HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCV NS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp),作为核心酶在HCV复制中起关键作用.NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础.     

HCVNS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）,作为核心酶在HCV复制中起关键作用。NS5B结构和功能的研究,有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识,同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础。     

丙肝病毒NS5A蛋白对NS5B的RdRP活性影响的研究

丙型肝炎病毒 (Hepatitis C virus,HCV )非结构蛋白 (Nonstructural,NS) 5 A在 HCV基因组复制中的作用目前尚不清楚。本文研究 His- NS5 A对 NS5 B的 RNA依赖性 RNA酶 (Rd RP)活性的影响 ,以了解 NS5 A在HCV RNA复制中的作用。采用变性 -复性方法 ,纯化大肠杆菌表达的重组组氨酸 NS5 A融合蛋白。 GST结合洗脱实验 (GST pull- down assay)研究 NS5 A和 NS5 B是否结合。以不同的摩尔浓度比 ,将纯化的 NS5 B和 NS5 A蛋白混合 ,检测 NS5 A对 NS5 B的 Rd RP活性的影响。获得高得率的纯化 His- NS5 A蛋白。重组 NS5 A蛋白可在体外与NS5 B结合并抑制后者的 Rd RP活性。本研究报道了纯化重组 His- NS5 A蛋白的变性 -复性方法 ,结果显示纯化的重组 NS5 A在体外可与 NS5 B相互结合 ,并明显抑制 NS5 B Rd RP活性。提示了 HCV NS5 A在病毒复制中的可能作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的研究进展

对丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的研究表明,NS5A在HCV转录,复制及细胞信号转导中有重要作用,NS5A影响干扰素（IFN）治疗丙型肝炎的疗效,但日本和欧洲对这方面的研究结果间存在差异,现就这方面的进展作一综述。     

pSG5／NS5A5B△C质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的:构建pSG5/NS5A5B△C质炷,并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达.方法:使用已经构建的pTM1-△C质粒,并检验其在NS2NS5A5B△C质粒为模板,根据pTM1、HCV NS5A5B△C、pSG5序列和酶切位点特点设计引物,PCR扩增得到HCVNS5ASB△C基因片段,将目的片段插入psG5载体中,经筛选阳性克隆、Sac Ⅰ和Bg/Ⅱ分别酶切鉴定后,用FuGene 6转染试剂转染入Huh7细胞.用免疫荧光染色、Western blot检测HCV NS5A5B△C在Huh-7细胞中的表达.结果:限制性内切酶Sac Ⅰ和BglⅡ分别酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小和插入方向均与预计一致.荧光显微镜下可见转染的Huh7细胞表达带有绿色荧光的HCV NS5A5B△C蛋白,该蛋白主要表达于细胞质,表达率达40%以上.Western blot结果也证实在转染pSG5/NS5A5B△C的Huh7细胞中出现了大小与HCV NS5A5B△C(82 ku)一致的条带.结论:成功构建了pSGS/NS5A5B△C质粒,并在Huh7细胞中成功瞬时表达,为进一步研究HCV蛋白的功能奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成,具有线氨酸蛋白酶和三磷酸核苷酶（NTPase）和螺旋酶（Helicase）的功能,在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥重要作用。非结构蛋白NS3具有较强的免疫原性和抗原性,是检测HCV感染的主要抗原之一。近年的研究发现NS3内部的裂解产物更具有致癌潜能。此外,NS53蛋白还参与NS5A的超磷酸化修饰过程等。     

HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的：利用原核表达载体pBVIL1，表达丙型肝炎病毒非结构蛋白（NS3）丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A—B小分子，为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法：将PCR合成的NS5A—B（2412—2427aa）基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1，融合表达NS5A—B片段．包涵体形式的表达产物用8mol／L脲溶解后，采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS—PAGE、Western blot和ELISA方法，于37℃酶催化条件下，分析NS5A—B底物的降解活性。结果：（1）构建了pBVIL1／NS5A—B重组质粒，鉴定证明NS5A—B基因片段正确地插入表达载体上：融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0．73g／L。（2）在NS3蛋白酶作用不同时间后，用SDS—PAGE和Western blot证实，底物带可被明显降解，ELISA分析也证明，NS5A—B具有酶底物活性。结论：含有酶切位点的NS5A—B融合蛋白可被NS3丝氦酸蛋白酶有效地降解，可用作为NS3蛋白酶的底物，可替代全长NS5A—B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究     

HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析

目的 制备针对丙型肝炎病毒（HCV）非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体（MAb）,并分析获得的单抗识别表位所在区域,为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法 用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原,采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠,按常规杂交瘤细胞的制备方法,经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westem blot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶（NS3蛋白的N末端1／3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3p、NS3解旋酶（NS3蛋白的C末端2/3）编码基因的真核表达质粒pcDNA3．1（-）-ns3A,将其瞬时转染COS-7细胞后,以获得的单克隆抗体作为一抗,通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果 获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体,这2株MAbs均特异识别NS3蛋白,并确定了它们的结合区域。结论 获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体,并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析,为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4B研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白4B（NS4B）是至今为止功能尚不明确的HCV非结构蛋白，近年来的研究表明其定位于内质网膜，与细胞内膜结构的功能有关，在体外实验中。它和NS4A一起可以抑制宿主细胞的翻译；在一定程度上可以减弱机体对抗病毒药物干扰素-α（INF-α）的反应，同时使病毒可以逃避宿主对病毒的免疫；在HCV病毒的致瘤性方面亦有重要作用。可以与NS3，NS4A，NS5A，NS5B等相互作用。对其它非结构蛋白的功能起协同，促进甚或是下调作用。     

抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 研制抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3的人源噬菌体单链抗体,并探讨其在临床诊断中的应用价值。方法 以重组的丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3为固相抗原,利用亲和筛选的原理,从噬菌体抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ELISA）、斑点免疫杂交试验和DNA序列分析,获得HCV NS3的人源单链抗体;用该抗体与不同来源的HCV NS3抗原进行反应;对10例石蜡包埋的丙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,所制备的HCV NS3人源单链抗体能与不同来源的HCV NS3抗原特异性结合（吸光度A值为1.38）;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别丙型肝炎患者肝组织HCV NS3抗原,与正常肝组织及乙型肝炎病毒（HBV)的表面抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好,特异性强,且制备方法简便,周期短,可用于HCV NS3病原的检测。     

慢性HCV感染者中分离的不同长度3′UTR-PolyU/UC段对IRES介导的翻译及NS5B合成RNA影响

目的　研究丙型肝炎病毒 3′非编码区 (3′UTR)及不同长度PolyU UC段对内在核糖体进入位点 (IRES)介导翻译的影响以及对NS5B聚合酶合成RNA的影响。方法　通过构建含有HCVIRES、荧光素酶 (fireflyluciferase)报道基因和内含不同长度PolyU UC区的 3′UTR序列的系列重组质粒 ,采用体外翻译和细胞转染等方法检测报道基因表达的水平。结果　体外翻译实验和细胞转染实验显示 3′UTR对IRES介导的翻译具有增强作用 ,在体外翻译体系中这种增强作用与PolyU UC区的长度相关 ,而在细胞中则与PolyU UC区的长度无明显相关性 ;3′UTR对共转染的重组NS5B质粒的复制活性具有抑制作用 ,这种抑制作用也与PolyU UC区长度不成正比。结论　HCV 3′UTR与蛋白翻译及RNA合成有关 ,在细胞中并不与PolyU UC区的长度相关。     

HCV非结构蛋白NS5A人源单链可变区抗体基因的筛选与鉴定

目的 筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS5A的人源单链可变区抗体（ScFv)的编码基因,为HCV NS5A蛋白质生物学功能的研究及抗HCV的基因治疗研究开辟新途径。方法 采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的HCV非结构蛋白NS5A为固相抗原,从噬菌体单链可变区抗体半合成库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得抗原结合活性和特异性较强的HCVNS5A人源单链可变区抗体基因片段的阳性克隆,并对其进行免疫检测及序列测定,结果 筛选得到的ScFv片段基因核苷酸序列为789nt,编码由262个氨基酸残基组成的多肽,具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点,基因编码产物具有HCV NS5A蛋白反应的免疫学活性和特异性。结论 利用噬菌体抗体库技术,成功获得了HCV NS5A人单链可变区抗本ScFv编码基因,并获得了可溶性单链抗体的表达。