靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）基因的短发卡干扰RNA（short hair-pin RNA,shRNA）表达载体,研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用,探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段.方法 根据Genbank中大鼠PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10,经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板;合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列,将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cbshRNA上,构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22α p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称SM22α e/p shRNA）和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3 cb-shRNA（简称KDR e/p shRNA）;将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞,分别于转染24h、48h、72 h后,采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量.结果 荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较,前者细胞Pik3cb mRNA相对表达量降低更为明显,且两组均较对照组mRNA表达明显减少（P＜0.05）;酶切鉴定重组质粒载体SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA构建成功;质粒转染细胞后,Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22α e/p质粒组较阴性对照组均有所降低,且转染24h后,SM22α e/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板,能够成功构建SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA质粒载体,且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达.     

TLR4基因的shRNA对内毒素刺激下RAW264.7细胞TLR2表达的影响及机制

目的 观察针对Toll样受体4的发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)对内毒素刺激后小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞Toll样受体2表达的影响,并探讨其机制.方法 将携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP/TLR4-siRNA,运用脂质体Lipofectamine2000转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7.转染24 h后予新霉素(G418)筛选获取稳定转染细胞株.然后将细胞分为三组:空白组(Blank group),未转染细胞LPS刺激组(LPS group)和稳定转染细胞LPS刺激组(LPS-TLR4-siRNA group),采用荧光定量PCR及流式细胞学方法检测各组细胞TLR2 mRNA和蛋白的表达,Western blot检测NF-κB p65的表达,同时用ELISA方法检测细胞分泌的TNF-α水平的变化.结果 将pEGFP/TLR4-siRNA转染至RAW264.7细胞后,增强型荧光蛋白的表达为(45.25±9.23)%.LPS-TLR4-siRNA组细胞的TLR2mRNA及蛋白的表达均明显低于LPS组(P＜0.05),同时NF-κB p65表达下调及分泌TNF-α的水平下降(P＜0.01).结论 针对TLR4 mRNA的shRNA能降低LPS刺激下的RAW204.7细胞TLB2的表达.     

稳定转染靶向bcl-2的shRNA对胃癌SGC-7901细胞株增殖影响

目的探讨稳定转染靶向bcl-2的小发夹RNA（shRNA）对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响。方法构建针对bcl-2的shRNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选稳定转染的细胞克隆继续压力培养。RT-PCR方法检测稳定转染后SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达以及对细胞增殖和凋亡的影响。结果稳定转染shRNA后,SGC-7901细胞的bcl-2 mRNA表达明显下降;细胞增殖能力及凋亡率无明显变化。结论稳定转染shRNA能长效抑制SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达,为后续基因治疗研究提供了实验依据。     

联合转染mdrl和mcll基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对 mdrl 和 mell 基因的短发夹 RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对 K562/A02细胞耐药的逆转作用。方法根据 mdrl 和 mell 基因表达序列设计有效的 RNA 干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性 shRNA 干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染 K562/A02细胞,用 G418和(或)Hygro B 筛选出稳定表达的细胞克隆。用RT-PCR 分析 mdrl 和 mcll mRNA 的表达;MTT 法检测阿霉素对 K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术测定细胞 P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率。结果成功构建两个基因的 shRNA干扰表达质粒。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染 K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组 mdrl 基因和 mell 基因的 mRNA 相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染后 K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对 K562/A02细胞耐药逆转率最高,P 糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P<0.01)。联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论转染 mdrl 或 mell 基因的 shRNA 干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转 K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果。mell 基因可能与 K562/A02耐药相关。     

生长激素对脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬细胞NO产生及iNOS mRNA表达的影响及意义

目的：研究重组人生长激素对脂多糖（LPS）刺激大鼠腹腔巨噬细胞活性的改变,TNF—α、iNOS mRNA的表达情况及对NO的产生的影响。方法：分离提取大鼠腹腔巨噬细胞,用12S刺激2h后加入不同浓度重组人生长激素,6h后观察巨噬细胞活性RT—PCR检测巨噬细胞内TNF—α、iNOS mRNA的表达情况,上清液测NO浓度。结果：巨噬细胞用12S刺激后,活性明显增强,TNF—α、iNOS mRNA表达上调,NO产生增加,使用不同剂量的生长激素后能均够抑制巨噬细胞的活性,iNOS mRNA表达下调,NO产生减少,而对TNF—α mRNA的表达无明显影响。结论：低剂量的生长激素可以抑制12S对巨噬细胞的活化作用,其部分机制是下调了iNOS mRNA表达,使NO产生减少,但其抑制作用不随浓度的增加而上升。在体外rhGH并不直接抑制TNF—αmRNA的表达。     

针对表皮生长因子受体基因RNA干扰质粒表达载体的构建

目的:表皮生长因子受体(EGFR)是一种酪氨酸激酶跨膜受体,人类的多种恶性肿瘤的发生与表皮生长因子受体过度表达有关。EGFR已成为阳性表达肿瘤的重要治疗靶标。在哺乳动物细胞中,RNA干扰是通过与目的基因特异互补的21-23个硷基的小双链RNA来抑制该基因的表达。有研究表明表达小发夹RNA的载体能诱导产生更好的RNA干扰效果。本实验通过向pSIREN-Shuttle质粒插入一段可被转录成小发夹RNA的双链寡核苷酸序列(其中含有于EGFR基因序列相同的19nt序列)重构了RNAi质粒表达载体。通过细胞转染评价该载体对人鼻咽癌细胞株(HNE1)EGFR基因的mRNA表达抑制效果。结果显示HNE1细胞的EGFR基因mRNA被明显抑制。提示shRNA质粒表达载体介导对EGFR基因的RNA干扰可能是鼻咽癌干预治疗的一种有效手段。     

有效抑制T24细胞survivin表达的小RNA筛选及其载体构建

目的:筛选有效抑制T24细胞survivin表达的si RNA序列,并构建其质粒载体,为后续研究提供基础。方法:设计并合成针对survivin的si RNA,转染T24细胞。用RT-PCR方法测定干扰后细胞survivin mRNA表达,Western-blot方法测定干扰后survivin蛋白表达,比较其抑制率,筛选出有效抑制靶基因表达的si RNA,并构建相应的质粒载体(shRNA)。结果:si RNA转染T24细胞有较高的转染效率;②半定量RT-PCR:1号si RNA干扰T24细胞48h后survivin基因mRNA表达最低,有显著差异(P<0.05),抑制率70%左右。③Western-blot:1号si RNA干扰T24细胞72h后survivin蛋白表达最低,有显著差异(P<0.05),抑制率60%左右。④Western-blot方法测定T24细胞转染1号si RNA后连续7d survivin蛋白表达量变化:干扰后48~96h survivin蛋白表达量最低,有显著差异(P<0.05)。⑤以1号si RNA序列构建质粒载体并转染T24细胞成功,转染效率较高,质粒本身对细胞无毒无害。结论:所设计、合成的si RNA中,1号survivin-si RNA对T24细胞sur-vivin表达有明显抑制作用;②根据实验结果构建的质粒载体及其对照质粒可用于T24细胞转染,供进一步实验研究。     

短发夹RNA诱导survivin基因缄默对Jurkat细胞凋亡和增殖的影响

目的研究应用载体表达短发夹 RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术抑制人 T 淋巴细胞白血病细胞株 Jurkat 细胞 survivin 基因的表达,探讨 survivin 基因表达缄默对 Jurkat 细胞凋亡和增殖的影响。方法构建针对 survivin 基因的 shRNA 重组质粒并转染至 Jurkat 细胞,分别用多重 PCR和 Western blot 法检测瞬时转染和稳定转染细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白表达水平的变化;流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞凋亡指数的变化,绘制细胞生长曲线,探讨 survivin shRNA 转染对细胞生长和增殖的影响。结果多重 PCR 结果示与无功能(对照组)shRNA 处理组和磷酸盐缓冲液处理组比较,survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞 surivivin 基因 mRNA 表达均显著下降,抑制率分别为66.675% 和60.69%(P<0.05);Western blot 结果显示 survivin shRNA 瞬时转染和稳定转染细胞survivin 蛋白表达水平亦显著降低,抑制率分别为63.41% 和60.18%(P<0.05)。流式细胞术检测瞬时转染和稳定转染细胞的凋亡率显著增加,分别为(22.41±2.83)% 和(20.73±2.56)%(与对照组比较,P均<0.05),细胞倍增时间显著延长。生长曲线显示稳定转染细胞的生长显著减慢。结论shRNA 重组质粒介导的 RNA 干扰能明显抑制 Jurkat 细胞 survivin 基因 mRNA 和蛋白产物的表达,诱导细胞凋亡和生长抑制。     

阻断RIP2对小鼠巨噬细胞及内毒素血症的影响

目的:阻断RIP2对巨噬细胞产生炎症细胞因子及内毒素血症小鼠的影响。方法:构建小鼠RIP2基因的siRNA质粒,转染细胞后用RT-PCR和Western blot方法检测细胞RIP2的表达;LPS刺激后,用ELISA法测定细胞TNF-α,半定量West- ern blot测定HMGB1的水平。RIP2 siRNA质粒转染小鼠后,予LPS刺激小鼠,观察小鼠死亡率,用Western blot方法检测肝组织RIP2和HMGB1的表达,ELISA法测定血清TNF-α的水平。结果:RIP2 siRNAⅢ号质粒可阻断RIP2的mRNA和蛋白表达。LPS刺激后,阻断RIP2的细胞产生TNF-α、HMGB1减少;体内转染后,阻断RIP2的小鼠生存率较其它组高,肝组织中HMGB1的表达较其他组减少,血清TNF-α水平较其它组低。结论:RIP2 siRNAⅢ号质粒可阻断RIP2的表达,从而减少TNF-α、HMGB1等炎症细胞因子的产生,降低小鼠内毒素血症的死亡率。     

靶向封闭再生基因Ⅰα对胰腺癌细胞SW1990增殖行为的影响

目的 观察靶向封闭再生基因Ⅰα(REG Ⅰα)对胰腺癌细胞株SW1990增殖行为的影响.方法 设计并体外合成靶向REG Ⅰα的小干扰RNA(siRNA),将其转染到SW1990细胞中,半定量RT-PCR、蛋白质印迹法检测转染前后REG Ⅰα基因表达的变化.采用MTT法检测转染前后细胞增殖能力的改变,流式细胞技术检测细胞周期的变化.结果 REG Ⅰα siRNA转染胰腺癌细胞SW1990后,明显抑制REG Ⅰα基因表达,以200 nmol/L REG Ⅰα siRNA对REG Ⅰα基因表达抑制效果最佳.以该浓度的REG Ⅰα siRNA转染SW1990细胞后,SW1990细胞在siRNA转染后48 hREG Ⅰα mRNA表达抑制率最高,达82%;干扰后SW1990中REG Ⅰα蛋白表达也明显下调.抑制SW1990细胞中REG Ⅰα的表达后,SW1990细胞的增殖能力明显下降,与阴性对照组(转染无关序列的siRNA)及空白对照组(无任何处理)相比,差异有统计学意义(P<0.05).转染细胞的周期分布有明显改变:G1期细胞增加,S期细胞减少.结论 靶向封闭REG Ⅰα基因能明显抑制胰腺癌细胞SW1990在体外的增殖能力,为探索胰腺癌基因治疗提供新的策略.     

抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)表达质粒的构建

目的:通过构建抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,为肿瘤基因治疗提供实验依据。方法:利用基因重组技术构建靶向cyclin D1RNA干扰(RNAi)表达质粒,双酶切鉴定电泳及测序分析构建的质粒是否成功;Western Blot分析转染前后K562细胞cyclin D1蛋白表达的变化。结果:体外合成的64个碱基成功插入到预计位点,并且与设计序列完全一致;Western Blot分析结果显示转染所构建的质粒能明显下调K562细胞cyclin D1基因表达。结论:质粒的成功构建为研究其抑制cyclin D1基因表达,发挥抗肿瘤效应以及与放、化疗联合的协同效应打下基础。     

应用RNA干扰技术沉默vegfr-2基因的实验研究

为了探讨恶性肿瘤基因治疗的新靶点,本研究以vegfr-2的mRNA为靶点,设计、构建vegfr-2 shRNA的真核表达载体,用脂质体法将重组质粒转染人非小细胞肺癌A549细胞,用RT-PCR法及Western blot分别检测重组质粒对该基因mRNA和蛋白表达的抑制效果,应用CCK-8法检测细胞增殖、抑制情况,Hoechst染色法检测细胞凋亡形态学变化。结果表明:与空白对照、空质粒对照及scramble对照相比,干扰组shRNA能有效地降解vegfr-2mRNA,尤其转染pGenesil-1-vegfr-2-shRNA-1质粒组内源性vegfr-2 mRNA及蛋白减少更显著;在不同时间点转染干扰质粒组的A值均降低,转染后72小时抑制率最高,干扰组与空质粒组和空白对照组相比,对细胞生长抑制作用的差异有统计学意义(p0.01);Hoechst荧光染色显示,转染48小时后在荧光显微镜下干扰组细胞呈典型的细胞凋亡形态。结论:vegfr-2 shRNA真核表达载体可序列特异性下调A549细胞的基因转录和表达,有效抑制细胞增殖和诱导凋亡,提示VEGF/VEGFR-2信号通路可作为恶性肿瘤基因治疗和功能研究的理想靶点。     

应用Gateway技术构建pLenti6-Akt shRNA真核表达载体

目的 应用Gateway技术构建靶向人Akt基因的shRNA真核表达载体,转染肝癌细胞株HepG2,验证该载体能否下调Akt基因的mRNA水平.方法 以Akt基因为靶点设计两条具有短发卡结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6入门表达载体(pENTR/U6-Akt1,pENTR/U6-Akt2);转化E.coli TOP10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;利用Gateway技术进行LR位点特异性重组,将shRNA导入目的 表达载体pLenti6/Block-it DEST Vector,再行测序鉴定(pLenti6-Akt1,pLenti6-Akt2);将重组质粒转染肝癌细胞株HepG2,提取RNA,RT-PCR检测重组质粒对mRNA水平的抑制效果.结果 经菌落PCR和DNA测序鉴定:pENTR/U6-Akts入门载体和pLenti6-Akts目的 表达载体中插入片段的序列正确,RT-PCR结果表明将shRNA分别转染HepG2细胞后,Akt的mRNA表达受到明显抑制,其中1shRNA比2#shRNA抑制效果明显.结论 利用Gateway技术成功构建了靶向人Akt基因的shRNA表达载体,为以Akt基因为靶点的肝癌基因治疗方案奠定了实验基础.     

RNA干扰技术对小鼠巨噬细胞基质金属蛋白酶9表达的抑制

目的：构建基质金属蛋白酶9靶向的RNA干扰质粒载体，观察其对小鼠巨噬细胞基质金属蛋白酶9基因表达的沉默作用。 方法：实验于2004-11／2005—07在哈尔滨医科大学第一临床医学院中心实验室完成。设计能转录小发卡结构RNA的DNA序列，并与psiSTRIKE^TM质粒载体连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6的真核表达载体，以脂质体法将重组质粒导人小鼠巨噬细胞内，采用Invitrogen公司Lipofectamne^TM2000转染试剂进行转染。实验分为实验组、阴性对照组和空白对照组。实验组每孔分别加入4μL脂质体和psiSTRIKE^TM／基质金属蛋白酶9重组质粒2μg；阴性对照组只加2μL Lipofectamne^TM2000转染试剂；空白对照组则不加任何干扰因素。分别于转染前、转染24，48，72h后用反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学技术检测基质金属蛋白酶9mRNA及蛋白水平的表达情况。 结果：①成功构建靶向基质金属蛋白酶9基因发夹状RNA干扰质粒载体。②实验组转染重组质粒24，48，72h后阳性细胞率与转染前相比逐渐减少（分别为70％，42％，32％，99％，P〈0．01），而阴性对照组和空白对照组则差异无显著性意义。③转染小鼠巨噬细胞后，基质金属蛋白酶9mRNA蛋白表达下调。 结论：构建的RNA干扰真核表达载体能明显抑制基质金属蛋白酶9mRNA及蛋白的表达，提示通过减少动脉粥样硬化斑块细胞外基质的降解，来稳定动脉粥样硬化斑块，在基因治疗方向为斑块稳定进行了新的尝试。     

siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响

目的构建GPC3基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh-7凋亡的影响,探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7,荧光定量PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC-shRNA-GPC3,以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体转染人肝癌细胞系,筛选并建立稳定表达siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测GPC3 siRNA转染后mRNA表达情况,验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh-7中,GPC3基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh-7后能明显抑制GPC3 mRNA表达水平;同时,流式细胞仪检测发现,GPC3表达下调后,诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达,并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

联合转染mdr1和mcl1基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对mdr1和mcl1基因的短发夹RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对K562/A02细胞耐药的逆转作用.方法根据mdr1和mcl1基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性shRNA干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染K562/A02细胞,用G418和(或)Hygro B筛选出稳定表达的细胞克隆.用RT-PCR分析mdr1和mcl1 mRNA的表达;MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术测定细胞P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率.结果成功构建两个基因的shRNA干扰表达质粒.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组mdr1基因和mcl1基因的mRNA相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%.mdr1、mcl1 shRNA干扰表达质粒单独和联合转染后K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对K562/A02细胞耐药逆转率最高,P糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P《0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P《0.01).联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P《0.05).结论转染mdr1或mcl1基因的shRNA干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果.mcl1基因可能与K562/A02耐药相关.     

RNA干扰沉默STAT3基因表达对膀胱癌细胞生长影响的实验研究

目的探讨应用RNA干扰技术沉默信号转导和转录激活因子3（STAT3）基因对膀胱癌T24及5637细胞的影响。方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板，构建pGenesil-1-shRNASTAT3重组质粒，转染人膀胱癌T24及5637细胞。通过半定量RT-PCR、Western印迹检测STAT3基因不同水平的表达情况，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）实验、流式细胞仪检测转染后细胞增殖及细胞周期的变化。结果成功构建pGenesil-1-shRNA—STAT3重组质粒，并成功转染T24及5637膀胱癌细胞；半定量RT-PCR、Western印迹检测结果显示，重组质粒实验组细胞的STAT3基因表达在RNA及蛋白水平上显著低于对照组（P〈0．05）；MTT实验、流式细胞仪检测结果显示，重组质粒实验组细胞的增殖明显受到抑制并出现凋亡现象。结论pGenesil-1-shRNA—STAT3转染T24及5637膀胱癌细胞后，可有效抑制STAT3的表达，并抑制膀胱癌细胞的生长及增殖。     

蛋白酶激活受体-2基因靶向shRNA表达质粒的构建及转染食管癌细胞致沉默效应的研究

目的:构建靶向蛋白酶激活受体-2(PAR-2)基因的shRNA表达质粒,建立PAR-2基因沉默的食管癌EC109稳定细胞株.方法:针对人PAR-2的mRNA序列,设计并体外合成编码shRNA的两条特异性寡核苷酸序列,分别插入pGFP-V-RS质粒中构建2个shRNA表达质粒(PAR-2 shRNA-1、PAR-2 shRNA-2),经过鉴定,然后将表达质粒转染至食管癌细胞EC109中,经嘌呤霉素筛选,获得稳定干扰的细胞株,运用RT-PCR和Western Blot检测PAR-2的表达.结果:PAR-2 shRNA-1转染人食管癌细胞EC109后,PAR-2基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建针对PAR-2基因的shRNA表达质粒,转染食管癌细胞EC109,能有效抑制该细胞株PAR-2基因的表达.     

RNA干扰survivin基因对人肝癌HepG2细胞增殖影响

目的探讨RNA干扰技术抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因3个不同靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-323/387/52,用Lipofectamine 2000脂质体介导转染法转染质粒,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。选择对survivin基因表达抑制作用最强的shRNA载体转染HepG2细胞后,免疫细胞化学法（ICC）检测HepG2细胞survivin蛋白的表达情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖情况。结果与对照组比较,构建的3个shRNA质粒中pshRNA-survivin-387转染组survivin mRNA水平下调,差异有显著性（F=18.64,q=4.293～4.925,P〈0.05）,而pshRNA-survivin-323/52质粒对survivin的表达及mRNA水平的影响差异无显著性（q=0.631～0.126,P〉0.05）。转染pshRNA-survivin-387质粒的HepG2细胞survivin蛋白表达较对照组明显下调（F=68.39,q=13.71、14.37,P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（F=20.06～47.65,q=11.186、12.601,P〈0.01）。结论构建的针对人survivin基因387位靶序列的shRNA表达载体pshRNA-sur-vivin-387可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞增殖。