构建的组织工程皮肤

背景:研究证实,小肠黏膜下层不存在免疫原性,不会引起异种移植中常见的排斥反应,是一种比较理想的人工真皮替代物.目的:通过基因转染的方法将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至骨髓间充质干细胞,并复合猪小肠黏膜下层构建组织工程皮肤.方法:日本大耳兔骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,通过pCDNA3.1质粒将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至生长状态良好的骨髓间充质干细胞,并将转染后的细胞接种于制备好的猪小肠黏膜下层上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤.观察细胞生长情况,流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表型,WesternBIot检测pCDNA-bFGF真核表达载体转染兔骨髓间充质干细胞的结果,并观察组织工程皮肤的结构.结果与结论:传代后骨髓间充质干细胞生长迅速,呈长梭形,形态良好.细胞的表面抗原CD90、CD44有阳性表达,而CD45为阴性.碱性成纤维细胞生长因子基因转染入兔骨髓基质干细胞并能稳定表达,转染后的骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层中生长良好,可体外构建组织工程皮肤.     

mdx鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及向肌细胞的诱导分化

背景:自体干细胞移植治疗可以克服异体干细胞移植治疗的局限性,但目前对于进行性肌营养不良模型mdx鼠骨髓间充质干细胞生物学特性及肌分化潜能研究未见报道.目的:拟建立体外分离培养mdx鼠骨髓间充质干细胞的方法,并观察其成肌分化能力.设计、时间及地点:细胞学体外观察,丁2006-01/07在中山大学附属第一医院神经病学实验宅完成.材料:4～6周龄纯系雄性mdx鼠10只,购自美国Jackson实验室,饲养于中山大学北校区动物实验中心.碱性成纤维细胞生长因子和兔抗鼠MHC抗体为Chemicon公司产晶.方法:全骨髓法体外分离mdx鼠骨髓间充质干细胞,差速贴壁法纯化扩增,胰酶+EDTA消化传代.取传至第3代的细胞,按1×104/孔接种于24孔板,置于含两性霉素B、碱性成纤维细胞生长因子、胎牛血清的DMEM培养基中向肌细胞方向诱导分化,2周后更换为不含两性霉素B、但添加马血清的DMEM培养基继续培养2周.主要观察指标:鼠骨髓间充质干细胞形态、表面标志、生长曲线及成肌诱导分化.结果:原代培养24 h后,鼠骨髓间充质干细胞约80%贴壁生长,第3代细胞多旱梭形,形态比较均一.鼠骨髓间充质干细胞农达CD29和CD44等间质类细胞的表面分子,不表达CD11B和CD45等淋巴造血细胞的表面分子.接种后第一两天细胞处于潜伏期,第3天细胞增殖旺盛,进入对数生长期,至第4天细胞数增长一倍,第5天进入平台期.两性霉素B诱导后细胞有少量死亡,停用后更换马血清促进细胞成肌,7～10 d可见有肌管样细胞形成,免疫荧光染色可见肌管样细胞呈MHC阳性,DAPI复染后可见肌细胞内有多个细胞核.结论:在两性霉素B与马血清依次诱导条件下,体外可成功分离培养基因缺陷mdx鼠骨髓间充质干细胞,并证明其具有成肌分化潜能.     

急性肝衰竭大鼠血清诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白

背景:研究发现肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子4和表皮细胞生长因子等可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化,关于肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用尚未见报道.目的:观察急性肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用.方法:采用密度梯度离心法从SD大乳鼠股骨、胫骨分离培养骨髓间充质干细胞,体外扩增培养.采用急性肝衰竭大鼠血清诱导培养骨髓间充质干细胞,以常规培养液诱导为对照,观察细胞形态的变化,诱导培养14 d采用免疫细胞化学方法检测甲胎蛋白、白蛋白的表达.结果与结论:急性肝衰竭大鼠血清诱导培养14 d, 可见骨髓间充质干细胞发生明显的形态学改变,镜下观察细胞变得稍大而扁平,呈类上皮样细胞,甲胎蛋白和白蛋白表达阳性率分别为(54.8±7.64)%和(45.9±9.68)%;对照组细胞未发生形态学改变,无甲胎蛋白和白蛋白的表达.证明了急性肝衰竭大鼠血清对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用,可诱导骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白.