microRNA抑制鼻咽癌hTERT基因表达的实验研究

目的观察microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞hTERT基因表达的调控效应，探讨microRNA在鼻咽癌基因治疗的应用前景。方法构建靶向hTERT基因的microRNA表达质粒，脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞，RT-PCR检测转染细胞中hTERT基因的mRNA水平，Western Blotting观察microRNA对hTERT蛋白表达水平的调控效应，CCK-8比色法检测microRNA对细胞生长的抑制作用，流式细胞学检测miRNA诱导细胞凋亡的作用。结果在mcroiRNA表达质粒转染CNE-2细胞后，hTERT的mRNA表达水平下调，蛋白表达水平降低，细胞周期在G0～G1期受阻，并诱导细胞凋亡。结论microRNA可在鼻咽癌中有效下调hTERT基因的表达水平，抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡，为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础。     

利用RNA干扰效应阻抑鼻咽癌细胞bcl-xL基因表达和诱导癌细胞凋亡的研究

目的研究RNA干扰(RNA interference)效应对人鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE-2Zbcl-xL基因表达的抑制作用及其对CNE-2Z细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用。方法使用美国Ambion公司提供的网上设计软件设计针对人bcl—xL基因的小干扰RNA(siRNA)序列，体外转录试剂盒合成siRNA；荧光素标记试剂盒标记siRNA；脂质体法将siRNA转入CNE-2Z细胞株。荧光显微镜下观察siRNA的转染效率；RT—PCR法半定量检测siRNA对bcl—xL基因表达的抑制作用；噻唑蓝法检测siRNA对细胞生长增殖抑制作用；流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见到细胞内清晰的绿色荧光，而在未转染siRNA对照组未见；各siRNA转染组bcl—xL mRNA表达水平有不同程度的下调，下调范围在10％～70％之间，而在未转染对照组内bcl—xLmRNA表达水平无明显改变；细胞生长增殖抑制率在一定范围内具有剂量依赖性(剂量增加，抑制率增高)和时间依赖性；各浓度siRNA4转染组可不同程度诱导CNE-2Z细胞凋亡。结论体外转录合成的siRNA能特异有效地下调bcl—xL基因的表达，不同序列特异性的siRNA下调bcl—xL基因表达的能力不同；瞬时转染bcl—xLsiRNA4能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡；siRNA不仅为基因组功能分析提供了强有力的工具，而且为抗鼻咽癌基因治疗提供了新的思路。     

pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建靶向人ABCG2基因的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒,运用RNA干扰下调ABCG2基因在鼻咽癌细胞系CNE-2中的表达,并筛选出其基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法:针对ABCG2基因的mRNA序列设计3个干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,用real-time PCR和Western blot检测ABCG2基因在mRNA和蛋白水平的抑制效果.结果:经测序证实,成功构建pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒.重组质粒转染CNE-2细胞后,ABCG2基因的mRNA水平及蛋白表达水平明显下调,其中以1号重组质粒效应最强,mRNA水平下调75%,蛋白水平下调68%.结论:成功构建以人ABCG2为靶向的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2的重组质粒.其对鼻咽癌CNE-2细胞中ABCG2的表达具有显著抑制效应,为进一步研究ABCG2在CNE-2细胞中的功能和鼻咽癌的基因治疗奠定了基础.     

microRNA抑制鼻咽癌VEGF基因表达的实验研究

目的:观察人工构建的microRNA对鼻咽癌CNE-2细胞VEGF基因表达的调控效应,探讨microR-NA在鼻咽癌基因治疗中的应用前景.方法:构建靶向VEGF基因的microRNA表达质粒,脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,RT-PCR检测转染细胞中VEGF基冈的mRNA水平,Western Blotting法观察microRNA对VEGF蛋白表达水平的调控效应,CCK-8比色法检测靶向VEGF的人工构建microRNA对鼻咽癌细胞生长的抑制作用,皮下注射稳定转染microRNA质粒的CNE-2细胞,构建裸鼠移植瘤模型,观察肿瘤牛长情况.结果:在mi-croRNA表达质粒转染CNE-2细胞后,VEGF的mRNA表达水平下调,蛋白表达水平降低,但是光镜和荧光显微镜下的初步观察显示CNE-2细胞牛长未发生变化,以CCK-8比色法检测的细胞增殖抑制率也无明显改变,而在初步的裸鼠移植瘤实验中,发现调控VEGF表达的microRNA重组质粒能有效抑制肿瘤生长.结论:人工构建表达microRNA的质粒,可在鼻咽癌CNE-2细胞中有效F调VEGF基因的表达水平,抑制裸鼠移植瘤的生长,为鼻咽癌基因治疗研究奠定了一定的基础.     

RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的实验研究

目的 应用RNA干扰技术构建一个载体同时编码四个基因,即血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶的短发夹重组质粒,并与单基因质粒做对比,通过体内外实验,研究其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶并含荧光素标记的短发夹RNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶的质粒,分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞及瘤体内的转染及表达情况.四甲基偶氮噻唑蓝法检测细胞增殖活性,实时PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果,Trans well侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变,流式细胞仪观察各组凋亡率,体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果.结果 多基因干扰质粒转染鼻咽癌细胞后,CNE-2Z细胞增殖受到明显抑制,体外侵袭能力显著下降(P值均＜0.05).实时PCR证实多基因组4个不同基因mRNA表达均降低,免疫印迹技术验证目的基因蛋白同时表达下调.流式细胞仪结果证明多基因凋亡率明显高于单基因组(P值均＜0.05).体内抑瘤实验表明,与阴性组和空白组相比,P-1组移植瘤生长明显受到抑制(P＜0.05),并且多基因质粒抑制肿瘤细胞增长的作用要强于单基因干扰质粒(户值均＜0.05).结论 同时干扰多个基因能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌基因治疗奠定了良好的实验基础.     

RNA干扰DJ-1基因抑制喉癌细胞的增殖

目的 探讨RNA干扰(RNAi)抑制喉癌Hep-2细胞DJ-1基因的表达及观察其细胞效应.方法 设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染Hep-2细胞,实验分为4组:瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA1、siRNA2、siRNA3).采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白,流式细胞仪检测细胞凋亡及四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测特异性siRNA1组对Hep-2细胞效应.结果 本实验设计合成的3对特异性siRNA均不同程度地抑制DJ-1基因表达,其中特异性siRNA1组抑制效果最佳.M1Tr比色法结果显示特异性siRNAl组(终浓度50 nmo~L、100 nmolZL)对Hep-2细胞增殖具有抑制作用.流式细胞仪检测结果最示特异性siRNA1组能诱导Hep-2细胞凋亡,转染特异性siRNA1组凋亡率为(15.7±4.8)%,非特异性siRNA对照组凋亡率为(4.5±0.4)%,非特异性siRNA对照组与特异性siRNA1组凋亡率比较差异有统计学意义(t=4.736,P<0.01).结论 转染特异性siRNA组能有效抑制Hep-2细胞增殖,诱导Hep-2细胞凋亡.     

多基因共沉默对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤影响的研究

目的 应用基因克隆技术构建一个载体同时编码四个不同基因的真核表达质粒,并与单基因质粒作对比,通过裸鼠成瘤实验研究其对体内鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶(hTERT)并含荧光素标记的短发夹RNA质粒(命名为P-1),并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin 和hTERT的质粒(分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5),建立人鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞株裸鼠皮下接种模型,分别将其转染于荷瘤裸鼠瘤体内,以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的转染及表达情况.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果.脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测各组移植瘤细胞凋亡率.结果 所有裸鼠均接种成功,l周左右可见皮下肿瘤形成,并随时间延长不断增大.各质粒组载体转入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达,而空白对照组未见绿色表达荧光.肿瘤体积生长曲线表明,单基因组和多基因组肿瘤生长明显受到抑制,以多基因组肿瘤体积抑制最为明显.肿瘤抑制率在Pl～5组分别为82.4%、46.2%、48.5%、51.9%和46.8%.RT-PCR和免疫印迹法在体内实验证实单基因质粒组主要引起单个基因mRNA和蛋白的表达下降,而多基因质粒组可以同时下调四个不同基因mRNA和蛋白的表达,TUNEL实验表明多基因质粒能更有效地促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤的生长.结论 多基因共沉默对鼻咽癌基因治疗有着潜在的应用前景,同时阻断多个基因可能是恶性肿瘤基因治疗的一个希望所在.     

自杀基因载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用的研究

目的检测pcDNA3.1-Egr-CD（简写为pEC）、pcDNA3.1-hTERT-Survivin（简写为pTS）、pcDNA 3.1-Egr-CD-hTERT-Survivin（简写为pEC-TS）真核表达载体对体外鼻咽癌细胞杀伤作用。方法 pEC、pTS、pEC-TS真核表达载体分别转染CNE-2细胞,在放射线照射后用RT-PCR检测和比较胞嘧啶脱胺酶（CD）、Survivin基因的表达,并通过高效液相色谱（HPLC）检测前体药物5-FC转化成5-FU转化效率。结果检测发现用pEC、pEC-TS转染的CNE-2细胞中CD有效表达,HPLC检测前体药物5-FC转化成5-FU;pTS、pEC-TS转染的CNE-2细胞中Survivin基因表达明显降低。结论在CNE-2细胞转染pEC-TS载体后,CD基因能将5-FC转化成5-FU,并通过hTERT启动子特异性降低Survivin基因的表达,有效的提高了CNE-2肿瘤细胞对5-FU的敏感性;为鼻咽癌基因治疗提供了一种新的思路。     

小干扰RNA对喉鳞状细胞癌裸鼠移植瘤增殖细胞核抗原及p53蛋白表达的影响

目的：应用小干扰RNA（siRNA）技术抑制裸鼠喉癌皮下移植瘤人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨移植瘤中增殖细胞核抗原（PCNA）及p53蛋白表达的变化。方法：根据hTERT cDNA序列构建表达短发夹RNA（shRNA）的、靶向hTERT mRNA的真核表达质粒pshRNA,其载体质粒含荧光素报告基因。建立人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株裸鼠皮下接种模型,将pshRNA转染入荷瘤裸鼠瘤体内,观察肿瘤生长情况。以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的表达;以免疫组织化学SP法检测PCNA及p53蛋白在肿瘤内的表达。结果：所有裸鼠均接种成功,5d后可见皮下肿瘤形成,14d左右肿瘤直径达5～7mm。pshRNA及空质粒载体转染入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达。病理学检查发现：pshRNA组肿瘤生长受到抑制,细胞分裂少见,可见大量癌细胞坏死。与注射生理盐水的对照组比较,转染质粒完毕后7d抑瘤率为76．50％,P〈0．01。pshRNA治疗后瘤体内PCNA蛋白表达显著下调（P〈0．05）,p53蛋白表达显著上调（P〈0．05）。结论：靶向hTERT mRNA的shRNA可显著抑制人喉癌裸鼠移植瘤的生长,其机制可能是诱导PCNA下调,促进p53蛋白表达所致。     

叶酸受体1在鼻咽癌细胞抵抗紫杉醇化疗药物中的作用

目的 研究叶酸受体1(folate receptor 1,FOLR1)在鼻咽癌细胞和永生化正常鼻咽细胞(NP69)中表达的差异,及FOLR1的表达与鼻咽癌紫杉醇耐药的相关性,为FOLR1介导的肿瘤靶向治疗及耐药逆转提供实验依据.方法 利用基因芯片技术,反转录聚合酶链反应(RT-PCR),Western blot和免疫细胞化学技术检测FOLR1在永生化正常鼻咽细胞(NP69),鼻咽癌细胞系(CNE-1)及紫杉醇耐药细胞系(CNE-1/Taxol)中表达的差异;利用小干扰RNA(siRNA)技术抑制CNE-1/Taxol中FOLR1的表达后,观察其耐药能否逆转.结果 基因芯片结果 显示CNE-1/Taxol中FOLR1的表达为2636.0,CNE-1的表达为176.0;RT-PCR和Western blot结果 显示FOLR1在NP69中无表达,而在CNE-1及CNE-1/Taxol中呈阳性表达,并且与耐药指数呈正相关(r2=0.8719);免疫细胞化学结果 也证实了FOLR1在鼻咽癌CNE-1/Taxol中高表达;利用siRNA技术抑制CNE-1/Taxol中FOLR1的表达后,耐药细胞对紫杉醇的敏感性显著增加,其IC50值降低了59.6%(t=6.92,P<0.001).结论 实验结果 提示FOLR1的表达与鼻咽癌发生及紫杉醇耐药密切相关.FOLR1基因将可能成为鼻咽癌治疗及紫杉醇耐约逆转的靶分子之一.     

肿瘤靶向性人可溶性TRAIL载体的构建及其在鼻咽癌细胞株CNE-2的表达

目的克隆人可溶性TRAIL(sTRAIL)基因并构建肿瘤细胞特异性真核表达载体,为鼻咽癌基因治疗的靶向性奠定实验基础。方法提取人外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区的融合基因,克隆入真核表达载体pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建可分泌表达TRAIL基因的真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。用Western blot鉴定鼻咽癌细胞株CNE-2中表达产物。结果RT-PCR扩增得到了613 bp的cDNA片断。经酶切及测序鉴定,与GenBank中报道的IL-2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了肿瘤特异性高效分泌表达可溶性人TRAIL的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。Western blot结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在鼻咽癌CNE-2肿瘤细胞中能有效表达。结论重组真核表达载体pGL3/TRAIL的成功构建,为鼻咽癌基因治疗的靶向性提供了可能性。     

Wnt/β-catenin信号通路调控下游基因CD44对鼻咽癌侧群细胞的作用和意义

目的：探讨Wnt/β-catenin信号通路调控下游基因CD44对鼻咽癌SP细胞的作用和意义。方法通过流式细胞仪从鼻咽癌细胞株CNE-2中分选出SP及CD44+SP细胞并鉴定,用siRNA阻断Wnt/β-catenin 信号通路,了解CNE-2及CD44+SP细胞在体外的数量及生物学特性改变情况。结果流式细胞仪检测SP细胞在CNE-2细胞中表达率为2.3%,其中36.5%的SP细胞表面表达膜抗原CD44。CD44+SP细胞的体外增殖能力及对化疗药物的耐受性显著高于其他细胞,分别比较β-Catenin siRNA转染前后的CNE-2及CD44+SP细胞,其细胞增殖能力、克隆能力及对化疗药物的耐受能力均具有统计学差异。结论 Wnt/β-catenin信号通路的异常与鼻咽癌CD44+SP细胞的生物学意义密切相关,干扰此通路可以改变肿瘤干细胞特性。