应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒

目的建立基因Ⅱ型诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并应用于临床标本的检测。方法二氧化硅法提取粪便中的病毒RNA,使用针对基因Ⅱ型诺如病毒N/S结构域的引物和探针建立荧光定量PCR方法,对罗城县急性胃肠炎疫情的34份标本进行检测,并与常规RT-PCR和ELISA检测结果比较;还用该法对2006年2月至2007年1月广西急性胃肠炎暴发及散发病例粪便样本305份做了临床检测。结果用实时荧光定量RT-PCR法成功地从罗城疫情样本中检测出基因Ⅱ型诺如病毒,实时荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和ELISA的检出率分别为为85.3%、76.5%和26.5%。而实时荧光定量RT-PCR对114份对急性胃肠炎暴发疫情及191份散发病例样本的基因Ⅱ型诺如病毒检出率分别为56.1%和23.6%。结论诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有快速、灵敏和特异的优点,不但能对标本中病毒浓度进行定量检测,还能鉴别诺如病毒基因型别。同时也发现基因Ⅱ型诺如病毒感染在广西急性胃肠炎暴发疫情和散发病例中较常见。     

荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估

目的 建立灵敏、特异的诺如病毒基因Ⅱ型的荧光定量RT-PCR方法,用于临床腹泻粪便样本病毒的定量检测.方法 构建质粒DNA,并转录合成RNA作为标准品,建立和优化诺如病毒基因Ⅱ型荧光定量RT-PCR方法和反应体系,评价该方法的灵敏度、特异性、重复性,并进行临床粪便样本的检测.结果 此方法最低可以检出102拷贝数/μl,能特异地检出诺如病毒基因Ⅱ型,与诺如病毒基因Ⅰ型无交叉反应,与柯萨奇病毒B组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、星状病毒、甲肝病毒、埃可病毒和轮状病毒无交叉反应.针对标准品,2次批内试验的荧光信号循阈值(Ct值)变异系数(CV)分别为1.60％、0.70％,2次批间试验的变异系数(CV)分别为0.40％、0.40％,均在5％以下.结论 本研究建立的实时定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型的方法,其灵敏度、特异性和重复性良好,可用于该病毒的快速检测.     

普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立

目的建立一种适应国境口岸地区特定鼠种中普马拉病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法。方法利用Beacon Designer7.0软件设计引物和探针,以人工合成普马拉病毒S基因的片段作为模板,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并验证该方法的灵敏度及特异性。结果模板的Ct值与模板稀释浓度的对数存在良好的线性关系,标准曲线y=-3.122x＋38.605,R2=0.995,PCR扩增效率为109.1%,其最低检出限为31.6copies/μl。结论建立的实时荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,适合于普马拉病毒的快速检测。     

微流控实时荧光定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测两种出血热病毒的比较

目的 比较微流控实时荧光定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测两种出血热病毒的情况。方法 以汉城病毒(Seoul virus, SEOV)和汗滩病毒(Hantaan virus, HTNV)作为靶序列设计特异性的引物探针,制备体外转录RNA参考品,对其灵敏性进行评价,通过SEOV和HTNV的假病毒或者病毒培养物制备模拟阳性样本,分别通过微流控和荧光定量RT-PCR检测。结果 SEOV、HTNV体外转录RNA参考品拷贝数浓度分别是2.54×10¹²、1.26×10¹² copies/μl。SEOV、HTNV微流控实时荧光定量RT-PCR检测最低检出限值分别是119.5、123.8 copies/PCR,实时荧光定量RT-PCR检测分别是120.4、128.9 copies/PCR。两种方法检测不同浓度SEOV、HTNV的变异系数均<2%,检出率均为100%。结论 微流控实时荧光定量RT-PCR检测具有很好的特异性、稳定性和灵敏性,适用于现场实验室检测。     

脊髓灰质炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的 建立及应用

摘要:目的　在省级脊髓灰质炎（脊灰）实验室建立一种快速、灵敏、准确的脊灰病毒（Poliovirus,PV）型内鉴定（Intratypic Differentiation,ITD）及基因型鉴定的方法。方法　以PV衣壳蛋白（Capsid Protein）VP1编码区基因序列为目标,设计并合成引物和 Taqman 探针,建立实时荧光定量RT-PCR（Real-time RT-PCR,rRT-PCR）检测体系,并考察该方法的重复性、灵敏性和特异性。结果　该方法能快速、灵敏地鉴定出PV血清型及毒株类型,在1.0×108 copies/μl～1.0×103 copies/μl检测范围之间有良好的线性关系,相关系数为0.993,最低检测限为103.5CCID50/0.1 ml。结论　成功在省级实验室建立了PV的r RT-PCR检测技术,该技术特异性强,敏感性高,操作简便快速,适用于PV的型内鉴定和基因型鉴定,可应用于实验室诊断,为免疫策略快速提供依据。     

快速荧光定量RT-PCR检测对虾Taura综合征病毒(TSV)的方法建立与应用

目的:建立桃拉综合征病毒快速荧光定量RT-PCR用于提高我市对虾出口检验检疫工作效率和疫病防控。方法:选取TSV基因组的保守序列,利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针,扩增产物长度为73 bp。构建TSV目的扩增片段的质粒为标准品,对TSV的核酸提取、RT-PCR进行优化。结果:TSV核酸提取20 min、RT-PCR34 min,检测灵敏度为0.03 fg/μl,组内的实验变异系数为0.25%～1.17%、组间实验变异系数为1.51%～2.60%,与10种病原微生物无非特异反应,定量标准曲线相关系数=-1。结论:本方法用于TSV核酸定量检测速度极快,灵敏度与特异度高、重复性好、定量准确,各项指标均优于标准方法。     

柯萨奇病毒B3的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种检测柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3)的实时荧光定量RT-PCR方法,为临床CVB3的快速、准确检测提供一种新的方法。方法:针对CVB3基因的VP4区和管家基因β-actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-CVB3为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建CVB3的荧光定量RT-PCR标准曲线。结果:建立的方法在1.0×101～1.0×108copies/μl模板范围内具有良好的线性关系(r2>0.999),扩增效率高于98.0%,至少可检测10 copies/μl的阳性标准品。用CVB3感染HeLa细胞来模拟实际样品,灵敏度可达到1.0×101copies。结论:建立的荧光定量RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为CVB3的快速诊断方法,为CVB3感染的临床治疗提供快速可靠的诊断依据。     

B型呼吸道合胞病毒荧光定量RT-PCR检测

目的建立B型人呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的快速荧光定量RT-PCR检测方法。用于B型RSV实验室早期诊断与病毒核酸的定量分析。方法利用B型RSVN基因保守区设计引物和TaqMan-MGB（minor groove binder，DNA小沟结合物）探针，优化反应体系和反应条件；并对方法进行特异性、灵敏度和重复性评价；同时以10倍梯度稀释的质粒为标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线，构建定量分析模型。并用该方法对100份临床呼吸道样本进行检测。结果该方法与其他呼吸道病毒均无交叉反应，检测灵敏度达1TCID50／ml 50％组织培养物感染剂量病毒滴度，临床样本中B型RSV的检测阳性率达18％。结论B型RSV荧光定量RT-PCR检测方法快速、敏感、特异，适用于B型RSV的早期诊断和核酸定量分析。     

黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法建立

目的 建立用于检测黄病毒属的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法。方法 从GenBank中检索黄病毒属代表株的全基因序列,通过DNAstar进行序列比对和blast进行保守序列搜索和分析,用Beacon Designer 7.0软件进行引物和TaqMan探针设计,以乙脑毒株MB090509 RNA为模板,优化反应条件并应用于现场蚊虫标本检测。结果 确定黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR反应条件为:45℃15 min,95℃10 min,95℃10 s→54℃45 s,40次循环,引物和探针终浓度为200 nmol/L。灵敏度为常规RT-PCR方法 100倍,检出限2.9×10-3噬斑形成单位(PFU)/mL,与甲病毒属、东南亚十二节段RNA病毒属、布尼亚病毒属均无交叉反应。从161份现场蚊虫标本中检测出11份阳性标本,经病毒分离、测序均被证实为乙脑病毒。结论 本研究建立的黄病毒属TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有广泛应用价值。     

RT-PCR法检测诺如病毒结果分析

目的通过比较2种检测诺如病毒（NV）的方法,为临床实验室病毒检测提供参考依据。方法用荧光定量RT-PCR和ELISA法对泉州地区多起流行性急性胃肠炎事件中病人标本进行NV检测,观察方法的敏感性和特异性。结果荧光定量RT-PCR法阳性检出率（86.5%）高于ELISA法（43.7%）;以ELISA法为标准,荧光定量RT-PCR法的敏感性为94.5%,特异性为19.7%,两者的Kappa值=0.128,相关系数r=0.207,一致性较差。荧光定量RT-PCR法敏感性较高。结论荧光定量RT-PCR法敏感性较高,可用于应急快速检NV,但其特异性不高。     

贝类中诺如病毒ELISA与荧光定量PCR检测技术的研究

目的:贝类中诺如病毒是世界范围内急性非细菌性流行性胃肠炎的重要病原。目前我国沿海地区也暴发了诺如病毒,为了更准确的检测,本文寻找和建立了贝类产品中诺如病毒的快速检测方法。方法:用荧光定量PCR和ELISA法对大连地区的贝类样品进行检测。结果:大连地区的贝类样品未检测出诺如病毒。结论:通过实验证明荧光定量PCR法和ELISA法都可用于快速检测诺如病毒,但ELISA法更适于检测诺如病毒含量低的样品。     

诺如病毒快速检测方法的建立及其在国境卫生检疫中的应用

目的:建立快速、特异的诺如病毒实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR相结合检测方法,对人感染诺如病毒进行快速检测。方法:根据国外最新流行的诺如病毒核酸序列,设计并合成诺如病毒基因扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件,制定出快速、灵敏检测诺如病毒核酸的实时荧光RT-PCR检测方法及常规RT-PCR检测方法。结果:实验证明,本方法将实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR检测方法相结合,能在5 h内快速确认诺如病毒,检测灵敏度达到102拷贝/反应,具有快速、灵敏的特点,且具有较高的特异性和重复性。结论:本实验室利用本方法,首次在广州某国境口岸从外籍发热船员样本中检出5例输入性GGⅡ群诺如病毒。该方法对防止诺如病毒传入我国,保障我国国境卫生安全具有重要意义。     

应用2种RT-PCR方法检测和分析北京市市场销售牡蛎中诺如病毒基因特征

目的:应用实时荧光RT-PCR和半巢式RT-PCR方法检测和分析牡蛎中诺如病毒的基因特征。方法:应用实时荧光RT-PCR和半巢式RT-PCR方法,对2014年11月至2015年10月北京市采集的新鲜市售牡蛎进行诺如病毒GⅠ/GⅡ组并联试验检测,分析检出率,应用符合率和一致性检验（Kappa值）对半巢式RT-PCR方法进...     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

1起诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发调查及实验室检测分析

目的调查了解1起诺如病毒引起的急性胃肠炎暴发疫情的流行病学特点、传播途径及病原体,为制定预防控制对策提供依据。方法设立病例定义,在深圳市发生疫情的村子进行病例搜索,使用感染性腹泻个案调查表对所有搜索到的病例进行回顾性调查,并分别调查58例病例及74例对照的生活习惯;采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和实时荧光PCR方法分别对病人粪便、肛拭子标本及村民饮用的水样进行诺如病毒核糖核酸（RNA）检测,分析其流行特征及可能传播途径。结果该起疫情首例病例发病时间为2009年10月23日,疫情历时11d,共搜索到97例病例,全村罹患率为9．41％（97／1031）,以2岁以下的儿童为多,占53．1％。病例临床症状以腹泻、腹痛、腹胀、恶心、呕吐为主。病例组饮用生的山泉水及就餐前用生的山泉水冲洗碗筷的比例均高于对照组（P〈0．05或P〈0．01）;13份病例粪便和肛拭子标本中,检测出12例诺如病毒阳性,阳性率为92．3％;检测7份水样（包括1份水源水、1份水池水、3份病例家中水龙头水和2份洗碗水）,其中2份水龙头水和1份洗碗水检出诺如病毒,其余均为阴性。结论此起群体性胃肠炎暴发疫情是由诺如病毒感染引起;传播途径可能主要因水源污染和生活接触传播所致。     

b-DNA技术在诺如病毒检测中的应用

目的 评价b-DNA技术在诺如病毒检测中的应用价值.方法 收集医院2009年6-10月肠道门诊就诊腹泻患者204例,分别采用RT-PCR和b-DNA法进行检测,比较两种方法的检出率.结果 在所检测的204例腹泻患者标本中,RT-PCR法检出26例,阳性率为12.7％,b-DNA法检出33例,阳性率为16.2％,两种方法的检出率差异无统计学意义.结论 由于b-DNA技术无需抽提纯化RNA、反转录和PCR扩增,操作步骤简单,所需实验设备条件少,具有广阔地临床应用前景.     

贝类海产品中诺如病毒快速检测方法研究

目的：寻找和建立贝类产品中诺如病毒的敏感特异的快速检测方法。方法：通过对报道的3种贝类中病毒提取方法的提取效率进行比较，确定最终的提取方法。设计特异性和敏感性相对较高的套式PCR方法进行病毒检测，检测结果经核酸序列测定证实。结果：3种方法中用PBS-三氯三氟乙烷-PEG处理回收率较高。设计的套式PCR方法可成功检测到病毒，其敏感性可比单轮PCR高100倍。结论：该研究建立了敏感特异的诺如病毒检测方法。     

套式逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA的临床应用

目的 评价套式逆转录PCR检测血清戊肝病毒(HEV) RNA的临床意义.方法 对GenBank数据库中的戊型肝炎病毒全基因组序列进行分析比对,并针对国内流行的HEV株序列,选择位于ORF2的保守区域设计引物,建立套式逆转录聚合酶链式反应(nRT-PCR)方法,并检测126例急性戊型肝炎患者,并与检测抗-HEV IgM的方法进行比较.结果 126例急性戊型肝炎患者血清中有67例HEV-RNA阳性,对照组血清HEV-RNA检测均为阴性;与血清抗HEV IgM检测结果比较,HEV RNA检测的总符合率为80.91％,两种方法的检测结果具有良好的一致性;nRT-PCR方法检测HEV-RNA与血清抗-HEV IgM检测方法存在明显的差异,不能相互替代,而有一定的互补性;3例患者的首份血清检测为HEV-RNA阳性,但抗-HEV IgM为阴性,系列追踪检测,均相继出现抗HEV IgM,急性戊型肝炎患者血清HEV-RNA的检出多在发病的1～12 d.结论 应用nRT-PCR方法能对急性散发戊型肝炎患者血清中的HEV RNA进行定性检测,且有较高的特异性和敏感性,临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平,具有一定的临床应用价值.     

2006-2007年杭州市余杭区诺如病毒性腹泻分子流行病学研究

目的研究杭州市余杭区群发性腹泻中诺如病毒的分子流行病学特点。方法采集2006-2007年6起余杭区群发性腹泻疫情患者的粪便和肛拭子标本,采用荧光定量PCR技术进行诺如病毒检测,然后对病毒的N/S区域进行序列测定。结果6起群发性腹泻疫情都是由诺如病毒引起的,基因分析显示这些病毒都属基因Ⅱ型4组。结论诺如病毒是余杭区群发性非细菌性胃肠炎的重要病原体之一,在现阶段存在优势毒株是GII.4型,正在发生变异。     

逆转录-聚合酶链反应检测风疹病毒基因

针对风疹患者发病早期血清中特异性风疹IgM抗体阳性率低的特点 ,以及对胎儿风疹病毒感染检测的需要 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)直接从风疹减毒活疫苗BRDⅡ株、风疹GOS株、临床风疹患者的含漱液和咽拭子中检测出 411bp特异性片段 ;而麻疹、流行性腮腺炎、流行性感冒病毒均未检测出相应片段。通过对RT PCR一次产物的再次扩增 ,可以使检测的灵敏度达到 0 1TCID50 。该技术可作为风疹酶联免疫吸附试验 (ELISA)的一种补充 ,同时对控制先天性风疹综合征与优生优育工作具有积极的作用。