实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒(流感)病毒的灵敏度与特异性.方法采用建立的实时荧光定量RT-PCR、RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离等3种方法,同时对流感监测点送检的60份疑似流感标本检测甲3型流感病毒.结果细胞病毒分离的阳性数为10份,RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR的阳性数分别为12份和15份.实时荧光定量RT-PCR的灵敏度达0.01TCID50且对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征冠状病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右.结论实时荧光定量RT-PCR由于检测在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断.     

实时荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

目的探讨实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测手足口病病毒核酸的应用价值。方法采集2009年5-8月奉贤区幼儿疑似肠道病毒感染者粪便和咽拭子标本,分别用实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对肠道病毒EV71、Coxsackie A16(CoXA16)病毒进行检测。结果在对38例疑似病例的粪便和咽拭子标本进行检测时,用实时荧光RT-PCR方法检测到EV71、CoXA16阳性标本为63份,阳性率为82.89%;而用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测到52份阳性标本,阳性率为68.42%。结论实时荧光RT-PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的。因此,该方法对肠道病毒的流行病学调查及控制起重要作用。     

应用荧光定量PCR技术检测肠道病毒71型

[目的]探讨实时荧光RT-PCR和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肠道病毒EV71病毒核酸的应用。[方法]采集2008年5月深圳市龙岗区幼儿疑似肠道病毒感染者粪便和疱疹液标本,分别用实时荧光RT-PCR方法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对肠道病毒EV71病毒进行检测。[结果]在对16例已收集到的患者的粪便、疱疹液标本进行检测时,用实时荧光RT-PCR方法检测到8份阳性样本,阳性率为50.O%(8/16),而用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测到5份阳性样本,阳性率为31.3%(5/16)。[结论]实时荧光RT-PCR技术具有特异性强,灵敏度高的特点,且能在采样后数小时内检测到病毒的RNA,从而达到快速诊断的目的,因此该方法对肠道病毒的流行病学调查及治疗起重要作用。     

用逆转录聚合酶链反应方法检测SARS冠状病毒

目的 应用双位点逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和改良巢式实时RT-PCR方法检测临床标本中SAILS冠状病毒(SAILS-CoV)核酸,以提高检测的可靠性和灵敏度。方法 对2003年杭州市3例严重急性呼吸综合征(SARS)临床确诊患者、4例疑似和27名医学观察者的咽拭子标本用巢式实时RT-PCR检测SAILS-CoV核酸,对阳性扩增产物进行核酸序列测定,同时对3例患者的标本应用半巢式RT-PCR检测另一位点SARS-CoV核酸片段,并应用常规实时RT-PCR技术及改良实时RT-PCR技术进行检测。结果 3例患者的巢式RT-PCR检测结果2例阳性,4例疑似和27名医学观察者均为阴性;阳性扩增产物的核酸序列与SAILS-CoV基因组相应部分序列完全一致。3例患者标本的另一位点的半巢式RT-PCR及实时RT-PCR结果均相同。在检测低拷贝数标本时,常规实时RT-PCR技术在约35个循环后出现弱阳性信号,但改良的巢式实时RT-PCR技术可使强阳性信号在10个扩增循环后出现。结论 双位点RT-PCR方法是提高检测准确性的有效方法,改良巢式实时RT-PCR技术较常规实时RT-PCR技术具有更高的灵敏度。     

手足口病患儿EV71的检测与其临床分析

目的了解仙居县2008年6月-2009年6月儿童手足口病病例不同标本中肠道病毒EV71和CoxA16的感染情况,为手足口病的治疗和预防控制提供依据。方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及实时荧光RT-PCR方法,对145例疑似手足口病的咽拭子、疱疹液及脑脊液标本进行手足口致病病毒进行检测,全部取咽拭子145份,49份同时取疱疹液,47份同时取脑脊液,进行EV、EV7I和CoxA16的检测,最后对重症病例的病毒核酸测序,并进行基因分型。结果 145份疑似样品中,39份为肠道通用病毒阳性,其中21份样品EV71阳性,6份样品CoxA16阳性;咽拭子、疱疹液、脑脊液的检出率分别为28.6%、28.6%、12.8%;3例重症病例均只检出肠道病毒EV71,阳性率为100.0%。结论采用咽拭子及其疱疹液标本检出率比较,差异无统计学意义,且阳性检出率高于脑脊液标本,仙居县肠道病毒夏季高发,感染以EV71和CoxA16为主,手足口病重症感染病毒为EV71的C4亚型。     

直接免疫荧光法与多重逆转录聚合酶链反应对呼吸道感染常见病毒的诊断价值

目的 探讨直接免疫荧光法(DFA)和多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对呼吸道常见病毒人鼻病毒(HRV)感染患者分泌物的检测,判断其临床诊断价值.方法 选取2010年2月-2011年12月收集的急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物210例,分别用DFA和RT-PCR进行检测,对两组测定方法的检测结果进行判定.结果 多重RT-PCR检出112份阳性标本,阳性率为53.33％,DFA检测出89份阳性标本,阳性率为42.38％,两组比较,差异有统计学意义(x2=27.623,P＜0.01).结论 DFA检测方法可以广泛适用于临床检测中;多重RTPCR检测方法的敏感性高,检测病毒的范围广,可以做亚型鉴定方法,适用于呼吸道病毒流行病学的调查研究.     

甲3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用

目的 建立适用甲3型流行性感冒(流感)病毒核酸检测的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法,为基层实验室流感快速诊断服务.方法 对甲3型流感病毒设计两对环介导特异性引物与一个环引物,采用环介导RT-LAMP技术对甲3型流感病毒核酸进行等温扩增,并对反应体系进行优化.结果 采用RT-LAMP技术检测甲3型流感病毒核酸,敏感度可达0.01TCID50/反应,与荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的敏感度相一致,且对H1和H5亚型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒与腺病毒无交叉反应,具有良好的特异性.采用该方法检测58份临床样本,病毒分离的阳性率为37.9%,而荧光定量RT-PCR与RT-LAMP的阳性率分别为53.45%和51.72%,敏感度明显高于通常的细胞病毒分离.结论 甲3型流感病毒环介导RT-LAMP检测方法,不仅快速特异、敏感性强,而且简便价廉,适于基层实验室使用.     

广州市自然界白纹伊蚊携带登革热病毒情况分析

目的通过对广州地区登革热媒介白纹伊蚊进行携带登革热病毒情况的调查，从传播媒介的角度探索该地区登革热流行的来源和特点。方法采集广州市各区新旧疫点附近的白纹伊蚊幼虫标本，饲养为成蚊后提取蚊虫总RNA，用登革热病毒特异引物经实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）进行病毒核酸检测，并对阳性结果反应产物进行序列测定。结果在荔湾区逢源街（2006年8月）、从化市邓村（2007年4月）和白云区云溪（2007年5月）各检出1宗登革热病毒核酸阳性蚊虫标本。其中荔湾区逢源街和从化邓村标本的RT—PCR产物经过序列测定证实为登革热病毒I型。结论广州地区登革热病毒可能在自然界白纹伊蚊种群中长期存在。     

2011-2013年成都地区腹泻患儿鼻病毒监测资料分析

目的了解2011-2013年成都地区腹泻患儿中鼻病毒(Human Rhinovirus,HRV)检出率、型别分布以及VP4/VP2基因特征。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对2011年1月-2013年12月从693例腹泻患儿病例粪便标本提取的病毒核酸进行HRV-5’NCR筛检,筛检阳性标本扩增HRV-VP4/VP2基因并对阳性扩增产物测序,通过序列的比对分析鉴定病毒型别及同源性。结果 693份腹泻患儿粪便标本中HRV核酸检出率为9.24%(64/693)。获得VP4/VP2有效序列31条,HRV-A型18例,HRV-B型4例,HRV-C型9例。结论成都地区腹泻患儿粪便样本中鼻病毒检出率较高,不同基因型均有检出并且以HRV-A亚型为主。     

70例手足口病病原检测和临床分析

目的 分析研究70例手足口病患者的临床一般情况及其致病原.方法 采集70例手足口病患者(其中5岁以下儿童患者60例)的咽拭子标本,提取病毒RNA.用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)一步法检测肠道病毒(EV)的5'-UTR区基因、肠道病毒71型(EV71)的Vp3～Vp1区基因、柯萨奇病毒A16(Cox-A16)的Vp3～Vp1区基因.结果 在70例手足口病患者中,咽拭子标本肠道病毒核酸阳性率为42.8%(30/70).在30例肠道病毒核酸阳性病原中,EV71占66.7%(20/30).5岁以下儿童有EV71肠道病毒、或Cox-A16病毒、或非EV71及非Cox-A16的其他肠道病毒感染病例.而5岁以上的儿童和成人患者则只有EV71肠道病毒感染病例.39例4 d内采集的咽拭子标本病原核酸阳性检测率平均为66.7%(26/39),31例5 d以后采集的标本病原核酸阳性检测率是12.9%(4/31),差异有统计学意义(x~2=20.4,P<0.01).结论 手足口病以0～5岁婴幼儿患病为主,但成人也可发病.用RT-PCR检测病原核酸阳性的手足口病患者以EV71为主,且以发病后4 d内阳性检测率高.     

TaqMan-MGB荧光定量逆转录聚合酶链反应快速检测甲型流感病毒

目的:建立一种特异、灵敏、快速检测甲型流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物软件在甲型流感病毒膜蛋白(MP)基因的保守区设计与筛选引物和MGB探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性和敏感性。并通过对疑似流感临床样本的检测,以评价该方法的实际应用价值。结果:该方法对甲型流感病毒的检测有高度的特异性、通用性,对乙型流感、麻疹、风疹、腮腺炎、RSV和腺病毒等其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右,且操作简便,重复性好。结论:本研究建立的MGB荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于甲型流感疫情的应急快速检测。     

实时荧光PCR和RT-PCR方法检测甲型流感病毒的比较

目的比较实时荧光PCR检测(FQ-PCR)与RT-PCR在鉴定甲型流感病毒中的优劣,建立能快速简便、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。方法对200份临床采集的咽拭子样本进行FQ-PCR与RT-PCR检测,综合比较2种监测方法之间的差异。结果 FQ-PCR检测200份临床咽拭标本,96份甲型阳性,阳性率为48.0%;从RNA提取到检测结果仅需3～3.5 h。RT-PCR检测200份临床咽拭标本,69份阳性,阳性率为34.5%;从RNA提取到检测结果约需8 h。结论 FQ-PCR方法快速、特异、灵敏,在甲型流感病毒检测中具有较大的应用价值。     

荧光定量RT-PCR快速检测N_2亚型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立快速检测甲型流感病毒N2亚型的方法。方法根据N2亚型流感病毒HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,利用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系后,采用十倍稀释法检验建立体系的灵敏度并建立相对定量标准曲线;采用N1亚型毒株核酸进行方法特异性检验并对临床疑似流感样病例样本进行检测。结果N2亚型流感病毒的检测灵敏度为2.56×10-6,扩增效率为99.9%,标准曲线r=0.997,特异性为100%。临床ILI样本检测结果与HAI鉴定结果相符。结论本研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以快速、准确的检测N2亚型流感病毒。     

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M2基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用十倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线并与普通RT-PCR法进行比较;特异性检验后进行临床标本的检验。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2·56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0·999,扩增效率为108·5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。     

病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒71型比较

评价病毒分离培养、RT-PCR及实时荧光RT-PCR法对于肠道病毒7l型的检测效果。方法分别用疖毒分离培养、RT-PCR、实时荧光RT-PCR方法对2009年龙岩市手足口病哨点监测医院送检的153份手足口病患者咽捌子样本进行EV71检测，并对检测结果进行配对卡方检验。结果3种方法总体符合率为81．0％，3种检测方法对样本呻EV71阳性检出率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法均适用于EV71的检测，可以作为EV71的日常临床诊断方法。     

肇庆市某幼儿园Norwalk样病毒性胃肠炎爆发的流行病学调查研究

目的对肇庆市某幼儿园爆发Norwalk样病毒性胃肠炎进行调查和分析.方法应用流行病学方法调查疫情发生经过、分布特征、临床表现,并采集标本用酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来进行实验室病原学的检测.结果共发生病例73例,主要临床表现发热、呕吐、腹痛、腹泻,病程一般2～3 d.在采集的10份粪便标本中,8份RT-PCR结果为Norwalk样病毒阳性,ELISA Norwalk病毒抗原阳性5份.通过加强宣传教育、环境消毒和个人卫生等综合处理措施,疫情得到有效控制.结论本次疫情是因感染Norwalk样病毒而引起的群体性急性胃肠炎爆发.     

肠道病毒VP1基因定型巢式RT-PCR反应体系建立及评价

目的建立一种快速、灵敏、特异的肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法。方法根据Gen Bank发表的肠道病毒全基因组序列,收集国内外文献,将文献中用于测序分型的引物进行总结分析,在其VP1区设计并合成巢式RT-PCR引物,优化PCR反应条件,建立检测肠道病毒基因分型的巢式RT-PCR方法。将200株肠道病毒通用阳性,EV71、CA16阴性的临床标本及阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒用该方法进行巢式RT-PCR扩增,随机选择30例PCR产物进行测序,明确本区肠道病毒流行基因型。结果 200份临床病例样本巢式RT-PCR扩增,124例有准确PCR扩增条带,阳性率为62%;阴性对照、EB病毒、登革热病毒、流感病毒、腺病毒均未扩增出条带;23例测序成功,7例比对失败,其中检出16份CA6阳性,阳性率为69.5%,6份CA12阳性,阳性率为26.1%,1份CA10阳性,阳性率为4.3%。结论肠道病毒VP1基因分型巢式RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异度;本院就诊患儿肠道病毒基因型主要以CA6和CA12型为主。     

应用RT-PCR方法检测人与动物的SARS冠状病毒

目的选择合适的RTPCR检测方法应用于人和与人类生活密切相关的多种野生、圈养和市售动物携带SARS样冠状病毒的检测,探索SARS样病毒的来源。方法收集深圳SARS临床诊断病例、疑似及观察病例咽漱液标本共350份,分别用TaqMan和分子信标荧光RTPCR法进行检测;收集386只动物的咽肛拭子样本及病毒分离培养物共442份样品进行了TaqMan荧光RTPCR和普通RTPCR法的检测。结果41例临床确诊病例荧光RTPCR法检出10份阳性,阳性率24.39%,TaqMan法和分子信标法检出结果8份符合(符合率88.89%)。对动物样本病毒分离培养物细胞病变样本18份进行检测,检出16份阳性,其中14份(87.5%)样本来源为果子狸。深圳东门市场及广东周边地区市场及养殖场动物样本检测结果:果子狸、貉及獾类动物总的阳性率为39.02%,而其它动物的阳性率为0,两者间差异具有显著性(P<0.01);对东门市场109只主要野生动物咽肛拭子样本进行PCR检测,阳性率44.04%,而145只野外的野生动物阳性率仅为0(P<0.01)。结论TaqMan法和分子信标法均可用于SARS检测;动物中尤其是果子狸等野生动物可能携带有SARS冠状病毒。     

RT-PCR方法检测单核细胞增生李斯特活菌研究

目的:建立单核细胞增生李斯特活菌快速检测技术,解决PCR带来的假阳性问题。方法:采用以mRNA为基础的RT-PCR方法对单核细胞增生李斯特氏菌的hlyA基因进行检测,设计引物,扩增,并作了特异性和灵敏度比较。结果:该引物能较好地扩增单核细胞增生李斯特菌的特异性片断,而对其它的李斯特菌以及常见食源性致病菌无特异性扩增条带;检测的灵敏度纯菌可达到1×104cfu/m l,人工污染样品猪肉、虾肉和牛奶等培养12~16 h,可达4.5 cfu/m l(g)。结论:可以应用该方法对样品中单核细胞增生李斯特活菌进行检测,能较好地解决PCR检测所带来的假阳性问题。